玉簪多糖對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用機(jī)制

吳金姍，黃 榕，劉樹(shù)英，劉回民,*，劉洪章,*，劉景圣

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130118）

氧化應(yīng)激是指機(jī)體內(nèi)氧化失衡的狀態(tài)，亦是肝損傷發(fā)生的主要誘因。氧化應(yīng)激現(xiàn)象發(fā)生時(shí)，產(chǎn)生過(guò)量的氧自由基會(huì)對(duì)細(xì)胞造成破壞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激損傷。研究表明，活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧正常代謝過(guò)程中的產(chǎn)物，也是誘發(fā)氧化應(yīng)激的重要物質(zhì)，過(guò)多的ROS能夠影響基因組的穩(wěn)定性，導(dǎo)致多種慢性疾病發(fā)生。肝臟疾病發(fā)生時(shí)，患者體內(nèi)抗氧化狀態(tài)失衡，抗氧化酶的表達(dá)量減少，ROS水平增高。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）/核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）是機(jī)體內(nèi)的抗氧化信號(hào)通路，能夠誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，降低機(jī)體ROS水平，因此，調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路能夠減輕氧化應(yīng)激損傷。

研究證明植物多糖具有良好的抗氧化能力。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，山藥多糖、山茱萸籽多糖、百合籽多糖和黃精多糖具有較強(qiáng)的自由基清除活性；體內(nèi)抗氧化機(jī)制研究表明，竹蓀多糖能夠改善高脂乳糜誘導(dǎo)的肥胖小鼠肝臟氧化應(yīng)激水平并緩解肥胖相關(guān)性肝腎代謝損傷，黑木耳渣多糖能通過(guò)提高體內(nèi)抗氧化酶活性、降低脂質(zhì)含量起到抗氧化和降脂保肝的作用。相比于合成類抗氧化劑的毒副作用和不穩(wěn)定性，植物多糖不僅毒副作用小，還具有較強(qiáng)的抗氧化能力，因此，近年來(lái)植物多糖的生理活性受到廣泛關(guān)注。

紫萼玉簪又名紫花玉簪，為百合科（Liliacea）玉簪屬（）多年生宿根草本植物，其全草或根均可入藥，具有可食用性。目前已有研究證實(shí)玉簪中黃酮、皂苷和多糖等成分具有一定的抗炎抑菌活性，但鮮有關(guān)于紫萼玉簪根系多糖（root polysaccharide，HVRP）的抗氧化機(jī)制研究。本實(shí)驗(yàn)旨在探尋HVRP對(duì)叔丁基過(guò)氧化氫（-butyl hydroperoxide，-BHP）誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的影響，在細(xì)胞水平解析HVRP的抗氧化作用機(jī)制，為HVRP在功能性食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫萼玉簪根系于2017年8月采于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)；HepG2細(xì)胞（肝癌細(xì)胞） 美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)。

-BHP 美國(guó)Sigma公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT）北京博奧拓達(dá)科技有限公司；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 以色列BI公司；DMEM培養(yǎng)基、TRIzol試劑 美國(guó)Thermo公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、羥自由基清除能力檢測(cè)試劑盒、超氧陰離子自由基清除能力檢測(cè)試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；-乙酰半胱甘酸（-acetyl--cysteine，NAC）、ROS試劑盒、還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒 上海碧云天生物技術(shù)有限公司；PrimeScriptRT-PCR試劑盒 日本TaKaRa公司；Nrf2、NAD(P)H∶醌氧化還原酶1（NAD(P)H∶quinone oxidoreductase 1，NQO1）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）、磷酸化JNK（phosphorylation JNK，p-JNK）、-actin、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG（H+L）抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；溴化鉀（KBr）（色譜純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

FTIR-8400S傅里葉變換紅外光譜儀 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱 日本Sanyo公司；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Thermo公司；全自動(dòng)酶標(biāo)儀德國(guó)BGM LABTECH公司；Mx3000p實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀美國(guó)Agilent公司；ImageQuant LAS 500生物分子成像儀美國(guó)GE Healthcare公司。

1.3 方法

1.3.1 HVRP的提取

取洗凈的紫萼玉簪根系，用粉粹機(jī)粉碎，過(guò)60 目篩，采用索氏抽提法脫脂，自然晾干，按一定料液比置于熱水中浸提一段時(shí)間，抽濾后合并濾液濃縮，用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液醇沉，隨后冷凍干燥醇沉樣品。采用三氯乙酸法稍加修改脫除蛋白，即取醇沉后凍干多糖加適量水溶解，加入等體積的質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%三氯乙酸溶液混合，80 ℃水浴36 min，經(jīng)透析、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并冷凍干燥得到淺棕色多糖，即為HVRP。

1.3.2 HVRP提取率測(cè)定

以葡萄糖作為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖的質(zhì)量濃度，根據(jù)公式（1）計(jì)算提取率。

式中：為多糖質(zhì)量濃度/（mg/mL）；為樣品液稀釋倍數(shù)；為樣品液體積/mL；為樣品質(zhì)量/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

采用傳統(tǒng)水提法提取HVRP，提取率主要影響因素有料液比、提取時(shí)間和提取溫度，將上述因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)。設(shè)定料液比1∶30、提取時(shí)間2 h、提取溫度80 ℃為單因素試驗(yàn)中的常規(guī)量。以料液比（1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60）、提取時(shí)間（1、2、3、4、5 h）和提取溫度（60、70、80、90、100 ℃）3 個(gè)因素變量替換試驗(yàn)中的常規(guī)量。按照1.3.1節(jié)方法提取HVRP，分別分析料液比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)多糖提取率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取提取溫度（）、提取時(shí)間（）、料液比（）3 個(gè)因素，以HVRP提取率作為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)變量的因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平Table 1 Codes and levels of independent variables used for response surface desgin

1.3.5 理化指標(biāo)測(cè)定

采用二硝基水楊酸法測(cè)定HVRP還原糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)，回歸方程為＝0.001-0.044 8，＝0.994 6。采用硫酸-間羥聯(lián)苯法測(cè)定HVRP糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)，回歸方程為＝0.018+0.007，＝0.995 4。采用考馬斯亮藍(lán)法對(duì)HVRP蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測(cè)定，回歸方程為＝0.007 1+0.027，＝0.995 1。

1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析

將干燥的HVRP樣品與KBr混合研磨后壓片，用傅里葉變換紅外光譜儀進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，掃描范圍400～4 000 cm，分辨率為2 cm，分析HVRP的有機(jī)官能團(tuán)。

1.3.7 剛果紅染色實(shí)驗(yàn)

取100 μL（1 mg/mL）HVRP溶液與100 μL利用不同濃度NaOH溶液溶解的剛果紅溶液（80 μmol/L）混合加入96 孔板中，在200～700 nm范圍內(nèi)，利用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)掃描測(cè)定溶液的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.8 抗氧化活性的測(cè)定

參照相應(yīng)試劑盒說(shuō)明書測(cè)定并計(jì)算HVRP對(duì)DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基的清除率。

1.3.9 HVRP對(duì)-BHP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用分析

1.3.9.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組

HepG2細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基（含10% FBS+1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基）中，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，定期更換培養(yǎng)基，至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，調(diào)整濃度至1×10個(gè)/mL，以每孔2 mL接種于6 孔板，實(shí)驗(yàn)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組和5、25、100 μg/mL HVRP組（即HV5、HV25、HV100組）。正常組常規(guī)培養(yǎng)；模型組加入終濃度為220 μmol/L的-BHP溶液培養(yǎng)細(xì)胞2 h，建立氧化損傷模型；陽(yáng)性對(duì)照組和HVRP組先分別使用含100 μg/mL NAC和5、25、100 μg/mL HVRP的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，再用含終濃度220 μmol/L-BHP的培養(yǎng)液刺激細(xì)胞2 h。

1.3.9.2 MTT法測(cè)定HepG2細(xì)胞存活率

HVRP對(duì)細(xì)胞存活率的影響分析：將HVRP分別稀釋至0（空白組）、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL。調(diào)整HepG2細(xì)胞懸液濃度至1×10個(gè)/mL，以每孔100 μL接種于96 孔板，在37 ℃、5% CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。每孔再加入100 μL不同質(zhì)量濃度的HVRP溶液，培養(yǎng)48 h后，進(jìn)行MTT染色，測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處吸光度。按式（2）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。以細(xì)胞相對(duì)存活率表征細(xì)胞活力。

式中：為空白組吸光度平均值；為給藥組吸光度平均值。

-BHP對(duì)細(xì)胞存活率的影響分析：按上述方法處理HepG2細(xì)胞，每孔加入100 μL不同濃度（0、100、200、300、400、500、600 μmol/L）的-BHP溶液刺激細(xì)胞，培養(yǎng)2 h后測(cè)定570 nm波長(zhǎng)處的吸光度。按式（2）計(jì)算細(xì)胞相對(duì)存活率。

1.3.9.3 HepG2細(xì)胞中ROS水平及抗氧化酶活力的測(cè)定

參照試劑盒說(shuō)明書測(cè)定細(xì)胞上清液中ROS相對(duì)水平，MDA、GSH含量及CAT、SOD、GPx活力，除ROS水平外，以上指標(biāo)結(jié)果均以蛋白質(zhì)量計(jì)。

1.3.9.4 RNA提取與實(shí)時(shí)熒光定量PCR

用TRIzon試劑從HepG2細(xì)胞中提取總RNA，用PrimeScriptRT-PCR試劑盒合成cDNA，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)定量，分析HVRP對(duì)Keap1/Nrf2/ARE通路和HepG2細(xì)胞相關(guān)基因mRNA表達(dá)的影響。具體引物序列如表2所示?；蛳鄬?duì)表達(dá)量利用2法計(jì)算。

表2 引物序列Table 2 Primer sequences used in this study

1.3.9.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析

提取胞漿蛋白及核蛋白，用BCA蛋白濃度試劑盒定量，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。用含5% BSA的TBST緩沖液（三乙醇胺緩沖鹽水溶液（Tris buffered saline，TBS）+Tween 20）封閉過(guò)夜，室溫孵育一抗2 h，用TBST緩沖液清洗5 次，然后在室溫下孵育二抗2 h，用TBST緩沖液清洗5 次后滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（enhanced chemiluminesce，ECL）試劑，使用生物分子成像儀和ImageJ軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行灰度分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用Design-Expert V 10.0.7.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)處理。用GraphPad Prism 7.0軟件作圖，SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，多組間比較采用單因素方差分析，＜0.05表示差異顯著，＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

料液比、提取溫度和提取時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響如圖1所示，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，提取率達(dá)到最大；隨提取溫度的升高，提取率先增加后下降，80 ℃時(shí)提取率達(dá)到最大；隨提取時(shí)間延長(zhǎng)，提取率先增加后下降，在2 h時(shí)提取率最大。當(dāng)提取溫度超過(guò)80 ℃、時(shí)間超過(guò)2 h時(shí)，多糖受到持續(xù)高溫的影響會(huì)分解，從而導(dǎo)致提取率降低。

圖1 料液比（A）、提取溫度（B）、提取時(shí)間（C）對(duì)HVRP提取率的影響Fig. 1 Effects of material-to-solvent ratio (A), extraction temperature (B), and extraction time (C) on the extraction efficiency of HVRP

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)分析結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Experimental design and results for response surface analysis

根據(jù)表3的結(jié)果，利用Design-Expert軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程：＝24.44+1.21+0.46+0.55+1.35-2.77+0.78-3.15-0.55-2.12。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial model

2.2.2 最佳提取工藝的確定及驗(yàn)證

模型分析HVRP最佳提取工藝條件為提取溫度83.63 ℃、提取時(shí)間2.92 h、料液比1∶30.60，預(yù)測(cè)提取率24.9%。根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整工藝為提取溫度84 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶31，HVRP提取率為23.9%，誤差1%，表明該模型可行性較高。

2.3 HVRP理化性質(zhì)

經(jīng)脫脂、脫蛋白處理后HVRP提取率為9.29%。測(cè)得HVRP中還原性糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.17%（111.66 mg/g），蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%（5.96 mg/g），糖醛酸含量較高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12.31%（123.12 mg/g）。研究表明，利用咔唑法測(cè)定東北玉簪多糖中的糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20.36%～52.76%；百合多糖中糖醛酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)12.89%。

2.4 HVRP結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果

由圖2A可知，HVRP的紅外光譜在3 422 cm處有1 個(gè)強(qiáng)吸收峰，是由O—H伸縮振動(dòng)引起的；2 916 cm處吸收峰為C—H伸縮振動(dòng)；1 745、1 634、1 446 cm處吸收峰為C＝O對(duì)稱和不對(duì)稱拉伸振動(dòng)引起，表明HVRP中存在糖醛酸，與理化分析結(jié)果一致；1 088 cm處的吸收峰為吡喃環(huán)的醚鍵所引起，表明HVRP可能為吡喃糖；813、614 cm處的吸收峰表明其可能含有型糖。

如圖2B所示，隨著NaOH濃度增加，HVRP與剛果紅試劑作用后的最大吸收波長(zhǎng)不斷減小，較剛果紅未發(fā)生紅移，最大吸收波長(zhǎng)的連續(xù)下降可能是因?yàn)镠VRP在水溶液中為無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)象，且氫鍵不斷被堿性溶液破壞。由此判斷，HVRP不存在三螺旋構(gòu)象。

圖2 HVRP的傅里葉變換紅外光譜（A）和剛果紅實(shí)驗(yàn)結(jié)果（B）Fig. 2 Fourier transform infrared spectrum (A) and Conge test results (B) of HVRP

2.5 HVRP的體外抗氧化活性

由圖3可知，隨HVRP質(zhì)量濃度增大，其抗氧化活性先升高后趨于穩(wěn)定，呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，在HVRP質(zhì)量濃度為100 μg/mL時(shí)，DPPH自由基清除率為63.93%，羥自由基清除率為70.31%，超氧陰離子自由基清除率為83.45%。HVRP表現(xiàn)出較強(qiáng)的體外抗氧化能力，其抗氧化活性可能與HVRP中含有一定的糖醛酸有關(guān)。

圖3 HVRP對(duì)DPPH自由基（A）、羥自由基（B）、超氧陰離子自由基（C）的清除率Fig. 3 DPPH (A), hydroxyl (B), and superoxide anion radical (C)scavenging capacity of HVRP

2.6 HepG2細(xì)胞存活率

采用MTT法檢測(cè)HVRP的細(xì)胞內(nèi)毒性，如圖4A所示，0～100 μg/mL HVRP對(duì)HepG2細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)毒性，當(dāng)質(zhì)量濃度為200 μg/mL時(shí)，HepG2細(xì)胞活力受到抑制。因此，選取5、25、100 μg/mL進(jìn)行細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。

為了考察HVRP對(duì)肝細(xì)胞氧化損傷的作用機(jī)制，采用-BHP建立氧化損傷模型。如圖4B所示，HepG2細(xì)胞活力隨-BHP濃度的增加明顯下降。通過(guò)GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行擬合，得到-BHP作用的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC）為（217.52±20.94）μmol/L。因此，選取濃度220 μmol/L的BHP建立細(xì)胞氧化損傷模型。

圖4 HVRP（A）和t-BHP（B）對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響Fig. 4 Effect of HVRP and t-BHP on cell viability in HepG2 cells

2.7 HVRP對(duì)氧化損傷細(xì)胞抗氧化能力的影響

大量產(chǎn)生的ROS和GSH的消耗會(huì)引起機(jī)體的氧化應(yīng)激，機(jī)體受到氧化刺激后，抗氧化酶系統(tǒng)能夠進(jìn)行自我修復(fù)和調(diào)整，從而減少對(duì)細(xì)胞的氧化損傷。由圖5A可知，-BHP作用于HepG2細(xì)胞后，ROS生成量是正常組的4.65 倍。HVRP處理能夠極顯著降低ROS水平，HV100組ROS水平降低至正常組的1.27 倍。如圖5B～F所示，與模型組相比，HVRP能顯著或極顯著降低MDA含量，顯著或極顯著提高SOD、CAT和GPx活力并增加GSH含量。以上結(jié)果說(shuō)明HVRP能夠通過(guò)提高氧化損傷細(xì)胞的抗氧化酶活力、降低ROS水平來(lái)幫助細(xì)胞抵御氧化損傷。

圖5 不同濃度HVRP對(duì)t-BHP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞抗氧化酶活力和ROS生成量的影響Fig. 5 Effects of different concentrations of HVRP on antioxidant enzyme activities and ROS production in t-BHP-induced HepG2 cells

2.8 HVRP對(duì)氧化損傷細(xì)胞中Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路基因表達(dá)量的影響

Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路是細(xì)胞應(yīng)對(duì)氧化損傷的重要抗氧化途徑。由圖6可知，與模型組相比，HVRP處理總體上可明顯上調(diào)氧化應(yīng)激通路中、、、、、基因的表達(dá)，當(dāng)HVRP處理質(zhì)量濃度為25 μg/mL時(shí)，以上基因的表達(dá)量極顯著上調(diào)，其中抗氧化信號(hào)通路下游基因、、表達(dá)量分別為模型組的4.36、4.67、5.28 倍。

圖6 HVRP對(duì)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激基因表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of HVRP on the expression of genes associated with oxidative stress in HepG2 cells

2.9 HVRP對(duì)氧化損傷細(xì)胞中Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路蛋白表達(dá)量的影響

為進(jìn)一步驗(yàn)證HVRP的抗氧化作用機(jī)制，采用Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)情況，與基因表達(dá)結(jié)果相似，HVRP組較模型組明顯提高了Nrf2/ARE通路下游NQO1、HO-1蛋白表達(dá)水平（圖7A）。

Nrf2的核轉(zhuǎn)移是誘導(dǎo)NQO1和HO-1表達(dá)的關(guān)鍵步驟，HVRP處理使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Nrf2水平呈劑量依賴型降低趨勢(shì)，而細(xì)胞核內(nèi)Nrf2水平呈劑量依賴型升高，表明HVRP能促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)移（圖7B）；與模型組相比，HVRP處理提高了Nrf2/ARE通路上游激酶p-JNK/JNK水平（圖7C）。上述結(jié)果與文獻(xiàn)[32]結(jié)果相似，提示JNK磷酸化可能會(huì)促進(jìn)Nrf2核轉(zhuǎn)移，從而調(diào)控Nrf2/ARE通路下游II期解毒酶NQO1和HO-1的表達(dá)。

圖7 HVRP對(duì)HepG2細(xì)胞Nrf2/ARE通路氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Fig. 7 Effect of HVRP on the expression of oxidative stress-related proteins in Nrf2/ARE signaling pathway in HepG2 cells

3 討 論

ROS自由基引發(fā)的氧化應(yīng)激是多種肝臟疾病發(fā)生的基礎(chǔ)。Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化信號(hào)通路，能夠誘導(dǎo)抗氧化蛋白的表達(dá)，從而增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化損傷能力。Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激通路中最重要的轉(zhuǎn)錄因子，受Keap1調(diào)控，在正常生理狀態(tài)下，Nrf2與Keap1在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)處于結(jié)合的非活性狀態(tài)，通過(guò)泛素蛋白酶降解保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài)，Nrf2與Keap1發(fā)生解偶聯(lián)，Nrf2激活并跨膜入核，與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，識(shí)別抗氧化反應(yīng)元件ARE，進(jìn)而啟動(dòng)下游II相解毒酶和抗氧化酶的表達(dá)。相關(guān)研究表明，調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路可能與肝癌的治療有重要關(guān)聯(lián)。

研究證實(shí)，多糖能通過(guò)參與調(diào)節(jié)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路起到改善氧化應(yīng)激損傷等作用。阿里紅多糖能通過(guò)調(diào)節(jié)Nrf2/ARE信號(hào)通路提高機(jī)體抗氧化損傷作用；海帶多糖能夠通過(guò)激活Nrf2信號(hào)通路改善放射誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷和炎癥反應(yīng)；海藻多糖能提高抗氧化蛋白的表達(dá)、促進(jìn)Nrf2的核轉(zhuǎn)移，并通過(guò)激活Nrf2/ARE信號(hào)通路改善MRC-5細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)；從羊棲菜中提取的多糖能通過(guò)JNK與Nrf2相互作用激活Nrf2/ARE信號(hào)通路，并啟動(dòng)Nrf2下游相關(guān)抗氧化和解毒酶基因的表達(dá)，進(jìn)而提高機(jī)體抗氧化能力，延緩小鼠的衰老進(jìn)程。為了明確HVRP的抗氧化機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)研究了HVRP對(duì)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用。結(jié)果顯示，HVRP能顯著或極顯著降低細(xì)胞內(nèi)ROS水平和MDA含量、提高抗氧化酶（CAT、SOD、GSH、GPx）活性，并且對(duì)Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路中關(guān)鍵因子的基因和蛋白表達(dá)有顯著的調(diào)節(jié)作用；JNK作為Nrf2/ARE通路的上游激酶，可能對(duì)Nrf2/ARE信號(hào)通路的激活具有一定的促進(jìn)作用，而HVRP處理有提高JNK磷酸化的趨勢(shì)，這些結(jié)果均表明HVRP對(duì)-BHP誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用與Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路的調(diào)節(jié)有關(guān)，具體機(jī)制可能是HVRP通過(guò)誘導(dǎo)JNK蛋白磷酸化，促使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的Nrf2與Keap1解離，促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)入核內(nèi)，進(jìn)而與抗氧化反應(yīng)元件ARE序列結(jié)合，啟動(dòng)II相解毒酶（HO-1、NQO1、GST）和抗氧化酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，最終提高HepG2細(xì)胞抗氧化能力。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了HVRP提取工藝，得到最優(yōu)提取條件為：提取溫度84 ℃、提取時(shí)間3 h、料液比1∶31，該條件下HVRP提取率為23.9%。體外抗氧化實(shí)驗(yàn)表明HVRP具有較強(qiáng)的自由基清除活性?？寡趸瘷C(jī)制研究證明了HVRP通過(guò)激活氧化應(yīng)激Keap1/Nrf2/ARE信號(hào)通路起到保護(hù)HepG2細(xì)胞免受-BHP誘導(dǎo)的氧化損傷作用。綜上，本研究可為HVRP作為天然抗氧化劑在功能性食品中的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。