陳皮-半夏藥對治療高脂血癥作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析與實驗研究

張 理

高脂血癥(hyperlipidemia)是一種常見病，是人體內(nèi)脂蛋白代謝異常進(jìn)而引起一系列癥狀的疾病[1]。血脂異常會增加血液黏稠度，引起動脈粥樣硬化，危害冠狀動脈及腦血管，對心、腦、腎等器官有巨大危害，臨床上常引起冠狀動脈性心臟病、腦梗死、高血壓、脂肪肝等疾病[2-3]。2012年—2015年在我國東中西部年齡≥35歲人群血脂異常患病率為 34.7%，高三酰甘油血癥、高總膽固醇血癥、低高密度脂蛋白膽固醇血癥、高低密度脂蛋白膽固醇血癥的患病率分別為 14.1%、7.5%、19.2%和6.0%，并且這一數(shù)據(jù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢，而血脂異常知曉率、治療率和控制率均較低，故血脂異常的防治工作亟待加強(qiáng)[4]。目前西醫(yī)治療常用的降血脂藥物有5 類，分別為他汀類、貝特類、煙酸類、膽酸螯合劑和膽固醇吸收抑制劑等[5]。西藥在控制血脂異常上具有很大的局限性，如由于他汀類藥物不耐受常引起肌溶解和肝損傷事件[6]。故向傳統(tǒng)醫(yī)藥中尋求治療高脂血癥的安全而有效的藥物越來越受到重視[7]。中醫(yī)藥學(xué)中并無高脂血癥這一病名，《靈樞·五癃津液別》云：“五谷之津液和合而為膏者，內(nèi)滲入于骨空，補(bǔ)益腦髓，而下流于陰股”，此處所言膏脂即與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)所言“脂質(zhì)”類似，故一般將其歸屬于“眩暈”“胸痹”“痰濁”“血瘀”的范疇[8]。中醫(yī)體質(zhì)學(xué)辨識研究表明，血脂異常與痰濕體質(zhì)密切相關(guān)[9]。陳皮、半夏是經(jīng)典方劑二陳湯的主要組成部分，具有燥濕化痰、理氣和中之功效，是臨床治療高脂血癥的常用藥對。研究表明，以陳皮、半夏為主要組成的方劑能夠有效改善脂肪酸的代謝，起到降低血脂的作用[10-11]。由于中藥成分的復(fù)雜性及作用靶點的不確定性，目前針對陳皮-半夏藥對治療高脂血癥的確切機(jī)制尚不清楚。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從整體策略出發(fā)以探討陳皮-半夏藥對治療高脂血癥的作用機(jī)制，并采用分子對接技術(shù)對相關(guān)結(jié)果進(jìn)行驗證，為后續(xù)中醫(yī)藥治療及基礎(chǔ)研究提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 核心藥物有效成分及靶點獲取 將陳皮、半夏逐次輸入到中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，https：//tcms-pw.com/tcmsp.php)[12]，根據(jù)ADME原則[13]，設(shè)置口服生物利用度(OB)≥30%，類藥性(DL)≥0.18 進(jìn)行篩選，得到核心藥物有效成分及作用靶點。得到靶點的同時，在TCMSP中檢索并得到有效成分的結(jié)構(gòu)式，以MOL2格式保存。將上述靶點導(dǎo)入到UniProt[14]網(wǎng)站(https：//www.uniprot.org/)進(jìn)行基因映射(Gene Mapping)以獲取相應(yīng)靶點的基因組。

1.2 疾病-藥物共同靶基因的獲取 在人類基因數(shù)據(jù)庫 GeneCards[15-16](https：//genecards.weizmann.ac.il/v3/)和MalaCards[17](https：//www.malacards.org/)中以“hyperlipidemia”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲取冠心病的靶基因，將上述藥物靶基因與疾病靶基因?qū)氲紻raw Venn Diagram網(wǎng)站(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)中繪制韋恩圖，并得到疾病-藥物共同靶基因。

1.3 關(guān)鍵靶點蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 將上述疾病-藥物共同靶基因?qū)氲絊TRING網(wǎng)站[18](https：//string—db.org/)中，選取物種為“Homo sapiens”，得到靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系。導(dǎo)出蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)文件后，利用Cytoscape軟件[19]優(yōu)化圖形，并根據(jù)度值獲取PPI網(wǎng)絡(luò)[20]中排名前10位的關(guān)鍵基因(Hub Gene)。

1.4 基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析 將疾病-藥物共同基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫中，選擇物種為“Homo sapiens”進(jìn)行GO富集分析[21]與KEGG信號通路富集分析[22]。并獲取與高脂血癥密切相關(guān)的信號通路作用路徑圖。將上述結(jié)果分別導(dǎo)入到“微生信”網(wǎng)站(http：//www.bioinformatics.com.cn)進(jìn)行相關(guān)結(jié)果及數(shù)據(jù)的可視化操作。

1.6 分子對接驗證 Discovery Studio(DS，V2016)是新一代的分子模擬軟件，采用CDOCKER模塊的動力學(xué)方法隨機(jī)搜索小分子構(gòu)象，隨后采用模擬退火的方法將各個構(gòu)象在受體活性位點區(qū)域進(jìn)行優(yōu)化[23-24]。在國內(nèi)外高脂血癥的專家共識或指南中，他汀類藥物[3-羥基-3-甲基戊二酸單酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶抑制劑]都被推薦為一線治療藥物[25-26]。因此，本研究利用Discovery Studio(DS，V2016)對陳皮-半夏有效成分與HMG-CoA還原酶(HMG-CoA reductase)進(jìn)行分子對接實驗，并以瑞舒伐他汀(rosuvastatin)作為對照。具體方法：①在DrugBank網(wǎng)站(https：//www.drugbank.ca/)上以關(guān)鍵詞“rosuvastatin”進(jìn)行檢索以獲取瑞舒伐他汀的結(jié)構(gòu)式，保存為MOL2格式，與1.1中的藥物有效成分一起導(dǎo)入到Open Babel GUI軟件中轉(zhuǎn)換為一個MOL2文件集。②在RCSB PDB網(wǎng)站(https：//www.rcsb.org/search)上以“HMG-CoA reductase”進(jìn)行檢索，分別獲取β1受體與β2受體的PDB結(jié)構(gòu)式。③將上述配體導(dǎo)入到DS軟件中，利用“prepare ligands”功能進(jìn)行配體準(zhǔn)備。同時對受體進(jìn)行去除Water、Lagands Groups以及無關(guān)的側(cè)鏈等，點擊Receptor-Ligand Interactions>Define and Edit Binding Site >From Receptor Cavities在蛋白空腔中尋找有潛力的活性位點。④利用CDOCKER功能進(jìn)行分子對接，并根據(jù)-CDOCKER _ INTERACTION _ ENERGY(負(fù)分子對接結(jié)合能)獲取每組對接分子中得分最好的分子構(gòu)象并進(jìn)行排名。分子對接構(gòu)象的負(fù)分子對接結(jié)合能越大，則結(jié)合構(gòu)想越穩(wěn)定，反映受體分子與配體之間結(jié)合的可能性越大。

1.7 動物實驗驗證

1.7.1 實驗藥物及試劑 陳皮、半夏購自河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥飲片室，經(jīng)科室專業(yè)人員鑒定為合格藥品。陳皮、半夏等比例混合并在100 ℃下煎煮30 min，取過濾液，配制成1 mL含生藥2 g的濃縮液?？?膽 固 醇 ( total cholesterol，TC)、三 酰 甘 油 (triglyceride，TG)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein，LDL-C)生化檢測試劑均購自中生北控生物科技股份有限公司；蛋白激酶B1(AKT1)、絲裂原活化蛋白激酶3(MAPK3)、腫瘤抑制蛋白p53(TP53)、Jun原癌基因(JUN)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、過氧化物酶體激活受體γ(PPARG)、絲裂原活化蛋白激酶8(MAPK8)、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、胱天蛋白酶3(CASP3)、過氧化氫酶(CAT)蛋白抗體均購自廣州左克生物科技發(fā)展有限公司。

1.7.2 實驗動物分組及干預(yù) 無特定病原體(SPF)級雄性大鼠30只，體質(zhì)量(200±20)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為對照組、模型組、藥物組，每組10只。實驗動物供清潔自來水和標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由進(jìn)食和飲水，室內(nèi)環(huán)境溫度為22～24 ℃，濕度為50%～60%，12 h明暗交替循環(huán)(07：00～19：00)。除對照組外，其余兩組按照參考文獻(xiàn)中方法給予高脂飼料喂養(yǎng)8周后轉(zhuǎn)化為高脂血癥大鼠模型。各組給藥干預(yù)，對照組和模型組分別灌胃等劑量的生理鹽水，劑量為 10 mL/kg，按人體表面積計算，藥物組灌胃10 g/kg 陳皮-半夏湯劑，干預(yù)1周。 末次灌胃給藥后12 h，取10%水合氯醛按腹腔注射麻醉大鼠，稱取大鼠體脂量行內(nèi)眥靜脈叢取血，并分離肝臟，用于檢測。本研究方案已通過河南中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物倫理委員會審核并批準(zhǔn)，并在實驗過程中嚴(yán)格遵守動物倫理學(xué)3R原則。

1.7.3 肝臟指數(shù)測定及病理變化比較 分離倉鼠的肝臟后稱取質(zhì)量，按公式計算肝臟指數(shù)：肝臟指數(shù)=肝臟質(zhì)量/體質(zhì)量×100%。取新鮮肝臟組織切片，行蘇木精-伊紅(HE)染色以觀察不同組間肝臟組織病理學(xué)變化。

1.7.4 生化檢測 內(nèi)眥靜脈叢血以3 000 r/min離心10 min后取上清液，以全自動化儀檢測血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。檢測過程中嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作。

1.7.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot)檢測相關(guān)蛋白 取肝組織于冰上剪碎后、裂解，蛋白質(zhì)定量(BCA)法測定蛋白濃度，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，電壓設(shè)置為80 V、30 min和110 V、60 min，根據(jù)Maker的移動情況，終止電泳。用醋纖維素轉(zhuǎn)膜，加入稀釋一抗，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗中反應(yīng)2 h，再用 TBST 洗膜3次，加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯示劑顯色，暗室膠片曝光。使用Western Blot法檢測肝臟組織中蛋白表達(dá)情況，初步驗證富集分析結(jié)果。使用Image J軟件對蛋白條帶進(jìn)行量化處理，目標(biāo)蛋白表達(dá)量通過β-actin校正。

浮選尾礦熔煉合金100 g，熔煉中還原劑配比為尾礦干基20%，真空度為102 Pa，溫度1 000～1 100 ℃，蒸餾45～90 min，浮選尾礦熔煉合金各組分分析結(jié)果見表3，試驗結(jié)果見表4。

2 結(jié) 果

2.1 核心藥物的有效成分及靶標(biāo) 從TCMSP網(wǎng)站共得到陳皮有效成分5個、半夏有效成分13個，詳見表1。再將上述有效成分分別輸入到TCMSP網(wǎng)站再次檢索，得到有效成分作用靶點，去重后共計123個，然后再將這些靶點導(dǎo)入到UniProt網(wǎng)站轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的基因Symbol。

表1 陳皮-半夏藥對有效成分

2.2 疾病-藥物共同靶基因 從GeneCards網(wǎng)站獲取到高血壓病靶基因1 389個，將疾病與藥物靶點導(dǎo)入到Draw Venn Diagram網(wǎng)站進(jìn)行韋恩圖分析，得到疾病-藥物共同靶基因69個。詳見圖1。

圖1 陳皮-半夏藥對與高脂血癥交集基因Venn圖

2.3 關(guān)鍵靶點PPI網(wǎng)絡(luò) 將上述69個共同基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫后得到關(guān)鍵PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。在PPI網(wǎng)絡(luò)中，靶點以節(jié)點顯示，以邊相連接，關(guān)鍵靶點的邊更加密集，節(jié)點也就越大，表示在PPI網(wǎng)絡(luò)所起到的作用就越重要。將PPI網(wǎng)絡(luò)以TSV格式保存后，利用Cytoscape軟件中的Hub插件，根據(jù)度值得到排名前10位的Hub基因(核心基因)，詳見圖3。

圖2 疾病-藥物交集基因PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 根據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)得到的Hub基因

2.4 GO富集分析與KEGG通路富集分析 將上述疾病-藥物交集靶基因?qū)氲紻avid數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO富集分析，包括3個方面，即生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cellular component，CC)和分子功能(molecular function，MF)，詳見圖4。KEGG富集分析主要涉及癌癥相關(guān)信號通路(pathways in cancer)、乙型肝炎信號通路(hepatitis B)、非酒精性脂肪肝信號通路(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路(TNF signaling pathway)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、脂肪細(xì)胞因子信號通路(adipocytokine signaling pathway)等，詳見圖5。其中與高脂血癥密切相關(guān)的非酒精性脂肪肝信號通路作用路徑詳見圖6，圖中紅色五角星代表藥物靶點。

圖4 GO富集分析結(jié)果

圖5 KEGG信號通路富集分析結(jié)果

圖6 非酒精性脂肪肝信號通路作用圖

2.5 陳皮-半夏藥對成分-靶點-通路網(wǎng)絡(luò)分析 為了更清晰地展現(xiàn)陳皮-半夏藥對成分、靶點與通路之間的關(guān)系，使用 Cytoscape 軟件構(gòu)建通路-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)(見圖 7)。網(wǎng)絡(luò)圖包含節(jié)點與邊，白色節(jié)點代表藥物有效成分，綠色節(jié)點代表中藥名稱，黃色節(jié)點代表靶基因，紅色節(jié)點代表信號通路。網(wǎng)絡(luò)圖可以直觀展示出陳皮-半夏具有通過多成分、多靶點、多通路相互協(xié)調(diào)作用于高脂血癥的特點。

圖7 陳皮-半夏藥對成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對接驗證結(jié)果 根據(jù)分子對接方法進(jìn)行分子驗證，得到HMG-CoA還原酶分子對接構(gòu)象180個。每組分子對接結(jié)果取負(fù)分子對接結(jié)合能分值最高的，共得到18個對接結(jié)果，排名前10位的包括MOL005828、MOL002776、MOL006937、MOL005815、446157(rosuvastatin)、MOL000359、MOL003578、MOL005030、MOL000358、MOL001755。對結(jié)果進(jìn)行可視化，得到分析熱圖(Heatmap)，詳見圖8。其中排名前6位的結(jié)合構(gòu)象以3D圖及2D圖展示(見圖9)。在3D圖中可見配體與靶蛋白結(jié)合的具體位置關(guān)系，而在2D圖中可見配體與靶蛋白形成的作用力類型及結(jié)合位點(氨基酸、殘基等)。

圖8 全部分子對接結(jié)果熱圖分析

圖9 配體-靶蛋白對接模式3D圖及2D圖(A&a為MOL005828與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果；B&b為 MOL002776與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果；C&c為MOL006937與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果；D&d為 MOL005815與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果；E&e為瑞舒伐他汀與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果；F&f為MOL000359與HMG-CoA還原酶對接結(jié)果)

2.7 動物實驗結(jié)果

2.7.1 陳皮-半夏對大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)影響 3組小鼠基礎(chǔ)體質(zhì)量一致，造模后，模型組大鼠體態(tài)較對照組臃腫，行動遲緩且不喜活動，體質(zhì)量及肝臟指數(shù)明顯偏大，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。藥物組體質(zhì)量、肝臟指數(shù)較模型組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠體質(zhì)量及肝臟指數(shù)比較(±s)

2.7.2 3組大鼠肝臟組織病理學(xué)變化比較 對照組可見肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)正常，無炎性浸潤和壞死；模型組可見肝細(xì)胞排列紊亂，脂肪細(xì)胞空泡樣變性及脂質(zhì)沉積，出現(xiàn)明顯炎性浸潤和壞死灶；藥物組可見脂肪浸潤和少量脂肪細(xì)胞空泡，肝細(xì)胞炎性浸潤和壞死灶顯著減輕。詳見圖10。

圖10 各組大鼠肝組織病理學(xué)變化

2.7.3 陳皮-半夏對血脂水平影響 模型組TG、TC、LDL-C較對照組明顯升高，HDL-C較對照組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；藥物組TG、TC、LDL-C較模型組明顯降低，HDL-C較模型組明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。提示陳皮-半夏藥對可以有效降低高脂血癥大鼠血液TG、TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平。詳見圖11。

＊與對照組比較，P<0.05；#與模型組比較，P<0.05。圖11 3組血清TG、TC、HDL-C、LDL-C水平比較

2.7.4 陳皮-半夏對目標(biāo)基因蛋白表達(dá)量的影響 與對照組比較，模型組肝臟組織中AKT1、VEGFA、PPARG蛋白表達(dá)量明顯降低，而MAPK3、TP53、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3蛋白表達(dá)量明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，藥物組肝臟組織中AKT1、VEGFA、PPARG蛋白表達(dá)量明顯升高，而MAPK3、TP53、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3蛋白表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。動物實驗結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果基本吻合。詳見表3、圖12。

表3 3組Hub基因蛋白表達(dá)量比較(±s)

圖12 各組大鼠肝臟Hub基因蛋白表達(dá)量熱圖

3 討 論

基于整體觀念，中醫(yī)藥在復(fù)雜疾病的治療中具有一定的優(yōu)勢，然而中藥治療疾病具有多成分、多靶點、多通路的作用機(jī)制，限制了其進(jìn)一步的發(fā)展與推廣[27]。目前的還原主義研究策略仍然難以揭開這種整體醫(yī)學(xué)的面紗[28]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以基于靶分子、生物功能和生物活性化合物生成復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)，符合中醫(yī)藥的天然特性，并能從分子水平方面系統(tǒng)地闡明中醫(yī)藥的作用機(jī)制，逐漸成為中醫(yī)藥研究的一個具有光明前景的整體策略[29-30]。另外，在中藥有效成分中發(fā)現(xiàn)，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法有望突破對跨多個信息層的藥物作用的理解。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在細(xì)胞或表型網(wǎng)絡(luò)的背景下考慮藥物反應(yīng)，是傳統(tǒng)還原論研究方法的替代補(bǔ)充[31]。這種方法有效地彌合了現(xiàn)代醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥之間的鴻溝，極大地促進(jìn)了中醫(yī)藥協(xié)同作用的研究[32]。

TCMSP是中國藥科大學(xué)基于中草藥系統(tǒng)藥理學(xué)框架建立的一種中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺。通過ADME原則篩選，可以得到中藥的有效成分及對應(yīng)的靶點。陳皮與半夏中主要包含谷甾醇(sitosterol)、檸檬酸(citromitin)、川陳皮素(nobiletin)、黃芩苷(baicalin)、黃芩素(baicalein)等有效成分。研究表明谷甾醇在內(nèi)的植物甾醇能夠有效降低低密度脂蛋白含量，能有利改變脂質(zhì)譜，達(dá)到抗血脂藥物的功效，并具有良好的人體耐受性和安全性[33-34]。川陳皮素是具有重要生物學(xué)特性的多酚化合物，主要通過抑制肝脂肪酸合成和增加脂肪酸氧化來預(yù)防肝臟脂肪變性，從而起到降低血脂作用，同時還具有胰島素增敏、降血壓、抗炎及抑制動脈粥樣硬化的特性[35]。動物實驗表明，川陳皮素可以通過調(diào)節(jié)大鼠AdipoR1和gp91(phox)表達(dá)來減輕高脂飲食誘導(dǎo)的非酒精性脂肪肝疾病，也可以改善肥胖低密度脂蛋白受體基因敲除(LDLR-/-)小鼠的代謝綜合征和動脈粥樣硬化，干預(yù)甚至逆轉(zhuǎn)肥胖癥[36-37]。黃芩苷最早從中藥黃芩中發(fā)現(xiàn)，可改善高脂飲食誘導(dǎo)的腸道微生態(tài)和異常代謝，減少由腸道菌群通過膳食纖維的發(fā)酵而產(chǎn)生短鏈脂肪酸，還可以調(diào)節(jié)SirT1 / STAT3途徑并抑制肝葡萄糖過多產(chǎn)生[38-39]?？梢?，陳皮-半夏藥對中的多種成分對血脂代謝有作用。

PPI網(wǎng)絡(luò)主要考察靶蛋白之間的相互作用關(guān)系，在PPI網(wǎng)絡(luò)中根據(jù)連接度值得到排名前10位的Hub基因為AKT1、MAPK3、TP53、JUN、VEGFA、PPARG、MAPK8、PTGS2、CASP3、CAT。AKT1的激活誘導(dǎo)細(xì)胞脂肪酸以及細(xì)胞膜磷酸甘油酯的濃度增加，還參與胰島素介導(dǎo)的作用，例如脂肪生成、葡萄糖攝取以及葡萄糖轉(zhuǎn)化為脂肪酸和膽固醇等過程，并具有明顯抗動脈粥樣硬化作用[40-41]。Heinonen等[42]通過比較腺病毒VEGFA基因轉(zhuǎn)移對載脂蛋白E基因敲除(ApoE-/-)、LDLR-/-小鼠的動脈粥樣硬化和脂蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)VEGFA基因轉(zhuǎn)移在所有模型中均引起脂蛋白分布的動脈粥樣硬化改變。VEGFA轉(zhuǎn)移還降低了脂蛋白脂肪酶(LPL)活性，這可能是所觀察到的脂質(zhì)分布變化的基礎(chǔ)。長期以來，脂肪組織的生長被認(rèn)為是有血管生成依賴性的，正常脂肪組織的功能依靠與血管在細(xì)胞因子、外泌體等方面的正常互動，而血管生成潛力不足被認(rèn)定為脂肪組織功能障礙的“不祥三聯(lián)征”之一[43]。Cardona 等[44]通過對74例代謝綜合征病人口服60 g脂肪超負(fù)荷，然后測定TC、TG、HDL-C、載脂蛋白A1、載脂蛋白B、尿酸和尿酸排泄的基線濃度，發(fā)現(xiàn)代謝綜合征病人中Pro12Ala PPARG序列變異體與餐后高脂血癥的風(fēng)險相關(guān)，表明PPARG與脂蛋白清除率的調(diào)節(jié)密切相關(guān)。

GO分析是基于分子效團(tuán)的生物信息學(xué)工具，使用本體論代表生物學(xué)知識來提供有關(guān)基因產(chǎn)物功能的信息，并以結(jié)構(gòu)化的方式用核心實體來表示生物學(xué)功能[45]。GO富集分析結(jié)果顯示陳皮-半夏藥對具有酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控、配體激活序列特異性DNA結(jié)合、類固醇激素受體結(jié)合等生物功能，主要涉及胞漿、核質(zhì)、核染色質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等細(xì)胞組分，從而參與對藥物的反應(yīng)、老化、缺氧反應(yīng)、膽固醇代謝過程、凋亡過程的負(fù)調(diào)控等生物過程。GO富集分析結(jié)果提示陳皮-半夏藥對中能夠從分子、細(xì)胞等多個層面干預(yù)血脂的代謝。KEGG是系統(tǒng)分析基因功能與基因組信息的數(shù)據(jù)庫，整合了基因組學(xué)、生物化學(xué)和系統(tǒng)功能組學(xué)的信息，有助于研究者將基因及表達(dá)信息的過程作為一個網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行整體研究。KEGG富集分析結(jié)果顯示，陳皮-半夏藥對除了可以直接通過非酒精性脂肪肝信號通路以外，還可以通過多個信號通路對血脂代謝起到協(xié)同作用。在非酒精性脂肪肝信號通路路徑中，主要涉及ACDC、JUK、Akt、CASP3、CASP8等靶點，并與PI3K-AKT等信號通路形成交互關(guān)系，對血脂異常、血糖代謝障礙等在內(nèi)的代謝綜合征具有多路徑干預(yù)作用，還可以介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，以及協(xié)調(diào)免疫細(xì)胞浸潤而起到抗炎作用。肝臟是人體脂質(zhì)重要的代謝器官，肝炎發(fā)生常伴隨脂質(zhì)等物質(zhì)的代謝異常，也會導(dǎo)致炎性因子等失衡。相反，陳皮-半夏藥對有效成分也可能通過調(diào)節(jié)乙型肝炎信號通路來間接影響肝細(xì)胞的代謝狀態(tài)，從而促進(jìn)脂質(zhì)代謝[46]。研究表明，巨噬細(xì)胞引起的代謝炎癥和脂肪細(xì)胞-巨噬細(xì)胞相互作用在肥胖癥中具有首要的重要性。脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間涉及游離脂肪酸和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)旁分泌建立的惡性循環(huán)，加劇了脂肪組織中的炎癥反應(yīng)。此外，缺氧以及較高濃度的游離脂肪酸會加劇肥胖癥中巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。故陳皮-半夏藥對有效成分很有可能通過TNF信號通路降低巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的脂肪組織炎癥反應(yīng)，從而減少脂肪在人體局部的堆積[47]。另外，炎癥、纖維化和血管生成受損被認(rèn)定為脂肪組織功能障礙的“不祥三聯(lián)征”。炎癥和血管生成、重塑不當(dāng)都可以驅(qū)動纖維化，進(jìn)而促進(jìn)免疫細(xì)胞向脂肪貯庫的遷移，并阻礙進(jìn)一步的血管生成[48]。如前所述，陳皮-半夏藥對有效成分對炎癥及血管生成均具有調(diào)節(jié)作用，故可以認(rèn)為在TNF信號通路與血管內(nèi)皮生長因子信號通路方面具有協(xié)同作用。大量臨床觀測及研究顯示，人體甲狀腺激素缺乏時常導(dǎo)致肥胖癥及代謝綜合征等[49]。目前，對于甲狀腺激素的認(rèn)識方面也早已轉(zhuǎn)為治療方面。相關(guān)研究表明谷甾醇可以刺激甲狀腺激素的釋放，而β-谷甾醇早已被相關(guān)指南推薦為治療高脂血癥的藥物[50]。另外，陳皮-半夏藥對的多種成分還可以通過多個靶點直接參與到脂肪細(xì)胞因子信號通路，對人體脂質(zhì)的攝取、分布、代謝、排泄起到重要作用[51]。

分子對接技術(shù)是應(yīng)用計算機(jī)模擬程序，通過定義結(jié)合位點來預(yù)測配體與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的可能性及空間構(gòu)象[52-53]?；诜肿訉蛹夹g(shù)，可以對成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖中的有效成分與目標(biāo)靶點進(jìn)行模擬對接，并通過對相關(guān)結(jié)合參數(shù)及結(jié)合構(gòu)象的分析，有助于具有臨床潛力的有效成分發(fā)現(xiàn)及藥物設(shè)計、前導(dǎo)優(yōu)化等[54]。通過將陳皮-半夏有效成分與HMG-CoA還原酶進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)多種成分的對接構(gòu)象優(yōu)于或類似于瑞舒伐他汀，如川陳皮素、黃芩苷等。在結(jié)合位點上主要集中在TLE746、GLY748等，而作用力主要是以范德華力、氫鍵為主。分子對接結(jié)果證明陳皮-半夏藥對有效成分能夠通過與HMG-CoA還原酶結(jié)合，從而起到降低血脂的作用。

動物實驗顯示，陳皮-半夏藥對可有效改善高脂血癥大鼠血脂代謝情況，能明顯降低其體質(zhì)量及肝臟指數(shù)。肝臟組織病理切片觀察結(jié)果顯示，應(yīng)用陳皮-半夏藥對煎煮劑灌服后，大鼠肝臟組織炎癥浸潤及脂質(zhì)沉積情況明顯好轉(zhuǎn)。Western Blot 實驗顯示陳皮-半夏能夠明顯升高AKT1、VEGFA、PPARG等蛋白表達(dá)量，并明顯降低MAPK3、TP53、JUN、MAPK8、PTGS2、CASP3等蛋白表達(dá)量。表明陳皮-半夏藥對可以通過降低相關(guān)炎性因子的表達(dá)，并促進(jìn)脂代謝正調(diào)控蛋白的表達(dá)，從而起到降血脂作用，這與生物富集結(jié)果基本一致。

4 小 結(jié)

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討了陳皮-半夏藥對中多種活性成分通過多靶點、多通路協(xié)同作用于高脂血癥的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制，分子對接顯示部分有效成分與HMG-CoA還原酶對接良好，發(fā)現(xiàn)陳皮-半夏藥對中的川陳皮素、黃芩苷等有效成分是其發(fā)揮降脂作用的潛在分子基礎(chǔ)。動物實驗表明，陳皮-半夏對高脂血癥小鼠血脂代謝有明顯改善效果，并能有效調(diào)控大鼠肝臟相關(guān)基因的表達(dá)量。本項研究將為后續(xù)的中醫(yī)藥治療及進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究提供一定幫助。