基于“成分-抗氧化”關聯(lián)的不同發(fā)酵程度茶及茶飲料比較評價

王越，翟佩佩，鮑鋒，張富坤，趙盼，李佳，趙東升

（山東中醫(yī)藥大學藥學院，濟南 250355）

茶，主要由山茶科植物茶（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）的嫩葉經過殺青、發(fā)酵等工藝制作而成，因其清香醇厚的特質及發(fā)揮的許多功能而深受全球人們的喜愛，并成為近年來國內外食品研究和開發(fā)的熱點之一［1，2］。研究報道已經證實了茶的各種生物學功能，如抗氧化、抗炎、抗過敏、抗微生物和抗癌以及預防心血管疾病等［3，4］。

氧自由基在多種疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中起著顯著性的促進作用［5-7］。當人體內的氧自由基產生負面影響后，會導致各種疾病的產生，可以通過攝入具有天然抗氧化功能的藥食兩用植物活性成分來增強抗氧化作用，輔助機體能更好地對抗疾病。茶含有多酚類、嘌呤堿、糖類、維生素和茶色素等營養(yǎng)成分，其中主要功能性化學成分是茶多酚、咖啡堿以及茶多糖［8］。其中，茶多酚能夠高效地清除多余自由基，防止活性氧簇的形成，具有很強的抗氧化功能［9，10］。

茶葉根據發(fā)酵的程度不同，可以分為3大類型，即未發(fā)酵茶、半發(fā)酵茶和全發(fā)酵茶。茶中主要功能性成分的組成和含量會因茶葉類型、品質以及水溫和沖泡時間等因素呈現一定差異［11］。Zhang等［12］利用GC×GC-TOFMS技術與多變量數據分析發(fā)現，不同發(fā)酵程度的茶中化學成分存在顯著性差異。茶及茶飲料中所含化學成分種類較多，目前對于不同類型茶的化學成分及其抗氧化活性的研究很多，但大多研究報道集中在單一類型茶葉如綠茶［13］、普洱茶［14］的活性成分或功能以及不同類型茶葉單一活性成分或功能方面［15-17］。鑒于中藥“化學成分-生物活性”綜合質量評價的新模式［18，19］，僅通過單一類型的活性成分或生物功能作為評價指標，不能綜合系統(tǒng)地比較分析不同發(fā)酵程度的茶及茶飲料。因此，本研究基于“化學成分-抗氧化活性”關聯(lián)的研究模式，通過多元化的交叉模式將不同發(fā)酵程度茶及茶飲料的活性化學成分和抗氧化功能結合，科學地對不同發(fā)酵程度茶及茶飲料進行對比分析［20］，以期為茶葉資源的進一步深入開發(fā)利用及養(yǎng)生保健茶飲料的品種選擇提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

未發(fā)酵茶（日照綠茶）、半發(fā)酵茶（鐵觀音）、全發(fā)酵茶（紅茶）、未發(fā)酵茶飲料（綠茶）、半發(fā)酵茶飲料（烏龍茶）和全發(fā)酵茶飲料（紅茶）購自濟南市長清大學城銀座超市，其中茶飲料除茶葉和水外僅添加少量維生素C和防腐劑，保持原本茶汁風味；蘆丁（純度大于98%）、沒食子酸（純度大于98%）購于上海源葉生物科技有限公司；甘氨酸（純度大于98%），上海麥克林生化科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH，純度大于97%）、無水葡萄糖，阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 主要儀器與設備

X-5型METASH紫外可見分光光度計，上海元析儀器有限公司；Thermo Sorvall ST16R型高速低溫離心機，賽默飛世爾科技有限公司；DRHH-S4型數顯恒溫水浴鍋，上海程捷儀器設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖的提取將3種茶葉磨成粉末，過4號篩，分別精確稱取0.50 g，置于50 mL干燥離心管中，精密加入20.00 mL去離子水，密封，置于水浴（80℃）中加熱提取100 min，冷卻，離心（13 000 r/min）10 min，取上清液作為茶葉供試品溶液［21］。

1.3.2 黃酮類成分的含量測定參考文獻［22］報道的黃酮測定方法測定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮類成分含量，并在其基礎上稍作修改。精確稱取蘆丁標準品2.50 mg，置于25 mL容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準品溶液。分別精密移取蘆丁標準品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于10 mL容量瓶中，加水至2.5 mL，然后加入5%亞硝酸鈉溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加10%硝酸鋁溶液0.4 mL，搖勻，靜置6 min，加4%氫氧化鈉溶液6.0 mL，無水乙醇定容，搖勻，放置15 min，于510 nm波長處測定吸收度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=12.172C+0.003 3（R2=0.999 1），表明蘆丁在5.00～25.00 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。精密吸取茶葉供試品溶液0.2mL、茶飲料1.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測定吸光度，利用標準曲線法計算樣品溶液中黃酮類成分的含量。

1.3.3 多酚類成分的含量測定參考王靜等［23］的多酚測定方法測定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多酚類成分含量，并在其基礎上稍作修改。精確稱取沒食子酸標準品2.50 mg，置于25 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg/mL的沒食子酸標準品溶液。分別取沒食子酸標準品溶液0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL于10 mL量瓶中，加入5.0 mL的Folin-Ciocalteu試劑、4.0 mL的7.5%Na2CO3溶液，去離子水稀釋至刻度，室溫下反應1 h，于760 nm波長下測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=44.9C+0.012 4（R2=0.999 5），表明沒食子酸在1.00～9.00 μg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系。將茶葉供試品溶液及茶飲料稀釋10倍，精密吸取茶葉供試品溶液0.1 mL、茶飲料0.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測定吸光度，利用標準曲線法計算樣品溶液中多酚類成分的含量。

1.3.4 游離氨基酸類成分的含量測定參考彭真汾等［24］的游離氨基酸測定方法測定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中游離氨基酸類成分含量，并在其基礎上稍作修改。精確稱取甘氨酸標準品5.00 mg，置于25.00 mL的容量瓶中，加適量去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.2 mg/mL的甘氨酸標準品溶液。分別精密移取甘氨酸標準品溶液0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL于25 mL具塞試管中，加入磷酸緩沖液0.5 mL，茚三酮顯色劑0.5 mL，搖勻，置沸水浴中反應15 min，取出，冷水浴冷卻至室溫，轉移至25 mL容量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，靜置10 min后，以水代替標準品溶液作空白對照，于波長570 nm處測定吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=183.78C-0.212 2（R2=0.999 1），表明甘氨酸在1.60～5.60 μg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系。精密吸取茶葉供試品溶液0.2 mL、茶飲料1.0 mL，分別置于25 mL量瓶中，按上述方法測定吸光度，利用標準曲線法計算樣品溶液中游離氨基酸成分的含量。

1.3.5 多糖類成分的含量測定參考張媛媛等［25］的多糖測定方法測定不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多糖類成分含量，并在其基礎上稍作修改。精確稱取無水葡萄糖標準品2.50 mg，置于25 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL的無水葡萄糖標準品溶液。分別精密移取無水葡萄糖標準品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，加水至2.0 mL，再加入5 %的苯酚溶液1.0 mL，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，放置10 min，置于40℃水浴保溫15 min，取出后稀釋至刻度迅速冷卻到室溫，于490 nm處測得吸光度。以吸光度A為縱坐標，濃度C（mg/mL）為橫坐標繪制標準曲線，得回歸方程為A=71.815C+0.005 7（R2=0.999 5），表明無水葡萄糖在2.00～10.00 μg/mL濃度范圍內呈現良好的線性關系。精密吸取茶葉供試品溶液0.1 mL、茶飲料0.4 mL，分別置于10 mL量瓶中，按上述方法測定吸光度，利用標準曲線法計算樣品溶液中多糖類成分的含量。

1.3.6 DPPH自由基清除能力的測定通過測定體外DPPH自由基清除率來評價茶及茶飲料的抗氧化活性［26］。精確稱取DPPH 10.00 mg，置于100 mL棕色容量瓶中，無水乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.10 mg/mL的DPPH溶液。分別取茶葉供試品溶液及茶飲料0.1 mL，置于10 mL棕色容量瓶中，加入2.0 mL的DPPH溶液，無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，在室溫暗處反應30 min，于517 nm波長處測定吸光度Ai。同等條件下，對照組Aj為0.1 mL樣品和2.0 mL無水乙醇，空白組A0為0.1 mL無水乙醇和2.0 mL的DPPH溶液。測定完成后，按照如下公式計算不同濃度的茶葉供試品溶液及茶飲料對DPPH自由基的清除率。

1.4 數據處理

以上試驗均平行操作3次，并計算平均值，數據以SD表示。使用GraphPad prism 6.01軟件作圖分析各類成分含量，采用SPSS 26.0和RStudio軟件進行成分含量與抗氧化功能的相關性分析。

2 結果與分析

2.1 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中成分含量

按亞硝酸鈉-硝酸鋁法、福林酚法、苯酚-硫酸法、茚三酮比色法分別測定3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖類成分的含量，結果如圖1所示。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮類成分含量范圍分別為19.57～49.25 mg/g、0.19～0.22 mg/mL，其中未發(fā)酵茶及茶飲料中黃酮類成分的含量最高，分別為（49.25±0.78）mg/g、（0.22±0.00）mg/mL。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多酚類成分含量范圍分別為12.24～24.25 mg/g、0.43～0.83 mg/mL，其中含量最高的為未發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（24.45±0.98）mg/g、（0.83±0.02）mg/mL，而全發(fā)酵茶及茶飲料中多酚類成分含量最低。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中游離氨基酸類成分含量范圍分別為12.20～14.61 mg/g、0.05～0.07 mg/mL，含量最高的也為未發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（14.61±0.05）mg/g、（0.07±0.00）mg/mL。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中多糖類成分含量范圍分別為20.40～31.90 mg/g、0.15～0.19 mg/mL，而含量最高的為半發(fā)酵茶及茶飲料，分別為（31.90±0.40）mg/g、（0.19±0.01）mg/mL。

圖1 不同發(fā)酵程度茶（a）和茶飲料（b）中各類成分含量

從不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中化學成分含量變化趨勢可以看出，經過發(fā)酵后，茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量下降顯著，而多糖類成分卻顯著增加，這與文獻報道的發(fā)酵對茶中化學成分的影響結果一致［27］。茶中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量分別從49.25、24.45、14.61 mg/g減少至19.57、12.24、12.20 mg/g，而多糖類成分含量卻從20.40 mg/g增加至31.90 mg/g。在茶葉發(fā)酵制作過程中，隨著發(fā)酵程度的加深，其多酚類成分呈連續(xù)顯著性降低的趨勢，游離氨基酸類成分先顯著性降低后趨于平穩(wěn)水平，黃酮類呈先降低后稍微升高的趨勢，多糖類成分呈先增加后降低的趨勢。紅茶作為全發(fā)酵茶，發(fā)酵制作過程中未經過殺青操作，導致紅茶中多酚類成分發(fā)生酶促反應而氧化成為茶黃素、茶紅素等高分子性化合物，使得多酚類成分含量大大降低［28，29］。

2.2 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中DPPH自由基清除率

DPPH作為一種較穩(wěn)定的自由基，其紫紅色顯著特征在517 nm處具有最大吸收峰。分別測定3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中DPPH自由基清除率，結果如圖2所示。不同發(fā)酵程度的茶及茶飲料均具有較強的抗氧化能力，其DPPH清除率的大小順序為未發(fā)酵茶＞半發(fā)酵茶＞全發(fā)酵茶，并且DPPH清除率的大小順序與多酚類成分含量的順序相一致。

圖2 不同發(fā)酵程度茶和茶飲料中DPPH自由基清除率

2.3 不同發(fā)酵程度茶及茶飲料成分含量與抗氧化功能的相關性

分析不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中各類化學成分與DPPH自由基清除率的相關性，結果如表1所示。由表1可知，不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量都與抗氧化功能表現出良好的相關性，表明茶及茶飲料的抗氧化功能是由黃酮、多酚和氨基酸類成分共同作用的結果。其中，多酚類成分含量均與DPPH自由基清除率呈現顯著性正相關（P＜0.05），這與周金偉等［30］的研究結果一致，表明多酚類成分在茶及茶飲料抗氧化功能中起著決定性作用。

表1 不發(fā)酵程度茶及茶飲料中成分含量與DPPH自由基清除率的相關性

3 小結

本研究通過紫外-可見分光光度法對3種不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚、游離氨基酸、多糖類成分含量進行了測定并分析其與抗氧化能力的相關性。結果表明，未發(fā)酵茶中的多酚和游離氨基酸類成分的含量最高，而發(fā)酵茶中多糖類成分含量較高，黃酮類成分含量較低。不同發(fā)酵程度茶及茶飲料中黃酮、多酚和游離氨基酸類成分含量與抗氧化功能表現出良好的相關性，說明茶及茶飲料的抗氧化功能主要是由黃酮、多酚和氨基酸類成分共同作用的結果，其中多酚類成分在抗氧化功能中起決定性作用，此研究結果表明“成分-抗氧化”關聯(lián)的模式能夠較系統(tǒng)地對不同發(fā)酵程度茶及茶飲料進行比較分析，并為茶葉資源的綜合開發(fā)利用及茶飲料的品種選擇提供一定的科學參考。