覆盆子水提取液對鮮切蘋果褐變的抑制作用

劉靜潤，郝文，彭勇*，石晶盈，劉佩，王海波，李林光

（1.山東農業(yè)大學食品科學與工程學院，山東 泰安 271000；2.山東省果樹研究所，山東 泰安 271000）

蘋果采摘后經過分級、清洗、整修、去皮、切分、保鮮、包裝等工序得到鮮切蘋果，鮮切蘋果食用方便，受到廣大消費者的青睞，在鮮切果蔬行業(yè)占有重要地位[1-2]。近年來，國內市場對鮮切果蔬產品的需求日益增長，促進了鮮切果蔬行業(yè)的發(fā)展。然而鮮切蘋果的加工工序和操作方法不當會帶來許多問題，比如在加工過程中經過去皮、切分，鮮切蘋果的褐變速度加快、貨架期縮短，同時口感風味及其營養(yǎng)價值降低，這成為制約我國鮮切果蔬產業(yè)發(fā)展的障礙之一[3]。

鮮切蘋果極易發(fā)生褐變，影響其感官品質和營養(yǎng)價值，同時也影響著人們的可接受度。研究發(fā)現(xiàn)，酶促褐變是引起鮮切果蔬褐變的關鍵因素，對于鮮切蘋果亦是如此。鮮切蘋果中的酚類物質與氧氣接觸，在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）的作用下發(fā)生氧化反應，生成大量的醌類物質，并迅速聚合形成黑色物質[4-7]。此外，苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）和過氧化物酶（peroxidase，POD）等酶也與褐變的發(fā)生密不可分[8]。孫程旭等[9]研究發(fā)現(xiàn)，PPO和POD的活性與果蔬的褐變度直接相關。張玉華等[10]發(fā)現(xiàn)采用乙醇熏蒸與高氧預處理有利于鮮切蘋果的保鮮，防止其營養(yǎng)物質的快速流失，延長其貨架期。此外，檸檬酸、半胱氨酸、精氨酸等也能降低其pH值，與PPO活性中心的銅離子相互作用從而抑制褐變的發(fā)生[1，3，11]。但是，這些物質存在一定的安全風險，人們更傾向于天然、安全的褐變抑制劑。

植物提取物來源廣泛，特別是藥食同源植物，天然、安全，從植物提取物中篩選抗褐變的物質是研究方向之一。胡燕等[12]發(fā)現(xiàn)洋蔥提取液能夠有效地抑制鮮切蓮藕PPO活性，維持鮮切蓮藕的感官品質，有利于鮮切蓮藕的保鮮，延長其貯藏期限。葡萄籽提取物、苦蕎幼苗提取物也能抑制PPO活性，減輕桃、土豆等的褐變[13-14]。覆盆子（Rubus idaeus L.）是薔薇科懸鉤子屬的木本植物，其果實含有豐富的營養(yǎng)物質，并含有水楊酸、酚酸等各類活性成分，可以作為藥材入藥。程丹等[15]發(fā)現(xiàn)覆盆子在藥用方面具有明顯的效果，其含有的黃酮、生物堿等化學成分有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等功效。但是，目前關于覆盆子水提取液抑制鮮切果蔬褐變的研究較少。

覆盆子具有抑制鮮切蘋果褐變的效果，可能與覆盆子中存在的酚類和黃酮類等活性物質相關。為了進一步確定覆盆子中含有的酚類、黃酮類物質成分，采用通過高效液相色譜分析覆盆子水提取液中酚類和黃酮類成分組成，通過篩選研究覆盆子水提取液對蘋果褐變的抑制效果、覆盆子水提取液抑制鮮切蘋果褐變的處理技術以及抗褐變的機理，旨在為鮮切果蔬的褐變控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

蘋果：市售，采購后立即保存在冷庫中（2℃～4℃）備用。選擇形狀大小相似（200g左右，直徑12cm～14cm）、無損害的新鮮蘋果為試驗材料；覆盆子、當歸、人參、菊花、陳皮、桔梗、黃精、金銀花、松花粉：北京康德瑞琪食品有限公司。

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試劑

硼酸、硼砂、愈創(chuàng)木酚、鄰苯二酚、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、沒食子酸、無水乙醇（均為分析純）：天津市凱通化學試劑有限公司；兒茶素、原兒茶酸、表兒茶素、綠原酸、蘆丁、阿魏酸、金絲桃苷、根皮苷（均為標準品）：上海源葉生物科技有限公司；無水碳酸鈉（分析純）：上海國藥集團；甲醇（色譜級）：美國Sigma公司。

1.2.2 儀器

UV-5100B紫外可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；GL-20G-II高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；HH-4A恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；AL204萬分之一天平：瑞士梅特勒-托利多集團；ZFG40制冰機：黃石東貝制冷有限公司；DW-HL388超低溫冰柜：中科美菱低溫科技有限責任公司；LC-20A高效液相色譜儀：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 植物提取物的制備

將覆盆子及其他8種藥食同源植物樣品在60℃烘干24 h后過120目篩，保存在避光干燥環(huán)境下。取過篩后的植物粉末與蒸餾水以1∶20（g/mL）的比例浸提2 h，在8 000 r/min離心20 min。取上清液即植物提取物，保存在4℃下備用。

1.3.2 蘋果凍粉制備

為了更好地研究覆盆子水提取液對蘋果褐變的抑制作用，將蘋果于200 mg/L次氯酸鈉溶液中浸泡消毒 2 min，晾干、去皮，切片（5 mm厚度，5 mm～10 mm大?。┖笱杆儆靡旱M行冷凍、研磨，研磨后的粉末裝入自封袋中，于-80℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2.1 最佳浸提時間的確定

取蘋果液氮凍粉樣品2 g于離心管中，迅速加入2 mL水混勻，快速加入覆盆子水提取液2 mL，按1.3.1的步驟，浸提時間設定為 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h，蒸餾水處理作為空白對照組（CK），常溫下貯藏10 h，觀察記錄褐變程度（1分～5分打分，1為沒有褐變，5分為嚴重褐變），每個處理重復3次。

1.3.2.2 最佳處理倍數(shù)的確定

取蘋果液氮凍粉樣品2 g于離心管中，迅速加入2 mL 水混勻，分別加入稀釋 0、2、5、10、20、50、100 倍的覆盆子水提取液2 mL混勻，蒸餾水處理作為空白對照組（CK），常溫下貯藏10 h，觀察記錄褐變程度，每個處理重復3次。

1.3.2.3 最佳處理時間的確定

取蘋果液氮凍粉樣品2 g于離心管中，迅速加入2 mL水混勻，分別在稀釋2倍的浸提液中浸泡1、3、5、10、15、30 min，以蒸餾水處理作為空白對照組（CK），常溫下貯藏10 h，觀察記錄褐變程度，每個處理重復3次。

1.3.3 鮮切蘋果處理過程及生理指標測定

蘋果去皮、切片之后，放入蒸餾水中處理10 s，然后按照優(yōu)選的最佳處理工藝，放入覆盆子水提取液處理，以蒸餾水處理（CK）和0.5%VC處理作為對照，考察覆盆子水提取液對鮮切蘋果生理指標的影響。

1.3.3.1 PPO活性的測定

PPO活性測定采用鄰苯二酚法，參考紀淑娟等[16]的方法并略有改動。1 g蘋果樣品中加入0.05 g聚乙烯聚吡咯烷酮（polyvinylpolypyrrolidone，PVPP）和 3 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH值為6.8），搖勻后離心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液。取0.75 mL上清液、1.5mL磷酸緩沖液、0.75mL兒茶酚溶液（10mmol/L）組成3 mL反應體系，于475 nm波長下測定吸光值。以每分鐘內吸光值增加0.01為一個酶活力單位，結果以U/g表示。

1.3.3.2 POD活性的測定

POD活性測定參考王偉玲等[17]方法并略有改動。1 g蘋果樣品中加入0.05 g PVPP和3 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 值為 6.0），搖勻后離心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液。將56 μL愈創(chuàng)木酚、100 mL磷酸緩沖溶液（0.1 mol/L，pH 值為 6.0）和 38 μL 過氧化氫（30%）溶液混合組成反應液。取0.2 mL上清液與2.8 mL反應液混合，于470 nm波長下測定吸光值。以每分鐘內吸光值變化0.01為一個酶活力單位，結果以U/g表示。

1.3.3.3 PAL活性的測定

PAL活性的測定方法參考張麗等[18]方法并稍作修改。將5 g蘋果樣品添加到含有0.05 mol的β-巰基乙醇和0.1 g聚乙烯吡咯烷酮的硼酸鈉緩沖液（5 mL，4℃，0.2 mol/L，pH 值為 8.8）中，搖勻后離心（10 000 r/min，4℃）15 min，得上清液即為PAL粗酶液。

將0.8 mL粗酶液、2 mL硼酸鹽緩沖液（0.2 mol/L，pH值為8.8）和1 mL的L-苯丙氨酸（0.02 mol/L）混合，在40°C下反應30 min后，加入0.2 mL 6 mol/L的HCl終止反應，用分光光度計在290 nm波長下測定吸光度。以每分鐘內吸光值變化0.01為一個酶活力單位，并按如下公式計算酶活性。

式中：A290nm為吸光度變化值；Vt為酶提取液總體積，mL；WF為鮮重，g；Vs為測定時取用酶液體積，mL；t為反應時間，min。

1.3.3.4 總酚含量的測定

總酚含量測定用福林酚法并稍作改動。取1 g蘋果樣品，加入4 mL丙酮（70%），混勻，避光條件下浸提3 h后離心（10 000 r/min，4℃）15 min，得到上清液。取0.5 mL上清液加入0.5 mL福林酚，搖勻。室溫下靜置4 min，加入0.5 mL的Na2CO3溶液（10%）和9 mL水，室溫避光2 h，于725 nm波長下測定吸光值，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，標準曲線方程為y=0.092 3x-0.082 8。測定結果以每千克鮮樣中沒食子酸當量表示（g/kg FW）。

1.3.3.5 DPPH自由基清除活性的測定

1 g蘋果樣品中加入5 mL乙醇（95%），充分混勻后離心（10 000 r/min，4℃）15 min得上清液。吸取0.5 mL待測液加入到2.5 mL DPPH乙醇溶液（0.05 mmol/L）中，室溫避光反應10 min，于517 nm下測定吸光值，按如下公式計算DPPH自由基清除率。

式中：AB為空白樣品的吸光值；AE為樣品的吸光值。

1.3.4 覆盆子水提取液成分的高效液相色譜分析

采用配有紫外檢測器的高效液相色譜儀用于確定覆盆子水提取液成分的組成。色譜條件：C18色譜柱，流動相A為2%甲酸，流動相B為乙腈，用前過0.45 μm濾膜，脫氣，梯度洗脫，流速 0.8 mL/min，進樣量 10 μL，檢測波長280 nm。配制標準工作液注入高效液相色譜儀檢測，以標準品對應峰面積進行定量分析。

取2 g樣品粉末加入20 mL的無水乙醇，渦旋振蕩混勻，超聲輔助萃取后離心（10 000 r/min，4℃）10 min得上清液，上清液通過0.45 μm濾膜過濾，然后存于棕色進樣瓶中，進行高效液相色譜分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)用Origin進行處理，以平均值±標準差表示。使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 植物提取物的篩選

不同的植物提取物對蘋果褐變的抑制作用如圖1所示。

圖1 9種植物提取物對鮮切蘋果褐變程度的影響Fig.1 Effect of 9 plant extracts on browning degree of fresh-cut apple

植物提取物富含活性成分，是控制鮮切果蔬褐變的選擇之一。由圖1可知，通過對9種藥食同源植物進行篩選發(fā)現(xiàn)，與CK相比，覆盆子水提取液對鮮切蘋果褐變具有較好的抑制效果。常溫下放置1 h后，覆盆子處理組顏色最淺。此外，當歸、桔梗、金銀花也有一定的抑制褐變效果。因此，本研究選擇覆盆子水提取液作為鮮切蘋果的褐變抑制劑，探究其處理技術及抑制鮮切蘋果褐變的機制。

2.2 最佳處理技術優(yōu)化

不同影響因素對蘋果褐變的抑制效果如圖2所示。

圖2 不同影響因素對蘋果褐變的抑制效果Fig.2 Inhibitory effects of different factors on apple browning

如圖2A所示，與CK相比，不同覆盆子水提取液浸提時間，對蘋果漿液褐變的抑制效果有一定的影響。浸提時間為2.0 h的覆盆子水提取液抑制褐變效果最佳，褐變度僅為1.5，本研究確定最佳浸提時間為2.0 h。

如圖2B所示，與CK相比，除稀釋100倍外其他稀釋倍數(shù)下的覆盆子水提取液對蘋果漿液褐變均具有一定的抑制效果。稀釋5倍的覆盆子水提取液抑制褐變效果最佳。此外，稀釋0倍、2倍的覆盆子水提取液以及0.5%VC抑制褐變效果也較好。因此，本研究確定覆盆子水提取液稀釋5倍為最佳濃度。

如圖2C所示，與CK相比，不同的處理時間下，覆盆子水提取液對蘋果漿液褐變均有一定的抑制效果。其中，覆盆子水提取液處理10 min對蘋果漿液褐變的抑制效果最佳。因此，本研究確定覆盆子水提取液對鮮切蘋果的最佳處理時間為10 min。

2.3 覆盆子水提取液對鮮切蘋果各項生理指標的影響

覆盆子水提取液對鮮切蘋果褐變度、PPO活性、POD活性、PAL活性、DPPH自由基清除率和總酚含量的影響如圖3所示。

圖3 覆盆子水提取液對蘋果各項生理指標的影響Fig.3 Effects of raspberry water extract on physiological indexes of apple

如圖3A所示，與CK相比，0.5%VC和覆盆子水提取液都能抑制鮮切蘋果的褐變，且覆盆子水提取液抑制褐變效果更好。

PPO是酶促褐變的關鍵酶，能夠催化酚類物質形成醌，進而引起褐變[19]。如圖3B所示，隨著貯藏時間延長，CK鮮切蘋果的PPO活性逐漸下降。覆盆子水提取液和0.5%VC處理組樣品在貯藏過程中PPO活性也逐漸下降，并且顯著低于CK，0.5%VC處理抑制褐變的效果要優(yōu)于覆盆子水提取液處理組，這與胡燕等[12]的研究結果相似。因此，覆盆子水提取液可以通過抑制鮮切果蔬PPO活性從而抑制酶促褐變的發(fā)生[20]。

POD是果蔬中常見的一種氧化還原酶，可以清除果蔬中多余的自由基，維持機體自由基的動態(tài)水平；另一方面，POD會在一定條件下催化酚類物質生成醌類化合物，使果蔬發(fā)生褐變[21]。如圖3C所示，隨著貯藏時間的增長，CK、0.5%VC處理組和覆盆子水提取液處理組鮮切蘋果的POD活性均呈逐漸降低的趨勢。與CK相比，0.5%VC處理組和覆盆子水提取液處理組的POD活性顯著降低，這與段志芳[22]用陳皮黃酮處理蘋果汁的試驗結果相似。因此，覆盆子水提取液可以通過抑制POD活性從而抑制鮮切蘋果褐變的發(fā)生。

PAL可參與苯丙氨酸代謝過程中酚類物質的形成，與鮮切果蔬的褐變密切相關[23]。如圖3D所示，CK樣品在貯藏過程中，PAL活性無顯著變化。覆盆子水提取液處理后的PAL活性隨貯藏時間的延長呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，在儲藏第4天達到最大值。這可能是因為貯藏前期環(huán)境的變化以及蘋果處理時對細胞的損傷導致酶活性增強。隨儲藏時間的延長，0.5%VC處理下的PAL活性呈先升高后降低的趨勢，并在第2天達到最高值。在整個貯藏期間，覆盆子水提取液處理組樣品PAL活性顯著低于CK，但高于0.5%VC處理組。這與林青等[24]的研究結果相似。因此，覆盆子水提取液可以抑制PAL活性，延緩鮮切蘋果的褐變。

DPPH自由基清除活性與鮮切果蔬的抗氧化能力密切相關。如圖3E所示，隨著貯藏時間的延長，CK和覆盆子水提取液處理組、0.5%VC處理組的樣品DPPH自由基清除率均呈下降趨勢。但是覆盆子水提取液處理組中樣品的DPPH自由基清除率顯著（P＜0.05）高于CK和0.5%VC處理組。這與連文綺等[25]研究維生素C處理鮮切蘋果的結果相似。覆盆子水提取液富含酚類、黃酮類、有機酸等抗氧化活性物質，提高了鮮切蘋果的抗氧化活性，間接抑制鮮切蘋果的褐變。

酚類物質作為褐變反應的底物參與鮮切蘋果的褐變[1]。如圖3F所示，隨貯藏時間的延長，3個處理組的鮮切蘋果總酚含量逐漸下降。并且在整個貯藏期間，覆盆子水提取液處理組和0.5%VC處理組中總酚的含量均高于CK，這可能是由于植物提取物作為外源酚類物質增加鮮切蘋果的總酚含量。

2.4 覆盆子水提取液的高效液相色譜分析

覆盆子水提取液的高效液相色譜圖及酚類物質含量如圖4、圖5所示。

圖4 覆盆子水提取液高效液相色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of raspberry water extract

圖5 覆盆子水提取液中酚類物質的含量Fig.5 Content of phenolic substances in raspberry water extract

如圖4、圖5所示，在覆盆子水提取液中發(fā)現(xiàn)了多種活性物質成分，包括兒茶素、p-香豆酸、蘆丁、金絲桃苷、阿魏酸等成分，其中阿魏酸、兒茶素含量較高。研究表明米糠提取物可以抑制蘋果汁的褐變，抑制作用可能與其含有的p-香豆酸、阿魏酸等酚類物質有關[26]，Li等[14]研究也發(fā)現(xiàn)蘆丁具有抑制馬鈴薯褐變的作用。綜合來看，覆盆子水提取液的抗褐變作用可能與這些物質的協(xié)同作用有關。

3 結論

本研究結果表明，覆盆子水提取液可以顯著抑制鮮切蘋果的褐變，通過高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)覆盆子水提取液中含有兒茶素、綠原酸、蘆丁、p-香豆酸、阿魏酸等活性成分。對處理技術進一步優(yōu)化發(fā)現(xiàn)，其最佳浸提時間為2 h，最佳處理濃度為覆盆子粉末與蒸餾水1∶100（g/mL）混合，最佳處理時間為10 min。覆盆子水提取液可通過抑制鮮切蘋果中PPO、POD相關褐變酶的活性，提高DPPH自由基清除活性，增強鮮切蘋果的抗氧化能力，進而提高鮮切蘋果的抗褐變能力。該研究為今后研究植物提取物抑制鮮切蘋果的褐變、延長鮮切蘋果貨架期提供了參考。