凡納濱對(duì)蝦含酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域血藍(lán)蛋白的免疫功能

張 銳，王子昂，湯俊宇，楊林蔚

（1.廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/ 現(xiàn)代生化中心，廣東 湛江 524088；2.中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院有害生物控制與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510275；3.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室（珠海），廣東 珠海 519000；4.廣東海洋大學(xué)深圳研究院，廣東 深圳 518108）

血藍(lán)蛋白是節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物血淋巴中的一種含銅呼吸蛋白，在氧運(yùn)輸、能量貯存、滲透壓維持、蛻皮和表皮固化調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮重要功能。研究發(fā)現(xiàn)，甲殼動(dòng)物的血藍(lán)蛋白也有免疫活性，參與機(jī)體對(duì)多種病原的免疫防御[1-3]。在NCBI Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中，每個(gè)甲殼類物種往往有多個(gè)序列有明顯差異的血藍(lán)蛋白編碼基因，表明其體內(nèi)的血藍(lán)蛋白可能以多個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物混合物的形式出現(xiàn)，從而擁有結(jié)構(gòu)和功能上的多樣性。因此，有必要從單一基因的角度去探討血藍(lán)蛋白的免疫功能。

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeus vannamei)是全球主要養(yǎng)殖蝦種之一，也是研究無(wú)脊椎動(dòng)物免疫的重要對(duì)象。從NCBI 上公布的凡納濱對(duì)蝦基因組中共發(fā)現(xiàn)16個(gè)血藍(lán)蛋白基因，其蛋白結(jié)構(gòu)域均擁有典型氨基端的Hemocyanin_N結(jié)構(gòu)域和羧基端的Hemocyanin_C結(jié)構(gòu)域，其中的一種血藍(lán)蛋白還含有酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域（Tyrosinase-domain），與其他血藍(lán)蛋白家族成員存在明顯差異，故命名為含酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域血藍(lán)蛋白（Tyrosinase-domain containing hemocyanin，TDCH）。本研究克隆該蛋白的基因tdch，分析其在對(duì)蝦抗副溶血弧菌免疫中的作用，為深入探索蝦類血藍(lán)蛋白功能以及病害防治提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 蝦和病原體

凡納濱對(duì)蝦（約10 g）購(gòu)自深圳某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，在約28 ℃富含氧氣的地下水(鹽度2.0) 中適應(yīng)一周。正式實(shí)驗(yàn)前，對(duì)5%的對(duì)蝦進(jìn)行隨機(jī)抽樣，采用文獻(xiàn)[4-5]方法，通過(guò)PCR 檢測(cè)，確保沒(méi)有副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和白斑綜合征病毒（White Spot Syndrome Virus,WSSV）污染。副溶血弧菌和白斑綜合征病毒按照文獻(xiàn)[6-7]方法制備。

1.2 凡納濱對(duì)蝦tdch基因片段的擴(kuò)增及生物信息學(xué)

從凡納濱對(duì)蝦基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)獲得tdch基因序列[8]，以凡納濱對(duì)蝦鰓組織cDNA 為模板，利用引物對(duì)TDCH-ORF-F/R（表1）擴(kuò)增獲得tdch編碼區(qū)序列。PCR 反應(yīng)體系（20 μL）：Premix Taq 10 μL，ddH2O 7.5 μL，cDNA 模板0.5 μL，上下游引物各1 μL。PCR 產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)、目的條帶切膠回收，連接至pMD-19T，轉(zhuǎn)化至DH-5α 感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，陽(yáng)性菌送至天一輝遠(yuǎn)有限公司廣州測(cè)序部測(cè)序。獲得tdch序列后，運(yùn)用SMART 網(wǎng)站（http://smart.embl-heidelberg.de/）分析tdch的結(jié)構(gòu)域，運(yùn)用AlphaFold 預(yù)測(cè)tdch的三維結(jié) 構(gòu)[9]。用Clustal W 1.8 將tdch序列與Genbank 數(shù)據(jù)庫(kù)中凡納濱對(duì)蝦其他血藍(lán)蛋白序列進(jìn)行比對(duì)。采用MEGA 5.0 軟件通過(guò)鄰接法（Neighbor-joining）進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，具體參數(shù)如文獻(xiàn)[10-11]。

表1 引物名稱及序列Table 1 Primers and their sequences

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

取健康凡納濱對(duì)蝦，分別取肌肉、肝胰腺、鰓、胃、表皮、觸角、心臟、腸、幽門盲囊、眼柄和神經(jīng)索，樣品剪碎至約2 mm，置于RNAlater（Invitrogen）中，血淋巴離心后用RNAlater 重懸。置4 ℃下12 h，放于-80 ℃冰箱保存，用于分析tdch組織分布。每組樣品中為15 尾蝦的組織混合物。每個(gè)組織至少取3組。

取凡納濱對(duì)蝦700 尾，隨機(jī)分為7 組，每尾蝦分別于第二腹肢基部位置用1 mL 的胰島注射器分別注射0.1 μg/μL 脂多糖（LPS）、0.1 μg/μL Poly (I:C)、2.0×103cfu/μL 金黃色葡萄球菌（Staphhylococcu saureus）、2.0×103cfu/μL 副溶血弧菌、2.0×103cfu/μL黑曲霉菌（Aspergillus niger）、2.0×104拷貝/μL WSSV 各50 μL，對(duì)照組注射同劑量磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=7.2）[12]。在注射0、4、12、24、48、72、96 h時(shí)，分別隨機(jī)選取蝦6 尾，采集其鰓和血細(xì)胞，置于RNALater 存 儲(chǔ)。RNA 提 取、cDNA 合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR 安照文獻(xiàn)[13]的方法進(jìn)行。根據(jù)tdch基因開(kāi)放閱讀框的保守區(qū)，用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物qRT-TDCH-F、qRT-TDCH-R，對(duì)照組EF-1α基因（Genbank 登錄號(hào)：GU136229）為管家基因，引物如表1。qRT-PCR 反應(yīng)體系（10 μL）：引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Mix 5 μL，ddH2O 2.5 μL，cDNA 0.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃4 min；95 ℃20 s、60 ℃30 s、72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min，95 ℃15 s。用2-ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，用GraphPad Prism 7 軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.4 RNA干擾

用T7 RiboMAX?Express RNAi System 試劑盒（Promega）依照文獻(xiàn)[14]及試劑盒說(shuō)明書(shū)合成tdch基因特異的dsRNA，陰性對(duì)照為綠色熒光蛋白基因（GFP）的dsRNA，所用引物見(jiàn)表1。取體質(zhì)健康、大小均一的凡納濱對(duì)蝦（約5 g）暫養(yǎng)后，將dsRNA用PBS 稀釋后，向?qū)ξr的第二腹肢基部注射50 μL 1 μg/μL dsRNA。注射后48 h 隨機(jī)取蝦6 尾于RNAlater 中，-80 ℃保存，用于檢測(cè)dsRNA 對(duì)對(duì)蝦tdch的沉默效果。另外，在注射dsRNA 48 h 后，用1×106cfu/mL 的副溶血弧菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行人工感染，每間隔2 h 統(tǒng)計(jì)對(duì)蝦死亡數(shù)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)算3次檢測(cè)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。采用t檢驗(yàn)分析兩組數(shù)值間差異的顯著性。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間存活率差異的顯著性則用Mantel-Cox log-rankχ2計(jì)算。

2 結(jié)果

2.1 凡納濱對(duì)蝦tdch結(jié)構(gòu)

克隆得凡納濱對(duì)蝦tdch（GenBank 登錄號(hào)：ROT60816.1）的編碼區(qū)長(zhǎng)1 656 bp，編碼551 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量為63.37 ku，理論等電點(diǎn)為7.74。在1～17 氨基酸處含有一個(gè)信號(hào)肽，21～147 氨基酸處含有一個(gè)Hemocyanin_N 結(jié)構(gòu)域，308～410 氨基酸處含有一個(gè)酪氨酸酶（Tyrosinase）結(jié)構(gòu)域，413～522 氨基酸處含有一個(gè)Hemocyanin_C結(jié)構(gòu)域（圖1、2）。

圖1 凡納濱對(duì)蝦tdch及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.1 Tdch of Litopenaeus vannamei and its deduced amino acid sequence

2.2 凡納濱對(duì)蝦tdch與其他血藍(lán)蛋白的差異分析

將凡納濱對(duì)蝦tdch的mRNA 與其對(duì)應(yīng)的DNA進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)tdch編碼區(qū)序列含有兩個(gè)外顯子及一個(gè)內(nèi)含子。tdch氨基端含有一個(gè)Hemocyanin_N結(jié)構(gòu)域，羧基端含有一個(gè)Hemocyanin_C 結(jié)構(gòu)域，符合血藍(lán)蛋白家族的結(jié)構(gòu)特征，與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中凡納濱對(duì)蝦其他血藍(lán)蛋白不同的是，其結(jié)構(gòu)域中間含有典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域（圖3）。構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(1 000 倍bootstrap)表明，凡納濱對(duì)蝦tdch單獨(dú)聚為一支，在進(jìn)化關(guān)系上遠(yuǎn)離凡納濱對(duì)蝦其他血藍(lán)蛋白，提示tdch可能與以往研究的血藍(lán)蛋白不同，為新的血藍(lán)蛋白家族成員（圖4(A)）。凡納濱對(duì)蝦tdch與其他物種血藍(lán)蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，凡納濱對(duì)蝦tdch與斑節(jié)對(duì)蝦（Penaeus monodon）、日本囊對(duì)蝦（Marsupenaeus japonicus）的血藍(lán)蛋白聚為一個(gè)分支，親緣關(guān)系較為接近，提示凡納濱對(duì)蝦tdch在進(jìn)化較為保守（圖4(B)）。

圖2 凡納濱對(duì)蝦tdch的結(jié)構(gòu)Fig.2 Schematic diagram of tdch of Litopenaeus vannamei

圖3 凡納濱對(duì)蝦不同血藍(lán)蛋白的mRNA序列與對(duì)應(yīng)的DNA序列比對(duì)結(jié)果及相應(yīng)的結(jié)構(gòu)Fig.3 Schematic diagram of different L.vannamei hemocyanins and the comparison results of their mRNA sequences and corresponding DNA sequences

圖4 凡納濱對(duì)蝦不同血藍(lán)蛋白(A)及甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白（B）的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic trees of different hemocyanins in Litopenaeus vannamei(A)and TDCH in crustacean(B)

2.3 凡納濱對(duì)蝦TDCH的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

經(jīng)預(yù)測(cè)凡納濱對(duì)蝦TDCH 蛋白的三維結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，包含4處β折疊（圖5）。

2.4 凡納濱對(duì)蝦tdch基因組織表達(dá)分析

圖6 表明，tdch在凡納濱對(duì)蝦各組織中均有表達(dá)，在眼柄、肌肉、觸角和腸道中表達(dá)量較高，在肝胰腺、表皮、心臟和幽門盲囊中表達(dá)量較低。

圖6 凡納濱對(duì)蝦tdch的組織表達(dá)Fig.6 Expression of tdch in different tissues of Litopenaeus vannamei

2.5 凡納濱對(duì)蝦tdch時(shí)序表達(dá)

2.5.1 凡納濱對(duì)蝦免疫后tdch在血細(xì)胞中的表達(dá)變化 經(jīng)6 種免疫原刺激后，凡納濱對(duì)蝦tdch在血細(xì)胞中表達(dá)量均顯著上升。其中，副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、白斑綜合征病毒和Poly (I:C) 刺激后，tdch在血細(xì)胞中4 h被極顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別上調(diào)151.8、194.8、621.8 和1 254.9倍，并且在4～96 h 一直保持在高表達(dá)狀態(tài)。黑曲霉菌刺激后，tdch在血細(xì)胞中24 h 被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比上調(diào)2.8倍，并在48 h表達(dá)量驟升，與對(duì)照組相比上調(diào)322.6倍，并且在48～96 h一直保持在高表達(dá)狀態(tài)。LPS 刺激下，tdch在血細(xì)胞中24 及72 h 被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別上調(diào)3.5倍、1.8倍（圖7）。

圖7 不同免疫原感染后凡納濱對(duì)蝦tdch在血細(xì)胞中的表達(dá)Fig.7 Expression of tdch in hemocyte in Litopenaeus vannamei challenged by different immunogens

2.5.2 凡納濱對(duì)蝦免疫后tdch在鰓組織中的表達(dá)變化 圖8可見(jiàn)，經(jīng)副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌、白斑綜合征病毒、LPS、Poly (I:C)或PBS 刺激后，凡納濱對(duì)蝦tdch在鰓組織中表達(dá)變化較小，在副溶血弧菌和黑曲霉菌刺激24 h時(shí)被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別上調(diào)2.1 倍和2 倍；在金黃色葡萄球菌刺激12 h時(shí)被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比上調(diào)1.7 倍，刺激4 h 及24～96 h 時(shí)表達(dá)量沒(méi)有影響；在白斑綜合征病毒刺激48 h 及96 h 時(shí)被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別上調(diào)2.4倍和1.9倍；在LPS刺激24 h及72 h時(shí)被顯著激活（P＜0.01），與對(duì)照組相比分別上調(diào)1.9倍和1.9倍；Poly(I:C)刺激對(duì)tdch在鰓組織中的表達(dá)沒(méi)有影響。

圖8 不同免疫原感染后凡納濱對(duì)蝦tdch在鰓組織的表達(dá)Fig.8 Expression of tdch in gill of Litopenaeus vannamei challenged by different immunogens

2.6 凡納濱對(duì)蝦tdch在副溶血弧菌感染中的作用

圖9 表明，經(jīng)RNAi 后，在血細(xì)胞中tdch被成功敲降，與對(duì)照組相比敲降效率達(dá)到70%。圖10 表明，注射dsRNA 48 h 后的對(duì)蝦經(jīng)副溶血弧菌攻毒后，與GFP dsRNA 對(duì)照組相比，TDCH dsRNA 組的存活率顯著下降（Mantel-Cox log-rankχ2=8.159，P=0.043 ＜0.05），表明tdch的表達(dá)增強(qiáng)凡納濱對(duì)蝦對(duì)副溶血弧菌的抗性。

圖9 Tdch在血細(xì)胞中的敲降效率Fig.9 Knockdown efficiency of tdch in hemocyte

圖10 Tdch抑制副溶血弧菌感染Fig.10 Tdch inhibits Vibrio parahaemolyticus infection

3 討論

在凡納濱對(duì)蝦中，TDCH 蛋白氨基端的Hemocyanin_N 結(jié)構(gòu)域和羧基端Hemocyanin_C 結(jié)構(gòu)域與其他血藍(lán)蛋白類似[15]，TDCH 還含有一個(gè)典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域。酪氨酸酶是一種黑色素通路中的結(jié)合銅離子的酶，具有酚氧化酶活性，參與體液免疫反應(yīng)、損傷修復(fù)等重要生理活動(dòng)[16-17]。有研究表明，血藍(lán)蛋白可能是在大約55億年前由酚氧化物酶進(jìn)化而來(lái)[18]。目前有研究證實(shí)血藍(lán)蛋白可能保留有酚氧化酶的活性，例如在軟體動(dòng)物中，散蓋大蝸牛（Helix aspersa）的血藍(lán)蛋白在SDS 作用下能夠表現(xiàn)出酚氧化酶活性[19]；也有報(bào)道稱凡納濱對(duì)蝦的血藍(lán)蛋白也具有酚氧化酶活性，并且還具有細(xì)胞凝集和細(xì)菌凝集活性[20-21]，在外界病原菌刺激下能夠發(fā)揮類似酚氧化酶的活性參與免疫防御。血淋巴酚氧化酶活力包括血藍(lán)蛋白酚氧化酶活力和血細(xì)胞酚氧化酶原釋放的酚氧化酶活力，當(dāng)機(jī)體受到外界病原刺激下，在一定時(shí)間內(nèi)血細(xì)胞釋放的酚氧化酶不足以支撐機(jī)體的需要，此時(shí)血藍(lán)蛋白會(huì)表現(xiàn)出酚氧化酶活性參與免疫反應(yīng)增強(qiáng)甲殼動(dòng)物免疫防御能力[22]。而本研究中發(fā)現(xiàn)TDCH含有一個(gè)典型的酪氨酸酶結(jié)構(gòu)域，提示TDCH 可能是對(duì)蝦血藍(lán)蛋白混合物酚氧化酶活性的一個(gè)來(lái)源，這還需要進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

利用AlphaFold 預(yù)測(cè)凡納濱對(duì)蝦TDCH 的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白主要以α螺旋結(jié)構(gòu)為主，與已知節(jié)肢動(dòng)物血藍(lán)蛋白的結(jié)構(gòu)組成一致[23]。在對(duì)蝦中，眼柄與一系列生理功能高度相關(guān)，包括卵巢成熟、蛻皮、葡萄糖穩(wěn)態(tài)，這些都與對(duì)蝦的生長(zhǎng)高度相關(guān)[24]。Tdch在對(duì)蝦的眼柄中含量最豐富(圖4)，提示tdch可能是內(nèi)分泌調(diào)節(jié)相關(guān)基因之一。此外，血細(xì)胞[25]、鰓[26]和肝胰腺[27]是對(duì)蝦中重要的免疫相關(guān)組織。本研究中，這些組織中含有豐富的tdch，提示tdch可能與凡納濱對(duì)蝦的先天免疫有關(guān)。在副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌、白斑綜合征病毒、LPS 和病毒模擬物Poly(I:C)的刺激下，tdch在對(duì)蝦血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平有顯著和持久的升高（圖5）?？紤]到合成的dsRNA 類似物Poly(I:C)是病毒感染過(guò)程中發(fā)生的一種分子模式，tdch在Poly(I:C)和白斑綜合征病毒刺激過(guò)程中上調(diào)，表明tdch可能對(duì)包括DNA 病毒和RNA 病毒在內(nèi)的病毒感染做出反應(yīng)。值得注意的是，在副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌和白斑綜合征病毒感染后4 h，tdch在血細(xì)胞中均顯著增加，提示tdch可能在感染早期就對(duì)細(xì)菌和病毒感染產(chǎn)生了反應(yīng)。而黑曲霉菌刺激24 h 后tdch在血細(xì)胞中的表達(dá)才顯著增加，提示tdch可能在真菌感染的早期反應(yīng)不明顯，主要在中晚期起作用。tdch在鰓組織中的反應(yīng)弱于血細(xì)胞中，這可能是由于tdch需要在特定的組織環(huán)境中起作用。存活率實(shí)驗(yàn)表明，敲降tdch能提高副溶血弧菌的敏感性，提示tdch在機(jī)體對(duì)抗副溶血弧菌感染中發(fā)揮重要作用。有研究表明，凡納濱對(duì)蝦血藍(lán)蛋白HMC可被副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌及白斑綜合征病毒激活，促進(jìn)p38及c-Jun磷酸化，調(diào)控下游抗菌肽的表達(dá)，參與抗菌與抗病毒感染[28]。然而凡納濱對(duì)蝦tdch是通過(guò)何種途徑發(fā)揮抗弧菌作用還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究表明，tdch在各組織中均有表達(dá)，在眼柄中表達(dá)量最高；副溶血弧菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉菌、白斑綜合征病毒、LPS及Poly(I:C)刺激均可引起凡納濱對(duì)蝦tdch在血細(xì)胞中表達(dá)量上調(diào)，敲降tdch可提高副溶血弧菌的敏感性，表明tdch在機(jī)體對(duì)抗副溶血弧菌感染中發(fā)揮重要作用。本研究可為甲殼動(dòng)物血藍(lán)蛋白類群的免疫功能研究提供新思路。