五味子煎劑對貉源大腸桿菌體外增殖和耐藥性的影響

王婧文 ， 譚貽鴻 ， 高昊天 ， 張東林 ， 史秋梅 ， 高桂生 ， 高光平

(1.河北科技師范學院河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室 ， 河北 秦皇島 066004 ； 2. 北京中醫(yī)藥大學東方學院 ， 河北 廊坊 065001)

五味子是傳統(tǒng)中藥，屬于木蘭科植物，在我國有豐富的資源，盛產于中國北方地區(qū)特別是東北三省[1]。按照產地不同分為南五味子和北五味子，二者相比，北五味子品質更好，且保存時間長不易霉變[2]。五味子滋補能力強，具有護肝、降糖、降血脂和補腎的功效。研究發(fā)現，含有五味子乙素為代表的木脂素類物質，具有抑制細菌增殖、抗氧化、抗病毒等作用 ； 從五味子仁中提取的五仁醇對中樞神經系統(tǒng)有一定的抑制作用，在臨床可用于慢性鎮(zhèn)痛[3]。中獸醫(yī)對五味子的使用由來已久，近年來對其有效成分及作用機理的研究不斷深入。研究證實，五味子中含有的有機酸和揮發(fā)油成分具有鎮(zhèn)咳作用，含有的木脂素類成分不僅可以發(fā)揮抑菌作用，還能保護機體心肌結構、鎮(zhèn)痛和保肝，此外，含有的多糖類物質可增強機體免疫力、抗腫瘤和抗氧化[4]。因此，五味子用于動物養(yǎng)殖過程中可發(fā)揮提高免疫力等多種作用。

貉大腸桿菌病是養(yǎng)殖過程中的常見病，主要是由大腸桿菌引起的，大腸桿菌是條件致病菌，常存在于貉腸道內，一旦飼養(yǎng)環(huán)境改變，貉抵抗力下降，就會使大腸桿菌大量繁殖，轉移至其他器官，引起貉消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)疾病，嚴重時會導致貉死亡[5]。幼貉患大腸桿菌病主要癥狀是水樣腹瀉，成年貉還可能出現流產和死胎的現象，嚴重時還會出現敗血癥癥狀[6]，導致毛皮質量下降，給養(yǎng)殖戶造成嚴重的經濟損失。通常養(yǎng)殖戶使用抗菌藥來治療貉大腸桿菌病，但由于抗菌藥的濫用，大腸桿菌的耐藥性提高，普通抗菌藥難以發(fā)揮作用，給治療帶來困難。五味子作為抑菌效果強的中藥，逐漸替代抗菌藥，但其煎劑濃度對貉源大腸桿菌的增殖能力以及對耐藥性的消除效果并不明確。本試驗將設立五味子煎劑濃度梯度，通過比較不同濃度下貉源大腸桿菌增殖和耐藥基因缺失的程度，探究濃度對細菌增殖和耐藥性的影響，以期為五味子的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 供試菌株為河北省預防獸醫(yī)學重點實驗室分離、鑒定并保存的貉耐藥性菌株，菌株編號為L40。五味子，購自秦皇島民樂藥店有限公司。

1.2 主要試劑和儀器 DL2 000 Marker和2×TaqPCR Master Mix，均購自天根生化科技(北京)有限公司；十二烷基硫酸鈉(SDS，分析純)，購自天津市致遠化學試劑有限公司。DXY-33A型電泳儀，由北京六一生物科技有限公司生產；AglentsureCycler880 PCR儀，由美國安捷倫公司生產；ChemiDocTMXRS+ 凝膠成像系統(tǒng)，由美國伯樂公司生產；其他試劑和儀器由本實驗室提供。

1.3 中藥液的制備 稱取已粉碎的五味子40 g，過篩后置于燒杯中，加入蒸餾水200 mL，然后靜置1 h，加熱煮沸，不斷攪拌，沸騰后改用文火煮30 min，煎煮完成后用4層紗布過濾；取藥渣加入100 mL蒸餾水，重復上述操作；將2次得到的藥液合并，去除藥渣后用文火濃縮至40 mL，五味子煎劑濃度為1 g/mL；室溫靜置24 h后離心，將得到的上清液pH調整為7.3左右，然后高壓滅菌，放入4 ℃冰箱保存?zhèn)溆肹7]。

1.4 菌懸液的制備 將貉源大腸桿菌從冰箱中取出，在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上復蘇、活化；將活化后的貉源大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)18 h后，挑取單個菌落，接種于營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37 ℃、180 r/min搖床上培養(yǎng)至對數期；用平板計數法進行菌液計數，用無菌PBS將菌液稀釋至終濃度為1×107CFU/mL。菌液置于4 ℃保存?zhèn)溆肹8]。

1.5 不同濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌增殖的影響 五味子煎劑濃度為1 000.00 mg/mL，用LB培養(yǎng)液進行2倍倍比稀釋，獲得的10個梯度濃度分別是500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL和0.98 mg/mL。分別吸取上述各濃度的五味子煎劑4 mL，加入1.4中配制好的菌懸液200 μL，37 ℃下靜置培養(yǎng)，接種完成記為0 h，每隔4 h吸取菌液進行平板計數[9]。同時，在4 mL LB培養(yǎng)液加入200 μL菌懸液，作為陰性對照；設置SDS濃度分別為0.120%、0.060%、0.030%、0.015%、0.008%，0.150%、0.075%、0.038%、0.019%和0.009%，在4 mL不同濃度的SDS溶液中加入200 μL菌懸液，作為陽性對照。

1.6 不同濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌耐藥性的影響 將經1.5處理的貉源大腸桿菌在37 ℃下培養(yǎng)24 h后，接種于LB培養(yǎng)液中，增菌后檢測耐藥基因。

1.6.1 耐藥基因引物 檢測β-內酰胺酶類耐藥基因blaTEM1、blaPSE1、blaOXA1、blaTEM、blaSHV-1和blaCTX-M，氨基糖苷類耐藥基因aadA1和strA-strB，四環(huán)素類耐藥基因tetA、tetB、tetC和tetD，大環(huán)內酯類耐藥基因ermB、ermC和ermF，以及磺胺類耐藥基因sul1、sul2和sul3，根據參考文獻[10]設計耐藥基因引物，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.6.2 耐藥基因PCR檢測 采用熱裂解法制備貉源大腸桿菌DNA，首先將待測菌株劃線接種于伊紅美藍瓊脂培養(yǎng)基平板上，于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)；挑取單菌落加入200 μL滅菌超純水中，充分混勻，制成菌懸液，100 ℃煮沸10 min，13 000 r/min離心5 min，吸取上清，置于-20 ℃冰箱保存，備用。

將制備的貉源大腸桿菌DNA置于室溫融化，以其作為PCR模板，進行PCR擴增。PCR反應體系：Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA模板1 μL，超純水補至20 μL。四環(huán)素類耐藥基因PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性50 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。氨基糖苷類耐藥基因PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；92 ℃變性1 min，60 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共33個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。磺胺類耐藥基因PCR反應程序：94 ℃預變性5 min；92 ℃變性1 min，62 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。

1.7 五味子煎劑作用前后貉源大腸桿菌對抗菌藥敏感性的變化 在普通瓊脂培養(yǎng)基上分別滴加未經處理的懸菌液和經1.5處理后的菌懸液10 μL，用三角形玻璃棒涂勻，采用K-B法進行藥敏試驗，37 ℃培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈的直徑，抑菌圈直徑在13 mm以下表明貉源大腸桿菌對該藥物有耐藥性；抑菌圈直徑在13～18 mm為中度敏感；抑菌圈直徑大于18 mm為高度敏感。

2 結果

2.1 不同濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌增殖的影響 由表1可知，與陰性對照相比，15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌的增殖有明顯的抑制作用，且隨著五味子煎劑濃度增加，菌株增殖數量逐漸減少；經62.50～500.00 mg/mL五味子煎劑作用12 h后無貉源大腸桿菌增殖。結果表明，15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌增殖存在抑制作用，且隨著濃度的增加，抑制作用增強。

表1 不同濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌分離株體外增殖的影響Table 1 Proliferation of E.coli strain in vitro after treatment with different concentrations of Schisandra decoction (CFU/mL)

2.2 不同濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌攜帶耐藥基因的影響 貉源大腸桿菌在五味子煎劑作用前共檢出12種耐藥基因。由于經62.50～500.00 mg/mL的五味子煎劑作用后貉源大腸桿菌已死亡，因此未檢測耐藥基因，經0.98～31.25 mg/mL五味子煎劑作用后菌株的耐藥基因檢測結果見表2，31.25 mg/mL五味子煎劑作用后菌株的耐藥基因檢測結果見圖1。由表2可知，與陰性對照相比，五味子煎劑作用后菌株攜帶的耐藥基因數量明顯減少，0.98～3.91 mg/mL五味子煎劑對消除菌株耐藥基因的作用較弱，均消除了6種耐藥基因；結合圖1可知，31.25 mg/mL五味子煎劑消除貉源大腸桿菌的耐藥基因數量較多，消除了9種耐藥基因。結果表明，五味子煎劑消除貉源大腸桿菌耐藥基因的效果隨濃度升高而增強。

表2 貉源大腸桿菌分離株經不同濃度的五味子煎劑作用后耐藥基因檢測結果Table 2 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different concentrations of Schisandra decoction

圖1 貉源大腸桿菌分離株經不同藥物作用后耐藥基因檢測結果Fig.1 Results of drug resistance gene detection of strain after treatment with different drugsA：陰性對照; B：五味子煎劑濃度為31.25 mg/mL； C：SDS濃度為0.120%A:Negative control; B:Schisandra decoction concentration was 31.25 mg/mL; C:SDS concentration was 0.120%M:DL2 000 DNA Marker; 1:tetA; 2:tetB; 3:tetC; 4:tetD; 5:ermB; 6:ermC; 7:ermF; 8:blaTEM; 9:blaTEM1; 10:blaCTX-M; 11:blaPSE1; 12:blaOXA1; 13:blaSHV-1; 14:aadA1; 15:strA-strB; 16:sul1; 17:sul2; 18:sul3

2.3 五味子煎劑作用前后貉源大腸桿菌對抗菌藥敏感性的變化 貉源大腸桿菌經五味子煎劑作用前后對12種常用抗菌藥的藥物敏感結果見表3。五味子煎劑作用前菌株對6種抗菌藥耐藥，經五味子煎劑作用后菌株對3種抗菌藥耐藥。結果表明，經五味子煎劑作用后，貉源大腸桿菌對抗菌藥的敏感性增加。

表3 貉源大腸桿菌經五味子煎劑作用前后藥物敏感性的變化Table 3 Changes of drug resistance of multidrug resistant E.coli before and after treatment with Schisandra decoction

3 討論

本試驗結果可以證實，五味子煎劑對貉源大腸桿菌有明顯的抑菌作用，且隨著濃度增加，其抑制貉源大腸桿菌的增殖和消除耐藥基因效果增強，并能夠提高貉源大腸桿菌對抗菌藥的敏感性。本試驗可以看出，五味子煎劑可以降低貉源大腸桿菌的菌落數量，與李蘊玉等[11]結果一致。但五味子抑制細菌增殖的作用機理并不明確，有待進一步研究，目前普遍認為五味子中含有的多烯類化合物可以改變細菌細胞膜的通透性，使營養(yǎng)物質流出，阻礙細菌的正常代謝，從而降低細菌增殖速度[3]。本試驗結果顯示，31.25 mg/mL的五味子煎劑消除貉源大腸桿菌攜帶的耐藥基因較多，而且可提高貉源大腸桿菌對抗菌藥的敏感性，但與其他的研究人員報道五味子降低耐藥性效果差異較大，據李棟[12]研究證實，五味子可消除禽源大腸桿菌的耐藥基因，消除率可達96%，造成不同結果的原因可能為以下三方面：一是不同地區(qū)購買的中藥品質不同；二是研究的大腸桿菌動物來源不同；三是對中藥有效成分提取方法和具體操作步驟不盡相同，從而導致中藥液中有效成分有一定的差異，作用效果就會存在差異。目前對五味子的耐藥基因消除作用的研究較少，張媛媛[3]研究認為，五味子能降低細菌的耐藥性是通過消除細菌的耐藥質粒實現的，五味子對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門菌的耐藥菌株均有明顯的抑制作用，其可不同程度地消除多重耐藥菌株的體外R質粒。

本試驗結果證明，五味子煎劑可以用來治療貉大腸桿菌病。貉大腸桿菌病是阻礙貉養(yǎng)殖業(yè)良性發(fā)展的人獸共患病，近幾年，由于抗菌藥的濫用，大腸桿菌的耐藥性逐年提高，給貉大腸桿菌病的預防和治療帶來了極大的困難。有研究發(fā)現，20世紀50年代時大腸桿菌對15種抗菌藥都高度敏感，但20世紀80年代末90年代初時大腸桿菌對11種抗菌藥已產生了耐藥性[13]。養(yǎng)殖戶對抗菌藥的不合理應用也加速了大腸桿菌耐藥性的發(fā)展，出現了愈來愈多的多重耐藥性大腸桿菌，多重耐藥性菌株已成為養(yǎng)殖過程中的巨大難題，使得藥效下降，用藥劑量不斷攀升，不僅增加了養(yǎng)殖成本，而且不能有效控制病情發(fā)展以及預防疾病的發(fā)生，阻礙了毛皮動物養(yǎng)殖業(yè)的進步。五味子煎劑在臨床上應用不僅可以治療貉大腸桿菌病，還可消除貉源大腸桿菌的耐藥基因，為解決貉源大腸桿菌耐藥性增加的問題提供了新思路。

目前為止，有關中藥作為耐藥性消除劑的作用機理研究較少，且均不夠深入，本試驗雖然證實了15.63 mg/mL及以上濃度的五味子煎劑對貉源大腸桿菌體外增殖和耐藥性有明顯的作用效果，但是其作用機理有待進一步研究。本試驗證實了五味子煎劑的抑菌作用與其濃度成正比，因此在臨床實踐中可根據貉的體重適當調高五味子煎劑的濃度用于治療貉大腸桿菌病。