微波消解-電感耦合等離子體質(zhì)譜法對蜂膠中六種重金屬元素的測定分析

唐娟

（華東冶金地質(zhì)勘查研究院，安徽 合肥 230088）

蜂膠是一種由蜜蜂采集加工的具有芳香氣味的膠黏性物質(zhì)，天然蜂膠中含有豐富的黃酮類和多酚類物質(zhì)，以及脂肪酸酯類、芳香酸酯類和氨基酸類化合物[1-2]。作為一種純天然的藥物原料，蜂膠具有極高的藥用價值，被廣泛用于藥品和保健品生產(chǎn)中，具有滋陰健脾、解毒消腫、收斂生肌等功效，在提高免疫力，促進(jìn)創(chuàng)口愈合，預(yù)防心血管疾病、糖尿病等方面具有顯著的藥理作用，有著“紫色黃金”“健康守護(hù)神”之美譽[3-6]。

蜂膠的化學(xué)成分復(fù)雜，因植物區(qū)系、蜜蜂種類、區(qū)域自然環(huán)境和氣候而異，同時由于目前蜂膠產(chǎn)品的生產(chǎn)以人工為主，存在對工藝過程控制不當(dāng)?shù)囊蛩?，?dǎo)致蜂膠產(chǎn)品中的重金屬含量積累，甚至出現(xiàn)重金屬含量超標(biāo)，不僅影響其藥用價值，而且使用重金屬含量超標(biāo)的蜂膠，也會給身體帶來諸多危害[7]。

目前，關(guān)于重金屬的檢測方法主要有原子吸收分光光度計（AAS）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）法和電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法[8-11]。ICP-MS因其檢出限低，靈敏度高，測量范圍數(shù)量級廣（10-12～10-3），可以一次性快速測量多種元素，穩(wěn)定性好等優(yōu)勢，在食品、藥品和農(nóng)產(chǎn)品類的生物質(zhì)樣品的微量和痕量重金屬檢測中應(yīng)用十分廣泛[12-15]。由于蜂膠中所含有的樹脂、蜂蠟、花粉、揮發(fā)性酚、酯類等有機(jī)物多達(dá)上百種，基體復(fù)雜，因此對蜂膠進(jìn)行有效的前處理是準(zhǔn)確測定其重金屬含量的前提和基礎(chǔ)條件[16]。傳統(tǒng)的蜂膠樣品溶解前處理采用有機(jī)溶劑萃取稀釋的方式進(jìn)行，但是有機(jī)溶劑在ICP-MS的高溫等離子焰炬下易形成有機(jī)碳沉淀在采樣錐孔或離子透鏡表面，對測量的準(zhǔn)確性產(chǎn)生嚴(yán)重影響[17]。而通過微波消解，在微波的作用下采用硝酸-過氧化氫體系將基體中的有機(jī)大分子氧化降解為小分子，從而極大程度地改善了基體效應(yīng)。

本文建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法測定蜂膠中六種重金屬砷、銅、鉛、鉻、鎘、鎳含量的方法，并將其運用于測定馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司的蜂膠原膠的重金屬含量，并與相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行比較，從而為其質(zhì)量控制和安全性研究提供參考。

1 實驗部分

1.1 試劑和儀器

HNO3（優(yōu)級純），北京化學(xué)試劑研究所；H2O2（優(yōu)級純），天津東部化工廠。六種單元素標(biāo)準(zhǔn)溶液（As、Cu、Pb、Cr、Ni、Cd，濃度均為1 000 μg/mL，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心）。生物質(zhì)成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07604，購買于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心。

Thermo X2型等離子體發(fā)射質(zhì)譜儀（ICP-MS）（美國賽默飛世爾科技有限公司）；XT 9916型微波消解儀（上海新拓儀器有限公司）；FD1-A50型冷凍式干燥機(jī)（上海勝衛(wèi)儀器電子科技有限公司）。

1.2 實驗過程

1.2.1 六種元素混標(biāo)的配制

配制一組含有六種元素混標(biāo)溶液，用于樣品中六種重金屬元素含量的測定，使用濃度為2%的稀HNO3溶液將1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋，其中As、Cu、Pb、Cr、Ni稀釋濃度為0 ng/m、1 ng/m、5 ng/m、10 ng/m、50 ng/m、100 ng/mL，Cd稀釋濃度為0 ng/m、0.1 ng/m、0.5 ng/m、1 ng/m、5 ng/m、10 ng/mL。

1.2.2 蜂膠樣品的前處理過程

稱取新鮮原膠約200 g，在冷凍式干燥機(jī)中除去水分，用實驗室制藥專用的破碎機(jī)將蜂膠打碎后裝入自封袋，貼標(biāo)簽編號后，冷藏儲存。

取上述試樣0.600 0 g，置于微波消解儀專用的PTFE消解管內(nèi)，并加入10 mL的HNO3和H2O2的混合液，將消解管置于微波消解儀中，按照設(shè)定的升溫執(zhí)行微波消解程序，得到澄清的消解液。對消解液進(jìn)行趕酸處理后，用2%的硝酸溶液，轉(zhuǎn)移至50 mL的容量瓶中定容，搖勻待測。

1.2.3 儀器工作條件

ICP-MS的射頻功率設(shè)置為1 450 W，采樣深度10 mm，冷卻氣流量13.5 L/min，霧化氣流量1.00 L/min，輔助氣流量0.90 L/min，六種重金屬元素的測定質(zhì)量數(shù)分別為52Cr、58Ni、65Cu、75Zn、111Cd、208Pb。測量采用跳峰掃描的方式，掃描次數(shù)為40次，測量一共重復(fù)3次，最終給出測定結(jié)果為3次重復(fù)測量的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件的優(yōu)化

2.1.1 消解時間優(yōu)化

在微波消解時，消解時間一般指升溫到既定溫度后直到消解程序結(jié)束這個階段的時長。消解時間的長短對于樣品消解是否充分存在影響，從而對于樣品中重金屬元素含量的準(zhǔn)確測定也存在影響。為了確定最佳的微波消解時間，我們采用了四個不同消解時間的消解程序（表1）對生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07604進(jìn)行樣品前處理，隨后檢測六種重金屬元素的含量，各元素含量變化隨消解溫度變化結(jié)果如圖1所示。從圖1我們不難發(fā)現(xiàn)，隨著微波消解時間的增加，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中六種重金屬元素的測定值均上升，當(dāng)微波消解時間從10 min增加至30 min后，含量測定值基本趨于穩(wěn)定，且消解30 min的測定結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中六種重金屬元素含量的認(rèn)定值最為接近。因此，微波消解時間確定為30 min。

圖1 元素測定值隨消解時間變化示意圖Fig.1 Schematic diagram of the change of element measured value with digestion time

表1 不同消解時間的四組微波消解程序Tab.1 Four groups of microwave digestion procedures of different digestion time

2.1.2 消解溫度優(yōu)化

微波消解過程中，消解溫度也是影響最終消解結(jié)果的一個非常重要的因素，微波消解溫度對于消解反應(yīng)速率具有較為顯著的影響，從而影響最終的消解程度。在消解溫度優(yōu)化實驗中，我們同樣采用四個不同消解溫度的消解程序（表2）對生物成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07604進(jìn)行樣品前處理，隨后檢測六種重金屬元素的含量，各元素含量隨消解溫度變化結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 07604中六種重金屬元素的測定值隨消解溫度的升高而上升，當(dāng)微波消解溫度增加至190℃以后，其含量測定值的增長逐漸變得緩慢，并且在200℃時趨于穩(wěn)定，且與該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的認(rèn)定值結(jié)果吻合，因此，將本次實驗的消解溫度優(yōu)化值確定為200℃。

圖2 元素測定值隨消解溫度變化示意圖Fig.2 Schematic diagram of the change of element measured value with digestion temperature

表2 不同消解溫度的四組微波消解程序Tab.2 Four groups of microwave digestion procedures of different digestion temperature

2.1.3 過氧化氫-硝酸配比優(yōu)化

在微波消解中，我們主要應(yīng)用消解液對樣品進(jìn)行消解。消解液由過氧化氫和硝酸按照一定配比混合，具有強烈的氧化性，能夠使生物樣品中的有機(jī)化合物大分子發(fā)生斷鍵，氧化分解成小分子，從而使樣品中的重金屬離子被釋放出來。為了進(jìn)一步探究樣品前處理過程中的最佳實驗條件，設(shè)置過氧化氫和硝酸體積量如表3所示。然后采用不同的消解液對GBW 07604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行消解后上機(jī)檢測，測得不同過氧化氫-硝酸體積比的消解液消解樣品的元素含量測定值變化如圖3所示。根據(jù)圖3的分析，將最佳的過氧化氫-硝酸的組成確定為過氧化氫2 mL和硝酸8 mL。

圖3 元素測定值隨過氧化氫-硝酸體積比變化示意圖Fig.3 Schematic diagram of the change of the measured value of elements with the volume ratio of hydrogen peroxide to nitric acid

表3 消解液過氧化氫和硝酸的體積量Tab.3 Volume of hydrogen peroxide and nitric acid in digestion solution

2.2 實驗方法的有效性

實驗方法的有效性主要通過對試驗的檢出限、定量限以及實驗方法的精密度進(jìn)行判斷。檢出限的測定方法是對一組12個樣品空白進(jìn)行檢測，以其測定結(jié)果的三倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為其檢出限，10倍標(biāo)準(zhǔn)偏差為其定量限，精密度則是對標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行多次重復(fù)試驗（n=12），從而得到其RSD值作為其精密度的判斷依據(jù)，實驗結(jié)果如表4所示。

表4 檢出限、定量限和精密度實驗結(jié)果（GBW 07604）Tab.4 Test results of detection limit，quantitative limit and precision(GBW 07604)

從以上對GBW 07604標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的檢出限、定量限和精密度的實驗結(jié)果可以看出，其檢出限和測定下限均符合儀器分析的要求，且均小于被測試樣的各元素重金屬含量，RSD值也滿足測定要求，因此，認(rèn)為該方法可以有效運用于蜂膠中重金屬含量的檢測。

2.3 蜂膠中重金屬含量的檢測和健康風(fēng)險評估

建立并優(yōu)化方法后，我們采用該方法對馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司的四種蜂膠原膠樣品（A、B、C、D）進(jìn)行了六種重金屬元素的檢測，通過樣品前處理將塊狀的粉膠破碎為粉礫狀，加入消解液并對四種蜂膠試樣分別進(jìn)行了微波消解，隨后上機(jī)檢測，得到四種蜂膠原膠樣品中的重金屬含量如表5所示。

表5 四種蜂膠原膠樣品中六中重金屬元素的含量Tab.5 Contents of six heavy metals in four propolis samples

為了評估重金屬攝入量，我們在本研究中引入了估算每日攝入量（EDI）來評估重金屬攝入量。在本研究中，EDI等于攝入的蜂膠金屬濃度乘以一個人的每日攝入量。根據(jù)WHO的相關(guān)建議，上述六種元素的成人每日最大攝入量為As≤0.5 mg/d，Cu≤10 mg/d，Pb≤0.5 mg/d，Cr≤1.0 mg/d，Cd≤0.1 mg/d，Ni≤2.0 mg/d。我們按照每日攝入蜂膠100 g來計算，則食用四種蜂膠的六種元素的EDI分別為As：0.013～0.041 mg，Cu：0.18～0.54 mg，Pb：0.032～0.14 mg，Cr：0.043～0.12 mg，Cd：0.004～0.01 mg，Ni：0.09～0.21 mg，均遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于每日最大攝入量限值。因此，每日攝入100 g蜂膠不會對消費者的健康構(gòu)成影響，但不應(yīng)忽視每日總飲食消費量的貢獻(xiàn)。

3 結(jié)論

蜂膠的藥用價值很高，在藥品和保健品的生產(chǎn)中應(yīng)用十分廣泛。蜂膠原膠中的重金屬含量的高低，不僅決定了蜂膠本身的使用安全性，也極大地影響和制約了其用作各種藥品和保健品等加工產(chǎn)品的食用安全性，因此，對蜂膠原膠的重金屬含量開展嚴(yán)格的檢測具有重要的意義。

本文建立了電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）法對蜂膠原膠中的六種重金屬銅、鉛、鋅、鉻、鎘、鎳的含量進(jìn)行了檢測。樣品前處理通過冷凍干燥、破碎的方法將塊狀蜂膠制成粉顆礫狀，再用過氧化氫-硝酸在微波消解儀內(nèi)進(jìn)行微波消解。隨后在ICP-MS上用建立好的方法按照儀器分析操作的流程，依次對標(biāo)準(zhǔn)曲線、樣品空白、生物成分分析國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品和待測試樣進(jìn)行檢測。通過條件優(yōu)化實驗，確定了實驗最佳條件為采用過氧化氫-硝酸體積比為2∶8的消解液，在升溫至200℃下消解30 min得到供上機(jī)檢測的消解液，通過對空白實驗和重復(fù)性測試確定了該方法的檢出限、定量限和精密度，評價了該方法的有效性。在此基礎(chǔ)上，將該方法運用于蜂膠試樣中六種重金屬的檢測中，并使用估計每日攝入量（EDI）評估了通過食用蜂膠攝入重金屬的風(fēng)險。研究結(jié)果證實了食用蜂膠不會產(chǎn)生健康風(fēng)險。