多頻超聲波輔助提取山茱萸多糖工藝研究

姚瑞祺，胡家棟，王鋒，周博

（楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

山茱萸是山茱萸科（Cornaceae）山茱萸屬（MacrocarpiumNakai）山茱萸種（Macrocarpium offcinalis）的成熟果實(shí)，為中國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用歷史悠久，具有補(bǔ)益肝腎、調(diào)氣補(bǔ)虛的有益功效，中國(guó)第一部藥物典籍《神農(nóng)本草經(jīng)》中就有記載。山茱萸多糖是山茱萸果實(shí)重要的功效成分［1］，在體內(nèi)外免疫調(diào)節(jié)、預(yù)防及治療腫瘤、預(yù)防衰老、神經(jīng)保護(hù)和心肌保護(hù)等方面均效果顯著［2-4］，已成為科研工作者的研究熱點(diǎn)，具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。

超聲波輔助提取是一種有效的物理加工技術(shù)，可用于植物功能因子（如多糖、黃酮、多酚、原花青素）的提取制備，不僅提高產(chǎn)品得率，且能改善功能性質(zhì)，尤其是在蘋果［5］、大棗［6］、枸杞［7］等果蔬中效果更為明顯，展示了良好的應(yīng)用前景。超聲波頻率有單頻和多頻之分，目前研究較多的主要為單頻超聲波。多頻超聲波輔助提取是基于多個(gè)頻率的超聲波組合［8］，與傳統(tǒng)單頻超聲相比，能耗低，噪聲小，空化作用明顯，可直接破壞植物細(xì)胞的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，有助于細(xì)胞內(nèi)容物的滲出［9］，能顯著提高有效成分提取率，更有利于進(jìn)行科學(xué)研究和工業(yè)生產(chǎn)。

本研究探討多頻超聲波輔助對(duì)山茱萸多糖提取率的影響，通過正交試驗(yàn)確定超聲波輔助提取山茱萸多糖最佳工藝條件，以期為超聲波在山茱萸多糖工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

山茱萸，產(chǎn)自陜西省周至縣厚畛子林場(chǎng)；苯酚、濃硫酸、葡萄糖、活性炭、三氯甲烷、正丁醇、濃鹽酸、NaOH、石油醚、95%乙醇，均為分析純。

1.2 儀器

JM-15D-45/80型超聲波萃取儀器、JM-07D-28/45型超聲波萃取儀器、JM-20D-28型超聲波萃取儀器、JM-16D-80型超聲波萃取儀器、JM-16D-40型超聲波萃取儀器，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司；UV1901PCS型雙光束紫外可見光分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-D（III）型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；LXJ-II型離心沉淀機(jī)，上海醫(yī)用分析儀器廠；BSA423S-CW型分析天平，德國(guó)賽多利斯集團(tuán)；FB-10T型過濾瓶，Automatic Science（TIAN JIN）Instrument Co.，Ltd。

1.3 方法

1.3.1 山茱萸多糖提取液制備參考張茜等［10］的方法。山茱萸鮮果無(wú)損采摘，清洗，置于50℃水中浸泡15 min，取出去核，保留果肉并在50℃下烘干備用。將山茱萸干果粉碎，過40目篩。稱取適量山茱萸干果粉末，加入石油醚進(jìn)行脫脂處理，50℃回流4 h后加入一定量的水，在超聲波輔助條件下進(jìn)行提取，提取液分別用紗布和濾紙抽濾1次，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器在50℃下濃縮至提取液的1/5。在濃縮液中加入1/3的sevager試劑（正丁醇與三氯甲烷的比例為5∶2）進(jìn)行脫蛋白處理，充分振蕩15 min后置于分液漏斗中靜置，待分層明顯后收集上面水層，如此反復(fù)操作3次。在得到的水層溶液中按照5 g/L的用量加入活性炭進(jìn)行30 min的脫色處理，過濾活性炭，所得即為山茱萸多糖提取液。

1.3.2 山茱萸多糖制備參考郭耀東等［11］的方法。按照“1.3.1”的步驟制得山茱萸多糖提取液，在提取液中加入3倍體積95%乙醇，靜置5 h后離心，所得固體于50℃下干燥至恒重，即為山茱萸多糖。

1.3.3 山茱萸多糖含量測(cè)定

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。參考王彥平等［12］的方法。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，精密吸取7個(gè)濃度的葡萄糖供試液2.0 mL，分別加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻，置于40℃水浴中顯色30 min，取出置于冰水中快速冷卻以終止顯色反應(yīng)，然后置于室溫條件下10 min，于波長(zhǎng)488 nm處用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得出回歸方程。

2）換算因子計(jì)算。準(zhǔn)確稱取“1.3.2”中制得的山茱萸多糖10.0 mg，加水定容至100 mL。準(zhǔn)確吸取該山茱萸多糖稀釋液2.0 mL，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的步驟和方法加入苯酚、濃硫酸等試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，于波長(zhǎng)488 nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程得出山茱萸多糖中的葡萄糖含量C0，按式（1）計(jì)算換算因子f。

3）山茱萸多糖提取率的測(cè)定。利用“1.3.1”中得到的山茱萸多糖提取液，稀釋至合適濃度。精確吸取2 mL稀釋液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的步驟和方法加入苯酚、濃硫酸等試劑進(jìn)行顯色反應(yīng)，于波長(zhǎng)488 nm處測(cè)定吸光度，由回歸方程得出山茱萸提取液中的葡萄糖含量C，按式（2）計(jì)算山茱萸多糖提取率w。

式中，C為稀釋液的葡萄糖含量（mg/mL）；D為稀釋倍數(shù)；f為測(cè)算出的換算因子；m為稱取的山茱萸干果質(zhì)量（mg）。

1.3.4 超聲輔助浸提單因素試驗(yàn)

1）超聲頻率的單因素試驗(yàn)。固定料液比1∶6，浸提時(shí)間30 min，浸提溫度45℃，選擇超聲波頻率28、40、80、28/45、45/80 kHz，進(jìn)行山茱萸多糖的超聲波頻率單因素試驗(yàn)。利用苯酚-硫酸法測(cè)定山茱萸多糖提取率。以無(wú)超聲波輔助提取作為試驗(yàn)對(duì)照。

2）料液比的單因素試驗(yàn)。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提時(shí)間30 min，浸提溫度45℃，選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8，進(jìn)行山茱萸多糖的料液比單因素試驗(yàn)。利用苯酚-硫酸法測(cè)定山茱萸多糖提取率。以無(wú)超聲波輔助提取作為試驗(yàn)對(duì)照。

3）浸提溫度的單因素試驗(yàn)。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提時(shí)間30 min，料液比1∶6，選擇浸提溫度30、35、40、45、50、55℃，進(jìn)行山茱萸多糖的浸提溫度單因素試驗(yàn)。利用苯酚-硫酸法測(cè)定山茱萸多糖提取率。以無(wú)超聲波輔助提取作為試驗(yàn)對(duì)照。

4）浸提時(shí)間的單因素試驗(yàn)。固定超聲波頻率28/45 kHz，浸提溫度45℃，料液比1∶6，選擇浸提時(shí)間30、45、60、75、90、105、120 min，進(jìn)行山茱萸多糖的浸提時(shí)間單因素試驗(yàn)。利用苯酚-硫酸法測(cè)定山茱萸多糖提取率。以無(wú)超聲波輔助提取作為試驗(yàn)對(duì)照。

1.3.5 超聲輔助提取正交試驗(yàn)以超聲頻率、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間為因素，設(shè)計(jì)L9（34）正交試驗(yàn)，探討不同水平條件下這些因素對(duì)山茱萸多糖提取率的影響，并確定最佳浸提條件。因素與水平見表1。

表1 因素與水平

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。由圖1可知，葡萄糖含量在0.0～60.0 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系，吸光度為0.000～0.667，所得的回歸方程如下。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 單因素試驗(yàn)

2.2.1 超聲波頻率的單因素試驗(yàn)超聲波頻率對(duì)山茱萸多糖提取率的影響見圖2。由圖2可知，無(wú)論是單頻超聲波（28、40、80 kHz）還是雙頻組合超聲波（28/45、45/80 kHz），與無(wú)超聲波對(duì)照相比，超聲波輔助提取均能提升山茱萸多糖的提取率。3種單頻超聲波中，低頻率28 kHz超聲波提取率高于40 kHz和80 kHz，山茱萸多糖提取率達(dá)15.72%，較對(duì)照組提高了60.1%。2種雙頻超聲波提取率均高于單頻28 kHz，其中28/45 kHz組合高于45/80 kHz組合，達(dá)18.72%，較對(duì)照組提高了90.7%。

圖2 超聲波頻率對(duì)多糖提取率的影響

有研究表明，空化效應(yīng)是超聲波的一種主要效應(yīng)，與頻率有密切聯(lián)系。頻率較低的超聲波本身攜帶較強(qiáng)的能量，更容易直接作用于植物細(xì)胞，產(chǎn)生較為明顯的破壁效果和空化效應(yīng)［13］。但是，由于不同樣品的內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)存在差異，共振頻率也不相同。當(dāng)超聲波頻率與樣品的共振頻率接近時(shí)，樣品體系才能積極響應(yīng)超聲波能量，達(dá)到理想提取效果［14］。在本研究中，可能是因?yàn)?8/45 kHz雙頻組合超聲波更加接近于山茱萸提取液的共振頻率，所以較45/80 kHz雙頻組合和其他單頻超聲波，28/45 kHz雙頻組合超聲波提取效果較佳。

2.2.2 料液比的單因素試驗(yàn)料液比對(duì)山茱萸多糖提取率的影響見圖3。由圖3可知，與無(wú)超聲波輔助對(duì)照相比，在各料液比水平下，山茱萸多糖的提取率均明顯提高，表明在1∶3至1∶8料液比范圍內(nèi)，超聲波輔助提取能有效提高山茱萸多糖的提取率。另外，隨著溶液體積的增大，山茱萸多糖提取率呈逐漸升高直至平穩(wěn)的變化規(guī)律。當(dāng)料液比從1∶3變化至1∶6時(shí)，出現(xiàn)拐點(diǎn)；而料液比1∶6以后的提取率，變化不顯著。這可能是因?yàn)樵诔暡l率28/45 kHz，浸提時(shí)間30 min，浸提溫度45℃的條件下，1∶6的料液比已經(jīng)接近于最佳料液比條件，無(wú)需繼續(xù)增大溶液的比例。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.2.3 浸提溫度的單因素試驗(yàn)浸提溫度對(duì)山茱萸多糖提取率的影響見圖4。由圖4可知，在30～55℃內(nèi)，隨浸提溫度的升高，樣品和對(duì)照的提取率均呈逐漸增大的趨勢(shì)；與無(wú)超聲波輔助對(duì)照相比，山茱萸多糖提取率明顯提高。當(dāng)浸提溫度為50℃時(shí)，山茱萸多糖的提取率為17.28%，與對(duì)照相比，增加了59.8%。當(dāng)浸提溫度為55℃時(shí)，山茱萸多糖略有增加，但與50℃相比，差異不顯著。考慮到升高浸提溫度對(duì)山茱萸多糖的活性可能造成影響，以及增加能耗等問題，在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇50℃進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖4 浸提溫度對(duì)多糖提取率的影響

2.2.4 浸提時(shí)間的單因素試驗(yàn)浸提時(shí)間對(duì)山茱萸多糖提取率的影響見圖5。由圖5可知，在30～120 min內(nèi)，隨浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，樣品的提取率呈先增大后平穩(wěn)最后趨于減小的趨勢(shì)。在30～75 min時(shí)，山茱萸多糖提取率增加較為明顯；75～105 min時(shí)，提取率基本趨于穩(wěn)定；105～120 min時(shí)，提取率又有下降。而對(duì)于無(wú)超聲輔助的對(duì)照而言，30～75 min時(shí)，提取率增加明顯；75～120 min時(shí)，提取率趨勢(shì)基本趨于平穩(wěn)，無(wú)顯著變化。這可能是因?yàn)樵诔暡l率28/45 kHz，浸提溫度45℃，料液比1∶6的條件下，75 min的浸提時(shí)間已經(jīng)基本達(dá)到了最大提取率，若繼續(xù)延長(zhǎng)一小段浸提時(shí)間，提取率基本沒有變化；但若延長(zhǎng)至105 min以上時(shí)，可能過長(zhǎng)時(shí)間的超聲波作用，會(huì)導(dǎo)致部分山茱萸多糖發(fā)生降解，反而使得山茱萸多糖的提取率下降。因此，在后續(xù)的試驗(yàn)中，選擇75 min進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖5 浸提時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

2.3 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

4因素3水平正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。由表2和表3可以看出，在超聲頻率（A）、料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（D）4個(gè)研究因素中，超聲頻率（A）極顯著（P＜0.01），料液比（B）、浸提溫度（C）和浸提時(shí)間（D）均顯著（P＜0.05）。影響山茱萸多糖提取率因素的主次關(guān)系是超聲頻率（A）＞浸提溫度（C）＞浸提時(shí)間（D）＞料液比（B），最佳工藝組合為A2B2C3D3，最佳工藝條件為超聲頻率雙頻28/45 kHz，浸提溫度52℃，浸提時(shí)間80 min，液料比1∶6。在得出的最佳工藝條件下，平行進(jìn)行3次山茱萸多糖提取試驗(yàn)，得出山茱萸多糖提取率為18.92%，優(yōu)于表2中最高值，證實(shí)了正交試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 小結(jié)

與無(wú)超聲波輔助浸提相比，超聲波輔助提取能有效提高山茱萸多糖的提取率，且雙頻組合超聲波優(yōu)于單頻超聲波?；诔曨l率、料液比、浸提溫度和浸提時(shí)間等因素對(duì)山茱萸多糖提取率影響的研究，發(fā)現(xiàn)影響主次關(guān)系是超聲頻率（A）＞浸提溫度（C）＞浸提時(shí)間（D）＞料液比（B），最佳工藝組合為A2B2C3D3，最佳工藝條件為超聲頻率雙頻28/45 kHz，浸提溫度52℃，浸提時(shí)間80 min，液料比1∶6，山茱萸多糖提取率為18.92%。