墨吉明對(duì)蝦高血糖激素基因FmCHH-I的分子鑒定和表達(dá)特征

雷易果，陳兆明，王 偉

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東 湛江 524088）

在甲殼動(dòng)物中，高血糖激素（Crustacean Hyperglycemic Hormone,CHH）是一類由眼柄中的X 器官-竇腺-復(fù)合體合成并分泌的神經(jīng)肽類激素[1]。CHH 家族神經(jīng)肽可分為I 型和II 型兩大類[2]，CHH-I型神經(jīng)肽有二硫鍵結(jié)構(gòu)，信號(hào)肽與成熟肽之間由一段前導(dǎo)肽（CHH precursor-related peptide，CPRP）連接，而CHH-II 型神經(jīng)肽結(jié)構(gòu)中的信號(hào)肽直接與成熟肽相連。CHH-I 型神經(jīng)肽僅包括經(jīng)典的CHH 類激素，主要參與調(diào)節(jié)血淋巴中的葡萄糖水平；CHHII 型神經(jīng)肽種類多樣，主要包括蛻皮抑制激素（Molt-inhibiting hormone，MIH）、大顎器官抑制激素（Mandibular organ-inhibiting hormone，MOIH）以及性腺抑制激素(Gonad-inhibiting hormone，GIH)[3]。CHH 家族神經(jīng)肽在甲殼動(dòng)物的脂質(zhì)代謝、蛻皮、應(yīng)激反應(yīng)、性腺發(fā)育等多個(gè)生理過程中均發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[4-5]。

我國是對(duì)蝦養(yǎng)殖大國，凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）是人工養(yǎng)殖的主要蝦種，但其種質(zhì)資源和親蝦嚴(yán)重依賴于進(jìn)口，當(dāng)前的對(duì)蝦行業(yè)還存在養(yǎng)殖環(huán)境惡化、種質(zhì)退化、病害頻發(fā)等問題[6]，這些都制約著對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。因此，開發(fā)凡納濱對(duì)蝦的替代或補(bǔ)充物種十分必要。墨吉明對(duì)蝦（Fenneropenaeus merguiensis）是淺海的暖水性蝦類，在我國東南沿海均有分布，若其人工養(yǎng)殖技術(shù)得以突破，可在一定程度上緩解目前存在的對(duì)蝦養(yǎng)殖問題[7]。在墨吉明對(duì)蝦基礎(chǔ)生物學(xué)方面已有一系列研究，史黎黎等[8]研究了墨吉明對(duì)蝦C 型溶菌酶基因的克隆及表達(dá)，周婷婷等[9]研究了胰島素樣促雄性腺激素基因（FmIAG）的分子特征，楊世平等[10]研究了丁香酚對(duì)墨吉明對(duì)蝦的麻醉效果，為其人工繁殖方法的開發(fā)提供了參考。但是，目前墨吉明對(duì)蝦的大規(guī)模人工養(yǎng)殖技術(shù)還有待開發(fā)和完善，其基礎(chǔ)生物學(xué)知識(shí)還比較匱乏。有關(guān)對(duì)蝦CHH 家族神經(jīng)肽的種類和功能，研究者已進(jìn)行了一些探索，但目前對(duì)于墨吉明對(duì)蝦的CHH 家族基因信息了解的還比較有限，眼柄中的X器官對(duì)CHH家族基因的調(diào)控作用以及CHH 家族神經(jīng)肽在墨吉明對(duì)蝦性腺發(fā)育中的功能演化仍有待于闡明。本研究利用分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)分析，獲得了墨吉明對(duì)蝦CHH-I基因（FmCHH-I）cDNA 序列，探究FmCHH-I的組織表達(dá)情況以及卵巢發(fā)育不同時(shí)期FmCHH-I的表達(dá)規(guī)律，分析生產(chǎn)上常用的單側(cè)眼柄切除法對(duì)FmCHH-I表達(dá)的影響，為探明FmCHH-I的功能奠定基礎(chǔ)，并為甲殼動(dòng)物CHH神經(jīng)肽的相關(guān)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)用墨吉明對(duì)蝦購自廣東省湛江市霞山區(qū)水產(chǎn)品批發(fā)市場(chǎng)，在室內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行暫養(yǎng)，系統(tǒng)由供氣系統(tǒng)、給回水系統(tǒng)、生物濾池等組成，調(diào)節(jié)室溫為26～28 ℃，每天定時(shí)定點(diǎn)定量投喂3次飼料，對(duì)水體進(jìn)行連續(xù)充氣并定期換水，維持良好水質(zhì)，觀測(cè)對(duì)蝦的活動(dòng)狀態(tài)是否異常。挑選活力較好的對(duì)蝦[體質(zhì)量(30.5±0.8)g，體長(zhǎng)(13.5±1.2)cm]進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

TransZol Up Plus RNA Kit（RNA 提取試劑盒）、TransScript One-Step gDNA Removal 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TransGenBiotech 公司，Primer ScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，SYBR PrimeScript RT-PCR Kit購自SangonBiotech公司，SMARTerTMRACE cDNA Amplification Kit 購自美國Clontech 公司，M5 HiPer Ptopo-TAVector、DH5α 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞菌種購自全式金生物試劑公司。

1.3 總RNA 提取與FmCHH-I 基因cDNA 序列全長(zhǎng)獲取

使用RNA 提取試劑盒，用Trizol 方法提取墨吉明對(duì)蝦總RNA。后通過反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

根據(jù)本課題組前期獲取的墨吉明對(duì)蝦轉(zhuǎn)錄組序列信息（GenBank 序列號(hào)ON646230）設(shè)計(jì)特異性引物(表1)，以墨吉明對(duì)蝦總RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，克隆出FmCHH-I基因的中間序列。采用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)3′RACE、5′RACE 特異性引物(表1)，利用RACE 技術(shù)擴(kuò)增FmCHH-I基因的5′-UTR 和3′-UTR，從而得到FmCHH-I的cDNA 全長(zhǎng)。PCR 產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，對(duì)目的片段進(jìn)行純化回收。通過連接、轉(zhuǎn)化后，按照實(shí)驗(yàn)操作，提取出菌液后，用此菌液作為模板，選用通用引物M13（-47）和M13（-48），進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物。分裝200 μL 菌液，送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers

1.4 生物信息學(xué)分析

通過NCBI 數(shù)據(jù)庫中BIASTX 在線程序(http://blast.Ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 對(duì)墨吉明對(duì)蝦FmCHH-I基因進(jìn)行同源性分析，利用SignalP 4.1 Server(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)該氨基酸序列的信號(hào)肽以及具體位置；利用在線軟件Expasy（http://web.expasy.org/compute_pi/) 預(yù) 測(cè)FmCHH-I 蛋白分子質(zhì)量和等電點(diǎn)；使用Clustal Omega（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）比對(duì)墨吉明對(duì)蝦與其他物種CHH基因的氨基酸序列；用MEGA 7.0鄰接（NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 FmCHH-I基因的組織表達(dá)

取健康墨吉明對(duì)蝦的腦、眼柄、鰓、肝胰腺、腸、肌肉、卵巢等7種組織，進(jìn)行RNA提取以及cDNA轉(zhuǎn)錄（方法見1.3）。用半定量RT-PCR方法檢測(cè)FmCHH-I在墨吉明對(duì)蝦不同組織中的轉(zhuǎn)錄情況。以EF1α 為內(nèi)參引物，RT-PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃3 min;95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min。

1.6 不同性腺發(fā)育時(shí)期FmCHH-I的表達(dá)

參考文獻(xiàn)[14]的方法，根據(jù)卵巢的外觀形態(tài)和性腺發(fā)育指數(shù)（GSI）區(qū)分墨吉明對(duì)蝦卵巢的不同發(fā)育階段。選擇處于卵巢成熟期與未發(fā)育的雌性墨吉明對(duì)蝦各3 尾，取其眼柄組織，進(jìn)行RNA 提取并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA 為模板，設(shè)計(jì)定量PCR 引物qFm-CHH-IF/ qFm-CHH-IR，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)，EF1α 為內(nèi)參引物（表1），目的基因和內(nèi)參基因各做3個(gè)平行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為95 ℃5 min；95 ℃15 s，55 ℃60 s，75 ℃5 s，40個(gè)循環(huán)。用2-△△CT法比較FmCHH-I基因在不同發(fā)育時(shí)期的眼柄組織中的表達(dá)量。利用SPSS 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，用Duncan 方法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

1.7 單側(cè)眼柄切除對(duì)FmCHH-I基因表達(dá)的影響

隨機(jī)取處于性腺成熟期的雌性墨吉明對(duì)蝦3尾，用鑷燙法切除單側(cè)眼柄。眼柄組織RNA提取和基因表達(dá)量檢測(cè)方法見1.6。比較切除及未切除眼柄的雌性墨吉明對(duì)蝦眼柄組織的CHH-I表達(dá)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FmCHH-I基因cDNA序列及其結(jié)構(gòu)

克隆得FmCHH-I基因的cDNA 全長(zhǎng)599 bp,其中5′非翻譯區(qū)（UTR）長(zhǎng)度為37 bp，3′-UTR 長(zhǎng)度為193 bp，開放閱讀框（ORF）長(zhǎng)為369 bp，編碼123 個(gè)氨基酸（圖1），其中在第1～20 位包含一個(gè)信號(hào)肽（圖2），隨后有一段由26個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽，末端的成熟肽具有74個(gè)氨基酸，無跨膜區(qū)。

圖1 墨吉明對(duì)蝦FmCHH-I基因的cDNA和氨基酸序列Fig.1 Amino acid and cDNA sequence of gene FmCHH-I in Fenneropenaeus merguiensis

圖2 墨吉明對(duì)蝦FmCHH-I蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)Fig.2 Signal peptide prediction of FmCHH-I in Fenneropenaeus merguiensis

2.2 FmCHH-I基因的理化性質(zhì)分析

經(jīng)預(yù)測(cè)，F(xiàn)mCHH-I基因編碼的蛋白分子質(zhì)量為13.5 ku，理論等電點(diǎn)為7.56。脂溶指數(shù)為93.44，不穩(wěn)定系數(shù)為64.58，被劃分為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性系數(shù)為0.157，最高親水位在第15 位為3.622，最高疏水位在第112 位為-1.789，即此蛋白為親水性蛋白（圖3）。

圖3 FmCHH-I蛋白疏水性Fig.3 Hydrophobicity for the FmCHH-I protein

2.3 FmCHH-I基因的同源性

FmCHH-I與GenBank 上部分物種的CHH-I同源序列比對(duì)結(jié)果見圖4。CHH-I 蛋白序列在不同甲殼動(dòng)物之間較為保守，F(xiàn)mCHH-I與對(duì)蝦科物種相似性較高，與斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）的同源性最高，與熱液口蝦（Rimicaris kairei）的同源性最低，序列中6個(gè)半胱氨酸殘基在不同物種間高度保守（圖4），系統(tǒng)發(fā)育分析（圖5）表明，F(xiàn)mCHH-I 與斑節(jié)對(duì)蝦聚在一起，與對(duì)蝦科物種聚為一支，與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦（Litopenaeus vannamei）、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）和刀額新對(duì)蝦（Metapenaeus ensis）等物種的CHH基因相似性較高。這些同源基因在所選物種氨基酸序列的后半部分均有相同的功能結(jié)構(gòu)域（圖5）。

圖4 墨吉明對(duì)蝦FmCHH-I蛋白的多序列比對(duì)Fig.4 Multiple sequence alignment of the FmCHH-I protein of Fenneropenaeus merguiensis

圖5 墨吉明對(duì)蝦FmCHH-I基因的系統(tǒng)進(jìn)化分析和蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)Fig.5 Phylogenetic analysis of FmCHH-I gene and protein structural domain prediction

2.4 FmCHH-I基因的表達(dá)特征

圖6 表明，F(xiàn)mCHH-I基因在墨吉明對(duì)蝦眼柄中表達(dá)量最高，在肝胰腺、腸道中表達(dá)量次之，在其他組織中無明顯表達(dá)或表達(dá)量極低。

圖6 墨吉明對(duì)蝦CHH-I的組織表達(dá)Fig.6 Tissue distribution of FmCHH-I

圖7(a)顯示，F(xiàn)mCHH-I基因在雌性對(duì)蝦卵巢未發(fā)育期的表達(dá)量與性腺成熟期的表達(dá)量無顯著差異。處于性腺成熟期的墨吉明對(duì)蝦在切除眼柄后，F(xiàn)mCHH-I基因的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于未切除眼柄對(duì)蝦的表達(dá)量（P＜0.01）（圖7(b)）。

圖7 性腺發(fā)育及切除眼柄對(duì)FmCHH-I表達(dá)量的影響Fig.7 Effect of gonad development and eyestalk abloation on FmCHH-I expression

3 討論

甲殼類高血糖激素（CHH）家族神經(jīng)肽參與調(diào)控甲殼動(dòng)物多種生理過程。許多學(xué)者研究了該超基因家族在甲殼動(dòng)物中的功能。在日本沼蝦(Macrobrachium nipponense)[11]、斑節(jié)對(duì)蝦(Penaeus monodon)[12]、羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）[13]等蝦蟹類中克隆出了CHH家族基因的序列，通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)，不同物種間該基因結(jié)構(gòu)存在差異，但總體保持著CHH家族基因功能結(jié)構(gòu)域的保守性，如均有信號(hào)肽、成熟肽中均有6個(gè)半胱氨酸殘基等，這些特征也被證明是CHH基因超家族的典型特征[14]。

本研究首次在墨吉明對(duì)蝦中克隆到CHH 家族神經(jīng)肽成員FmCHH-I基因的cDNA全長(zhǎng)，為599 bp，其中5′-UTR 37 bp，3′-UTR 193 bp，ORF為369 bp，編碼123 個(gè)氨基酸，在第1～20 位包含一個(gè)信號(hào)肽，中間有一個(gè)由26個(gè)氨基酸組成的前導(dǎo)肽，隨后是一段74個(gè)氨基酸組成的成熟肽，無跨膜區(qū)，含有6個(gè)半胱氨酸殘基，成熟肽中第12位甘氨酸殘基缺失，且有二鹽基切割位點(diǎn)KR，為I型CHH神經(jīng)肽的典型特征。

FmCHH-I 與CHH-II 蛋白氨基酸序列比對(duì)可見，CHH 神經(jīng)肽中半胱氨酸的含量高，且序列高度保守。系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，CHH-I基因在對(duì)蝦科中極為保守。FmCHH-I與斑節(jié)對(duì)蝦、凡納濱對(duì)蝦、日本囊對(duì)蝦和刀額新對(duì)蝦的CHH 同源基因均有很高的相似性，且序列中的半胱氨酸高度保守，6 個(gè)半胱氨酸殘基形成3 個(gè)二硫鍵結(jié)構(gòu)，起穩(wěn)定肽鏈空間結(jié)構(gòu)的作用。由此推斷，半胱氨酸在CHH神經(jīng)肽的生物學(xué)功能保守性方面扮演著重要角色。

本研究的半定量RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示，F(xiàn)mCHH-I基因在墨吉明對(duì)蝦眼柄中表達(dá)量最高，在肝胰腺、腸道中也有表達(dá)，這與羅氏沼蝦[13]的結(jié)果一致。FmCHH-I在眼柄中高表達(dá)可能是因?yàn)椋摶蛑饕裳郾械腦 器官竇腺復(fù)合體合成和釋放，再通過血淋巴傳遞到其他組織而發(fā)揮功能[17]。但Liu 等在凡納濱對(duì)蝦的組織中發(fā)現(xiàn)，CHH基因在其心臟中的表達(dá)量最高，推測(cè)可能由物種間的差異造成[15]。Sedl-Meier等[16]研究發(fā)現(xiàn)，CHH-I基因能調(diào)節(jié)甲基法尼脂的分泌，并影響肝胰腺分泌消化酶，調(diào)控中腸釋放淀粉酶，由此解釋了在肝胰腺、腸道中有CHH基因表達(dá)的現(xiàn)象。

研究發(fā)現(xiàn)，在一些物種中CHH-I在雄性精巢中的表達(dá)量遠(yuǎn)高于卵巢，由此推測(cè)CHH-I基因可能與雄性的發(fā)育密切相關(guān)[18]。對(duì)蝦養(yǎng)殖人員在生產(chǎn)上常常采取切除單側(cè)眼柄的方法促進(jìn)卵巢成熟。本研究中，雌性對(duì)蝦性腺成熟期FmCHH-I基因的表達(dá)量與未發(fā)育期無顯著差異；處于性腺成熟期的墨吉明對(duì)蝦在切除眼柄后，F(xiàn)mCHH-I基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于未切除眼柄對(duì)蝦中的表達(dá)量，說明CHH-I基因不僅與對(duì)蝦體內(nèi)血糖調(diào)節(jié)有關(guān)，還可能參與調(diào)控卵巢成熟過程。推測(cè)主要有兩方面原因。首先，在許多物種中CHH-I基因都有多種形式的可變剪切體或亞型，如美洲龍蝦(Homarus americanus)CHH-I基因就存在著CHH-A和CHH-B兩種形式，只有CHH-B對(duì)卵巢發(fā)育有促進(jìn)作用[19]。Kleijn 等[20]在雌性美洲龍蝦生殖周期的研究中發(fā)現(xiàn)，X 器官/竇腺復(fù)合體中的CHH-A只在卵黃發(fā)生前期表達(dá)量較高，CHH-B則在卵黃發(fā)生前期與成熟期表達(dá)量較高。而本研究的FmCHH-I基因可能為CHH-I型基因中的一個(gè)亞型，因此在雌性對(duì)蝦性腺成熟期與未發(fā)育時(shí)期的表達(dá)量無顯著差異。

此外，對(duì)蝦性腺成熟期需要積累大量營養(yǎng)物質(zhì)，這一時(shí)期對(duì)蝦所需要的營養(yǎng)物質(zhì)遠(yuǎn)高于生長(zhǎng)期[21]。切除單側(cè)眼柄的目的是為了刺激對(duì)蝦性腺發(fā)育和繁殖，而移除儲(chǔ)存和分泌CHH 神經(jīng)肽的X 器官/竇腺復(fù)合體后，對(duì)蝦體內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)不能及時(shí)吸收和轉(zhuǎn)移，當(dāng)體內(nèi)能量不足時(shí)血糖含量會(huì)下降，此時(shí)需要大量的CHH-I 蛋白發(fā)揮作用，刺激機(jī)體產(chǎn)生更多的葡萄糖，從而滿足自身能量需求。

綜上，本研究首次在墨吉明對(duì)蝦中克隆得到FmCHH-I基因的cDNA 全長(zhǎng)，多序列比對(duì)、系統(tǒng)進(jìn)化和基因表達(dá)分析表明，F(xiàn)mCHH-I基因的功能較為保守，在對(duì)蝦的發(fā)育過程中可能起調(diào)節(jié)血糖以及參與性腺發(fā)育調(diào)控的作用，但此作用過程還需進(jìn)一步的研究驗(yàn)證。