西番蓮細(xì)胞懸浮系建立與培養(yǎng)條件優(yōu)化

鄺瑞彬，楊 敏，周陳平，楊 護(hù)，黃炳雄，魏岳榮

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640）

0 引言

西番蓮果實(shí)果汁酸甜，芳香可口，有很高的食用價(jià)值和藥用價(jià)值，具有廣闊的市場前景。西番蓮在中國南部廣泛種植，如廣東、廣西、福建、貴州、云南等西番蓮主產(chǎn)區(qū)2019年種植面積約達(dá)3.33萬hm2，產(chǎn)量近100萬t[1-2]。近年來中國西番蓮品種較單一，果實(shí)品質(zhì)有待提升，且莖基腐病、木質(zhì)化病毒病等病害多發(fā)，產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)受到影響，經(jīng)濟(jì)效益嚴(yán)重受損，限制了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[3-4]。傳統(tǒng)的育種技術(shù)通常周期較長，且其遺傳基礎(chǔ)狹窄，難度大，需要花費(fèi)大量的財(cái)力物力；運(yùn)用現(xiàn)代分子育種技術(shù)實(shí)現(xiàn)西番蓮性狀的定向改良，培育和創(chuàng)制優(yōu)質(zhì)抗逆的西番蓮新種質(zhì)是產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。

西番蓮有關(guān)組培再生與遺傳體系報(bào)道始于20世紀(jì)90年代末，前人報(bào)道的西番蓮遺傳轉(zhuǎn)化研究，多數(shù)基于葉片為外植體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系，其轉(zhuǎn)化率較低，再生體系頻率低或周期長，不利于后續(xù)創(chuàng)制基因改良品種[5-7]。胚性細(xì)胞懸浮系生長速率快，穩(wěn)定，分散性好，細(xì)胞形狀及細(xì)胞團(tuán)大小大致相同，在植物遺傳育種改良、原生質(zhì)體培養(yǎng)與雜交、次生代謝物培養(yǎng)等研究領(lǐng)域廣泛利用，如苜蓿、香蕉、水稻、白鶴芋、柳枝稷等[8-11]。目前，中國西番蓮的研究主要集中在其栽培技術(shù)及栽培生理、營養(yǎng)與加工品質(zhì)、病蟲害及其農(nóng)業(yè)防治技術(shù)等方面，但是關(guān)于西番蓮細(xì)胞工程，尤其是胚性細(xì)胞懸浮系的建立技術(shù)及等方面的研究尚未見報(bào)道[12-14]。本試驗(yàn)研究并優(yōu)化西番蓮愈傷組織及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件，形成高效、穩(wěn)定的西番蓮懸浮細(xì)胞系，為其建立遺傳轉(zhuǎn)化平臺(tái)和分子改良育種奠定重要基礎(chǔ)，對(duì)百香果產(chǎn)業(yè)持續(xù)發(fā)展有重要的意義。

本研究以西番蓮無菌苗為研究材料，研究西番蓮愈傷組織的誘導(dǎo)及建立細(xì)胞懸浮系，并開展細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)條件優(yōu)化的研究，為進(jìn)一步利用細(xì)胞工程和基因工程等生物育種研究提供良好的材料來源和技術(shù)方法。

1 材料和方法

1.1 西番蓮無菌苗制備

試驗(yàn)材料為食用西番蓮品種（‘臺(tái)農(nóng)1號(hào)’百香果），采摘當(dāng)年生植株開花后約60天健康無損的百香果果實(shí)，用75%酒精進(jìn)行表面消毒，在超凈工作臺(tái)用無菌切割刀將果實(shí)對(duì)半切開，用鑷子將果籽夾出，剔出黑色種子，將種子置于萌發(fā)培養(yǎng)基MG中，MG培養(yǎng)基：MS，30 g/L蔗糖、7.5～7.8 g/L瓊脂，pH 5.8。培養(yǎng)條件為26～28℃，暗培養(yǎng)至發(fā)芽后，進(jìn)行光/暗培養(yǎng)(2000 Lux，12/8h)，14天后備用。

1.2 愈傷組織的誘導(dǎo)和培養(yǎng)試驗(yàn)

在超凈工作臺(tái)上將上述西番蓮幼苗取出，置于干凈器皿上，分別切取幼苗的嫩葉、胚軸、嫩莖和幼根為外植體，約0.5 cm/段，分別置于裝有愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基(MC1)的培養(yǎng)皿中，28℃暗培養(yǎng)。每皿放置10段外植體，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。MC1：2.0mg/L2,4-D，0.2g/L Glutamine，20 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂，MS培養(yǎng)基，pH 5.8。觀察記錄不同外植體的愈傷生長情況與狀態(tài)等。

選取西番蓮胚軸為外植體材料，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中設(shè)置植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)的不同濃度處理進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)（表2）。每個(gè)處理每皿接種10段外植體，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，觀察不同處理的愈傷組織的發(fā)生時(shí)間、顏色、狀態(tài)和長勢等，計(jì)算出愈率[15]。

待愈傷組織變大至1 cm左右，去除褐化部分組織，將切約0.5 cm大小的半透明較疏松愈傷組織，置于繼代培養(yǎng)基(MC2)的三角瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3周繼代一次，連續(xù)繼代4～5代后，即可獲得米色或淡黃色、疏松、生長良好的西番蓮愈傷組織。MC2培養(yǎng)基：1.0 mg/L 2,4-D，0.2 g/L Glutamine，30 g/L蔗糖、15 g/L瓊脂，MS，pH 5.8。

1.3 懸浮細(xì)胞培養(yǎng)及條件優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.1 西番蓮懸浮細(xì)胞的培養(yǎng) 在超凈工作臺(tái)上，選取米色或淡黃色、顆粒疏松、生長旺盛的西番蓮愈傷組織，置于懸浮系液體培養(yǎng)基(ML1)的三角瓶中，置于往恒溫振蕩器上28℃、80 r/min暗培養(yǎng)。ML1培養(yǎng)基：1.0 mg/L 2,4-D，0.2 g/L Glutamine，30 g/L蔗糖、MS，pH 5.8。1周后，用滅菌的20目不銹鋼篩網(wǎng)過濾懸浮細(xì)胞，保留能通過20目篩網(wǎng)的懸浮細(xì)胞繼續(xù)液體培養(yǎng)；培養(yǎng)2周后，同上述操作進(jìn)行繼代培養(yǎng)。之后，每隔2～3周進(jìn)行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代3～4代后利用倒置光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)觀察，獲得比較穩(wěn)定均質(zhì)的西番蓮懸浮細(xì)胞系，可作為后續(xù)培養(yǎng)條件優(yōu)化試驗(yàn)的細(xì)胞材料。

1.3.2 西番蓮細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)條件優(yōu)化 培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)中以上述步驟建成的細(xì)胞懸浮系為研究材料，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為ML培養(yǎng)基：0.2 g/L Glutamine，0.05 mg/L kinetin，MS。設(shè)置不同 2,4-D水平(D0、D1、D2、D3、D4為0、1、2、3、4 mg/L)、蔗糖用量(S1、S2、S3、S4、S5、S6為20、30、40、50、60、70 g/L)、起始細(xì)胞用量(W1、W2、W3、W4、W5為2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL)、pH(5.2、5.5、5.8、6.1、6.4)。28℃、100 r/min暗培養(yǎng)2周，測定細(xì)胞鮮重，TTC法測定懸浮系細(xì)胞活性[16-17]，計(jì)算每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，取其平均值，根據(jù)單因素水平試驗(yàn)，確定因素水平進(jìn)行正交試驗(yàn)。培養(yǎng)2周，取樣測定懸浮細(xì)胞活性，計(jì)算懸浮細(xì)胞活性增長率，確定最優(yōu)培養(yǎng)基條件，并進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。

1.4 細(xì)胞生長曲線的測定

根據(jù)獲得細(xì)胞培養(yǎng)基最優(yōu)條件，進(jìn)行懸浮細(xì)胞生長曲線的測定試驗(yàn)，繼代后按照不同生長時(shí)間，每隔3天采樣，取2 mL細(xì)胞培養(yǎng)液，真空抽濾，測定細(xì)胞鮮重和懸浮系細(xì)胞活性，每個(gè)時(shí)期設(shè)置3次重復(fù)，計(jì)算懸浮細(xì)胞鮮重和細(xì)胞活性增長率。取適量懸浮細(xì)胞滴到載玻片中央，用光學(xué)顯微鏡觀察記錄對(duì)數(shù)生長時(shí)期西番蓮懸浮細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007軟件，數(shù)據(jù)顯著性分析采用SPSS 19.0軟件；分析顯著性水平(P＜0.05)，采用Duncan新復(fù)極差法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體及激素水平對(duì)誘導(dǎo)西番蓮愈傷組織的影響

將西番蓮幼苗不同外植體接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，7～14天后誘導(dǎo)出不同類型的愈傷組織（表1）。其中胚軸處理的出愈率最高(86.7%)，愈傷產(chǎn)生時(shí)間最早，第7天開始出現(xiàn)愈傷，幼根出愈率最低(40.0%)，誘導(dǎo)愈傷最慢，2周后開始產(chǎn)生愈傷。不同外植體產(chǎn)生的愈傷顏色和狀態(tài)也略有不同。其中胚軸產(chǎn)生的愈傷為半透明米白色，呈疏松顆粒狀，生長良好；嫩葉愈傷則是透明白色的粉顆粒狀，較疏松，但生長較慢；幼根愈傷組織則是黃褐色的較緊實(shí)塊狀物，生長較慢。嫩莖的出愈率僅次于胚軸，愈傷為米白色、塊狀、較疏松的，但是愈傷生長較緩慢。綜上，幼苗胚軸是比較適用于誘導(dǎo)愈傷組織的外植體。

表1 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的反應(yīng)

選取幼苗胚軸為外植體，研究不同激素水平對(duì)西番蓮愈傷組織的誘導(dǎo)的影響。結(jié)果如表2所示，2,4-D激素處理可誘導(dǎo)出透明或半透明米白色疏松的顆粒狀的愈傷組織，其中2,4-D為2.0 mg/L的處理出愈率最高(83.3%)，誘導(dǎo)時(shí)間最短，生長較快，不同時(shí)期的愈傷組織生長如圖1所示，約30天后即可獲得較為疏松的、狀態(tài)良好的愈傷。使用6-BA和NAA的處理中，誘導(dǎo)時(shí)間較長，出愈率較低(36.7%～43.3%)愈傷為黃褐色，少量長根，生長較慢。

表2 不同激素水平誘導(dǎo)西番蓮胚軸愈傷組織的反應(yīng)

圖1 西番蓮胚軸愈傷組織誘導(dǎo)不同時(shí)期生長狀況

綜上所述，西番蓮愈傷誘導(dǎo)的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素采用2.0 mg/L 2,4-D比較適合，此條件下，約1個(gè)月后產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的愈傷組織。

2.2 西番蓮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件的研究

2.2.1 單因素試驗(yàn) 優(yōu)化培養(yǎng)條件的單因素試驗(yàn)中，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，設(shè)置不同2,4-D水平、起始細(xì)胞用量、蔗糖用量和培養(yǎng)基pH條件，培養(yǎng)2周后，測定并計(jì)算細(xì)胞鮮重和懸浮系細(xì)胞活性增長率，結(jié)果如圖2～5所示。西番蓮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件在2,4-D濃度為0 mg/L時(shí)，細(xì)胞鮮重和活性增長極慢（圖2），隨著激素的增加呈上升趨勢，在2,4-D濃度為2.0 mg/L兩者達(dá)到最大值，隨后增至3.0和4.0 mg/L時(shí)，細(xì)胞鮮重和活性增長率逐漸降低。起始細(xì)胞用量水平也影響著細(xì)胞鮮重和活性增長率（圖3），兩者隨著起始細(xì)胞用量的增加呈上升趨勢，在8.0 mg/mL時(shí)為活性最高，用量增至10.0 mg/mL后，盡管鮮重增長率仍處于上升態(tài)勢，但活性增長率開始降低，細(xì)胞液由微黃色變?yōu)槲⒑稚?。培養(yǎng)基pH條件對(duì)細(xì)胞鮮重與活性影響不同，在pH為5.5時(shí)，細(xì)胞鮮重增長率最高，隨著pH的提高，增長率逐步降低；在細(xì)胞活性增長率中，pH 5.5和6.1時(shí)，出現(xiàn)2個(gè)增長峰，在pH 5.8時(shí)，增長率略有下降。培養(yǎng)基的蔗糖用量同樣影響細(xì)胞鮮重和活性的增長率，細(xì)胞鮮重和活性增長率在蔗糖用量為30 g/L時(shí)最高，隨著用量增加而降低，活性增長率在蔗糖用量為60 g/L時(shí)出現(xiàn)一個(gè)小高峰，蔗糖用量增至70 g/L時(shí)鮮重和活性增長率降低，細(xì)胞由微黃色轉(zhuǎn)至黃褐色。

圖2 不同2,4-D濃度對(duì)西番蓮懸浮細(xì)胞生長及活性的影響

圖3 不同細(xì)胞起始用量對(duì)西番蓮懸浮細(xì)胞生長及活性的影響

圖4 培養(yǎng)基pH對(duì)西番蓮懸浮細(xì)胞生長及活性的影響

圖5 蔗糖處理對(duì)西番蓮懸浮細(xì)胞生長及活性的影響

2.2.2 正交試驗(yàn) 綜合以上單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)置2,4-D水平、起始細(xì)胞用量、蔗糖用量和pH條件四個(gè)因素三個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)（表3），以確定西番蓮懸浮細(xì)胞培養(yǎng)最佳條件。正交試驗(yàn)結(jié)果如表4所示，影響西番蓮懸浮系細(xì)胞活性大小的順序是S＞P＞D＞W(wǎng)，即蔗糖用量＞pH＞2,4-D水平＞起始細(xì)胞用量，蔗糖用量是影響懸浮細(xì)胞活性的主要因素，起始細(xì)胞用量對(duì)細(xì)胞活性的影響為四者最小，最佳組合S1P3D2W2，即蔗糖濃度為30 g/L、pH6.1、2,4-D 2 mg/L和起始細(xì)胞用量為6.0 mg/mL。方差分析顯示蔗糖濃度(S)對(duì)懸浮細(xì)胞活性的影響顯著(P＜0.05)，其余因素未達(dá)顯著水平。

表3 L9(34)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

表4 不同因素組合對(duì)西番蓮細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

根據(jù)最佳組合進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和蔗糖濃度為30 g/L、pH 6.1、2,4-D 2.0 mg/L和起始細(xì)胞用量為6.0 mg/mL，培養(yǎng)2周后，細(xì)胞活性增長率為1030.9%，與正交試驗(yàn)結(jié)果相近。

2.3 西番蓮細(xì)胞懸浮系生長曲線

以上述獲得的最優(yōu)培養(yǎng)條件配置細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)懸浮系進(jìn)行培養(yǎng)，在不同時(shí)期觀察測試懸浮細(xì)胞的生長情況，結(jié)果如圖6所示。剛開始培養(yǎng)3天內(nèi)，細(xì)胞處于恢復(fù)階段，細(xì)胞鮮重和細(xì)胞活性變化不大，隨著培養(yǎng)時(shí)期的延長，細(xì)胞鮮重和細(xì)胞活性增長率逐漸提高，慢慢進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，在第6～12天增長較快速，其中懸浮細(xì)胞活性增長率最大值出現(xiàn)在第15天，隨后緩慢降低；而鮮重增長率最大值在第24天，隨后慢慢降低，營養(yǎng)物質(zhì)消耗加快，培養(yǎng)基開始變混濁，至30天時(shí)細(xì)胞液呈現(xiàn)微褐色，在培養(yǎng)瓶壁上可見衰敗細(xì)胞。本試驗(yàn)條件下，西番蓮懸浮細(xì)胞繼代最佳時(shí)期為12～18天，此時(shí)細(xì)胞活力最強(qiáng)且細(xì)胞鮮重較高。利用光學(xué)顯微鏡對(duì)對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察（圖7），結(jié)果顯示西番蓮懸浮細(xì)胞較為均勻一致，細(xì)胞呈近圓形或短柱形，多為微細(xì)胞團(tuán)和少量單細(xì)胞，細(xì)胞生長旺盛，細(xì)胞質(zhì)濃厚。

圖6 西番蓮懸浮細(xì)胞生長曲線

圖7 西番蓮懸浮細(xì)胞形態(tài)（對(duì)數(shù)生長期）

3 討論與結(jié)論

通過基因工程技術(shù)進(jìn)行植物遺傳改良，可望克服傳統(tǒng)育種的限制因素而達(dá)到果樹品種改良和實(shí)現(xiàn)快繁的目的，是近年果樹育種的發(fā)展趨勢。研究愈傷組織的誘導(dǎo)和細(xì)胞培養(yǎng)的適宜條件，是建立理想的遺傳改良受體——胚性細(xì)胞懸浮系的的前提。本試驗(yàn)研究并優(yōu)化西番蓮愈傷組織及細(xì)胞懸浮系培養(yǎng)條件，形成高效、穩(wěn)定的西番蓮細(xì)胞懸浮系，為西番蓮細(xì)胞工程及遺傳改良創(chuàng)制新種質(zhì)提供重要的基礎(chǔ)。

愈傷組織誘導(dǎo)效率受外植體種類、培養(yǎng)基組成及激素種類和水平、培養(yǎng)的條件等因素影響[18-20]。普遍采

用的外植體有胚軸、葉片、莖段、莖尖、根系、花器官等[17,21-22]。細(xì)胞分裂素和生長素是最常用的植物生長調(diào)節(jié)劑，生長素以2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)使用最為廣泛，細(xì)胞分裂素則6-芐氨基嘌呤(6-BA)為主，兼有苯基脲類衍生物(TDZ)[10-11,21-22]。培養(yǎng)基中的激素種類和濃度是影響細(xì)胞生長及狀態(tài)的重要因子，胚性組織愈傷組織優(yōu)于非胚性愈傷組織，胚性愈傷組織一般比較疏松、繁殖生長較快，繼代穩(wěn)定后可用于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞系[17,22]。本研究試驗(yàn)結(jié)果表明，西番蓮愈傷誘導(dǎo)的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素添加2.0 mg/L 2,4-D，誘導(dǎo)培養(yǎng)一個(gè)月左右產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的胚性愈傷組織，與前人在香蕉、白刺花等研究結(jié)果較為相似[23-24]。

穩(wěn)定的胚性愈傷組織細(xì)胞可用于培養(yǎng)懸浮細(xì)胞，懸浮細(xì)胞的生長受起始細(xì)胞用量、培養(yǎng)基激素、碳水化合物供給和pH等因素的影響[25]。與愈傷組織誘導(dǎo)相似，培養(yǎng)基中2,4-D用量影響懸浮細(xì)胞的生長與活性。研究表明2,4-D能促進(jìn)細(xì)胞生長，限制細(xì)胞進(jìn)一步分化，使細(xì)胞呈較穩(wěn)定脫分化狀態(tài)[10,26]。在本試驗(yàn)中，2,4-D為2.0 mg/L時(shí)，懸浮細(xì)胞增殖最快，活性最高，此時(shí)細(xì)胞質(zhì)豐富，形狀較為規(guī)整，細(xì)胞核大；增至4 mg/L時(shí)，細(xì)胞增殖速度降低，呈現(xiàn)微褐色，可能產(chǎn)生酚類物質(zhì)含量增多。起始細(xì)胞用量即接種量影響懸浮體系，因?yàn)橹参锛?xì)胞具有群聚性，在細(xì)胞初始密度與營養(yǎng)物比例合理，才能較好促進(jìn)細(xì)胞分裂生長，培養(yǎng)效果才能達(dá)到理想狀態(tài)[27-28]。本試驗(yàn)中，西番蓮起始細(xì)胞用量在低于4.0 mg/mL時(shí)，活性和鮮重增長率較緩慢，在8.0 mg/mL時(shí)為細(xì)胞活性最高，用量增至10.0 mg/mL后，活性增長率開始降低，死細(xì)胞增多，細(xì)胞液由微黃色變?yōu)槲⒑稚Ｓ诓ǖ萚10]在白鶴芋懸浮細(xì)胞在起始濃度0.3 g時(shí)較為適宜細(xì)胞的分裂和生長，過高和過低則起限制作用。蔗糖為懸浮細(xì)胞提供碳源營養(yǎng)，同時(shí)調(diào)節(jié)滲透壓高低。當(dāng)蔗糖濃度過低，不足以維持細(xì)胞的生長，細(xì)胞質(zhì)不夠豐富，體積較小，隨著蔗糖濃度的升高，培養(yǎng)液中的滲透壓過高也會(huì)影響懸浮細(xì)胞的生長[10,25]。在本試驗(yàn)中，培養(yǎng)液蔗糖濃度30 g/L時(shí)細(xì)胞鮮重和活性增長率為最高，隨著濃度增加，至70 g/L時(shí)細(xì)胞活性最低，由微黃色轉(zhuǎn)至黃褐色，與前人研究結(jié)果較為一致[10,29]。培養(yǎng)液pH同樣會(huì)影響細(xì)胞生長與狀態(tài)，本研究結(jié)果中pH為5.5～6.1時(shí)細(xì)胞鮮重和活性增長率比較高；鄒瑞等[16]發(fā)現(xiàn)諾麗懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液pH在4.5～5.0范圍內(nèi)生長最為旺盛；叢林曄等[30]認(rèn)為pH值為6.0的培養(yǎng)基中水稻懸浮細(xì)胞密度增長最快。

在本試驗(yàn)中，細(xì)胞培養(yǎng)優(yōu)化條件下，西番蓮懸浮細(xì)胞生長曲線呈“S”形。在繼代初期時(shí)，細(xì)胞生長延遲期出現(xiàn)在增殖培養(yǎng)的0～6天內(nèi)；較快速生長的細(xì)胞對(duì)數(shù)增長期則出現(xiàn)在第6天后，細(xì)胞鮮重和細(xì)胞活性增長率較高；隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加，雖然細(xì)胞不斷增值，細(xì)胞之間相互競爭逐漸減少的營養(yǎng)物質(zhì)；第15天后細(xì)胞活性增長率逐漸降低，第18～24天細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期，在24～30天后生長停緩、部分細(xì)胞褐化及凋亡。本試驗(yàn)條件下，西番蓮懸浮細(xì)胞繼代最佳時(shí)期為12～18天，此時(shí)細(xì)胞活力較強(qiáng)且細(xì)胞鮮重較高，可以維持懸浮細(xì)胞系生長的穩(wěn)定性。

本研究利用幼芽莖段誘導(dǎo)愈傷組織，建立了穩(wěn)定的西番蓮胚性細(xì)胞懸浮系。本研究結(jié)果認(rèn)為西番蓮愈傷誘導(dǎo)的外植體最佳選擇是幼苗胚軸，誘導(dǎo)培養(yǎng)基中激素適宜采用2.0 mg/L 2,4-D，約1個(gè)月后產(chǎn)生半透明米白色、疏松且生長狀態(tài)良好的愈傷組織。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)條件為基礎(chǔ)培養(yǎng)基和蔗糖濃度為30 g/L、pH 6.1、2,4-D 2.0 mg/L和起始細(xì)胞用量為6.0 mg/mL，此條件下建立的細(xì)胞懸浮系均勻一致，細(xì)胞密度大，細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞生長旺盛，能在短期內(nèi)提供大量懸浮細(xì)胞，為后續(xù)西番蓮利用懸浮系建立高效細(xì)胞工程及遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)體系提供良好的材料和技術(shù)基礎(chǔ)。