• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    玉米糖肽的體外抗氧化活性

    2022-09-28 08:10:36王曉杰劉曉蘭
    中國糧油學報 2022年8期
    關(guān)鍵詞:糖肽螯合糖基化

    王曉杰, 童 玲, 劉曉蘭

    (齊齊哈爾大學食品與生物工程學院;黑龍江省玉米深加工理論與技術(shù)重點實驗室,齊齊哈爾 161006)

    轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(Transglutaminase,TGase),全稱為蛋白質(zhì)-谷氨酰胺-γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶,屬于轉(zhuǎn)移酶類(EC 2.3.2.13)[1]。根據(jù)酰基受體的不同,TGase可以催化交聯(lián)、?;D(zhuǎn)移 (即酶法糖基化)和脫酰胺3種類型反應(yīng),這3種反應(yīng)均可以用于改善蛋白質(zhì)的功能性質(zhì)[2-4]。相對于TGase催化的蛋白質(zhì)交聯(lián)反應(yīng)的研究,TGase途徑的蛋白質(zhì)酶法糖基化反應(yīng)的研究起步較晚。與美拉德反應(yīng)相比,TGase途徑的酶法糖基化反應(yīng)條件更溫和,產(chǎn)物更安全。因此,TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)已經(jīng)應(yīng)用于多種蛋白質(zhì)/多肽的改性中,包括酪蛋白、大豆蛋白、雞肌動球蛋白、蝦原肌球蛋白、黑豆蛋白、乳清蛋白、豌豆蛋白、玉米醇溶蛋白和谷蛋白、魚皮膠原蛋白肽、小麥谷蛋白肽等[5-10]。在TGase催化的酶法糖基化反應(yīng)中,蛋白質(zhì)/多肽功能性質(zhì)的改善程度與底物蛋白及氨基糖的性質(zhì)等因素有關(guān)。例如,當以D-氨基葡萄糖為?;w,修飾雞肌動球蛋白、雞胸肉肌原纖維蛋白、大豆蛋白及酪蛋白時,由于D-氨基葡萄糖附著所賦予的親水性,改善了原蛋白的溶解性、乳化性和凝膠特性[11-13];而修飾乳清分離蛋白時,D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使乳清分離蛋白的乳化性質(zhì)降低[8];修飾酪蛋白酸鈉水解產(chǎn)物時,在TGase處理前后產(chǎn)物的抗氧化活性之間無顯著性變化[14]。

    玉米肽是以玉米蛋白為原料,經(jīng)蛋白酶水解或微生物發(fā)酵后獲得的小分子質(zhì)量多肽。玉米肽特殊的氨基酸組成與排列順序決定了其具有多重的生物活性,特別是在抗氧化活性方面研究報道較多。相對于已應(yīng)用的抗氧化劑如GSH、維生素C來說,玉米肽的抗氧化活性較低,不利于功能性食品的開發(fā)。但是,玉米肽屬于天然、安全的抗氧化劑,如果能進一步改善其抗氧化活性,將促進玉米加工企業(yè)及功能食品等相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。玉米糖肽是玉米蛋白先經(jīng)蛋白酶水解獲得的低分子質(zhì)量玉米肽,再在TGase催化下與氨基糖共價結(jié)合的產(chǎn)物。與玉米肽相比,玉米糖肽的溶解性顯著增加,但其生物活性的改善程度鮮有研究。因此,本實驗以D-氨基葡萄糖共價修飾玉米肽的產(chǎn)物-玉米糖肽為原料,利用體外化學法和H2O2誘導的Caco-2細胞的氧化性損傷模型對玉米糖肽的抗氧化活性進行了研究,為抗氧化活性玉米糖肽作為功能性食品應(yīng)用于食品工業(yè)提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    堿性蛋白酶Alcalase,酶活力6.28×105U/mL;Caco-2細胞;玉米醇溶蛋白、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2-脫氧-D-核糖,均為色譜純;噻唑藍(MTT)、D-氨基葡萄糖鹽酸鹽,均為分析純;TGase,酶活力1 000 U/g;DMEM(高糖)培養(yǎng)基;胎牛血清;超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)測定試劑盒。

    1.2 儀器與設(shè)備

    NDA701杜馬斯定氮儀,TU1901紫外可見分光光度計,IM-45L-1-25制冰機,LD-53真空冷凍干燥機,NV 4750E二氧化碳培養(yǎng)箱,MB100-2A微孔板恒溫振蕩器,EnSpire多功能酶標儀,SX-500高壓蒸汽滅菌鍋。

    1.3 方法

    1.3.1 玉米肽的制備

    40 g玉米醇溶蛋白用蒸餾水配成底物質(zhì)量濃度0.05 g/mL的懸浮液,在pH 8.5、溫度60 ℃、Alcalase酶與玉米醇溶蛋白的質(zhì)量比3%、時間2.0 h條件下酶解2.0 h。酶解結(jié)束后,收集上清液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米肽[15]。

    1.3.2 玉米糖肽的制備

    將玉米肽配成質(zhì)量濃度為0.03 g/mL的溶液,按玉米肽與D-氨基葡萄糖的質(zhì)量比1∶3加入D-氨基葡萄糖,用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.7,按加酶量55 U/g蛋白加入TGase,在44 ℃恒溫水浴振蕩器中糖基化反應(yīng)7 h。7 h后,將反應(yīng)物立即放入85 ℃水浴中滅酶5 min。冷卻至室溫,4 000 r/min離心10 min,收集上清液過截斷分子質(zhì)量300 u的納濾膜,透過液經(jīng)冷凍干燥后獲得玉米糖肽混合物[16]。

    1.3.3 玉米糖肽的體外消化

    將底物質(zhì)量濃度為0.1 g/mL 的玉米糖肽和玉米肽溶液分別用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至2.0,按酶與底物的質(zhì)量比為2%加入胃蛋白酶,37 ℃條件下水解90 min。用6 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5,按酶與底物的質(zhì)量比為4%加入胰蛋白酶,37 ℃條件下水解240 min。酶解產(chǎn)物經(jīng)沸水浴滅酶10 min,冷卻至室溫后冷凍干燥,獲得玉米糖肽和玉米肽消化產(chǎn)物。

    1.3.4 利用體外化學法研究玉米糖肽的抗氧化活性

    用3種自由基(包括DPPH、羥基和超氧陰離子)清除能力、Fe2+螯合能力和還原力表征玉米糖肽的抗氧化活性,參照Wang等[17]描述的方法進行測定。

    1.3.5 體外消化對玉米糖肽分子質(zhì)量分布的影響

    采用配有凝膠層析色譜柱Superdex Peptide 10/300 GL的蛋白質(zhì)純化系統(tǒng)測定。色譜柱先用藍色葡聚糖2000測定外水體積V0,用標準蛋白(aprotinine, 6 500 u;桿菌肽, 1 400 u;氧化型谷胱甘肽, 612 u;還原型谷胱甘肽,307 u)進行校正。將樣品配成蛋白質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液,經(jīng)離心和0.22 μm微孔濾膜過濾后加載于色譜柱。上樣體積100 μL,流速0.25 mL/min,檢測波長214 nm。溶解樣品及色譜柱的平衡和洗脫均采用pH 7.0、20 mmol/L的磷酸鹽緩沖液(含有0.15 mol/L NaCl)?;跇悠方M分的洗脫體積(Ve)計算有效分配系數(shù)及樣品組分的分子質(zhì)量。

    1.3.6 利用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型研究玉米糖肽的抗氧化活性

    1.3.6.1 玉米糖肽對Caco-2細胞毒性的測定

    采用細胞存活率表征玉米糖肽是否對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng)。取96孔板,每孔加入100 μL、細胞密度為1×105個細胞/mL(以下實驗均采用該密度)、對數(shù)生長期的Caco-2細胞懸液,在37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。實驗分為樣品組和對照組,樣品組中每孔加入100 μL玉米糖肽溶液,使終濃度分別為5、25、50、100、200、500、1 000 μg/mL,對照組每孔加入100 μL DMEM培養(yǎng)基,37 ℃培養(yǎng)6 h。培養(yǎng)結(jié)束后,吸棄孔內(nèi)液體,細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L、pH 7.2~7.4,下同)洗2次,然后每孔加入100 μL PBS緩沖液和終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的MTT溶液,37 ℃培養(yǎng)4 h后用酶標儀檢測570 nm波長下的吸光值,并計算Caco-2細胞的存活率。

    1.3.6.2 H2O2氧化應(yīng)激條件下玉米糖肽對Caco-2細胞存活率的影響

    將100 μL對數(shù)期Caco-2細胞懸液接種至96孔板,培養(yǎng)24 h后,每孔加入100 μL終質(zhì)量濃度分別為5、50、100、200、500、1 000 μg/mL (同時設(shè)置對照組和H2O2組)的玉米糖肽溶液,作用6 h后吸棄孔內(nèi)液體,加入200 μL 200 μmol/L H2O2溶液培養(yǎng)4 h進行造模,根據(jù)1.3.6.1中 MTT法測定細胞存活率。

    1.3.6.3 玉米糖肽對H2O2誘導的氧化性損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響

    按1.3.6.2的方法細胞培養(yǎng)和造模,玉米糖肽的終質(zhì)量濃度分別為5、25、50、75 μg/mL。培養(yǎng)結(jié)束后,加入適量胰蛋白酶消化細胞,并收集細胞沉淀。用PBS緩沖液洗滌細胞1次后加入高效RIPA裂解液,4 ℃裂解20~30 min,10 000 r/min 離心5 min后,收集上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆?。取適量裂解液放置于冰水浴中,按照試劑盒說明書測定SOD、CAT、GR和γ-GCS活力,酶活力單位以U/mg表示。

    1.3.7 數(shù)據(jù)處理

    應(yīng)用SPSS Statistics 19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示,多樣本均數(shù)間比較采用One-way ANOVA檢驗,各組間多重比較采用LSD法,P<0.05認為具有顯著性差異。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽抗氧化活性的影響

    2.1.1 DPPH自由基清除能力

    以GSH為陽性對照,測定糖基化修飾對玉米肽以及體外消化對玉米糖肽DPPH自由基清除活性的影響,結(jié)果如圖1所示。

    TGase催化的糖基化反應(yīng)使玉米肽對DPPH自由基的清除能力顯著增加(P<0.05);經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶兩步消化后,玉米糖肽的DPPH自由基清除能力顯著增加(P<0.05),而玉米肽質(zhì)量濃度為1.5、2.0 mg/mL時DPPH自由基清除能力也顯著增加。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,玉米糖肽消化產(chǎn)物的DPPH自由基清除率為78.27%,比消化前提高19.07%,比玉米肽高30.8%,與0.5 mg/mL GSH的清除能力相當。相對于玉米肽而言,玉米肽與D-氨基葡萄糖發(fā)生糖基化反應(yīng)后,D-氨基葡萄糖分子上具有還原性的半縮醛羥基以及碳氫鏈上的羥基結(jié)構(gòu)能夠提供更多H+將DPPH自由基還原成穩(wěn)定的DPPH-H,從而糖基化產(chǎn)物具有更強的DPPH自由基清除能力。同理,體外消化過程可以將更多氫或電子供體暴露出來,可以更有效的捕獲DPPH自由基,導致消化產(chǎn)物具有更強的DPPH自由基清除能力。García-Mora等[18]研究了體外消化對小扁豆肽抗氧化活性穩(wěn)定性的影響,發(fā)現(xiàn)消化酶的作用會增加小扁豆肽的抗氧化活性,這是因為小扁豆肽經(jīng)消化釋放出的較小的肽片段和氨基酸會對抗氧化活性產(chǎn)生加性和協(xié)同的生物學效應(yīng),與本研究的結(jié)果一致。

    注:相同質(zhì)量濃度不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05),下同。圖1 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽DPPH自由基清除能力的影響

    2.1.2 羥基自由基清除能力

    以GSH為陽性對照,測定樣品對羥基自由基的清除活性,結(jié)果如圖2所示。

    糖基化修飾使玉米肽對羥基自由基的清除能力顯著增加,尤其是在1.5 mg/mL時,其清除能力與同濃度GSH相當。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,除0.5 mg/mL外,玉米糖肽的羥基自由基清除能力雖然增加,但與消化前相比無顯著性差異(P>0.05)。在質(zhì)量濃度為1~2 mg/mL范圍內(nèi),與玉米肽相比,玉米糖肽的羥基自由基清除能力增強,分析有兩方面原因:玉米糖肽作為氫供體與羥基自由基反應(yīng),將其還原成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)而被猝滅;玉米糖肽作為金屬離子螯合劑與過渡態(tài)金屬離子如Fe2+發(fā)生螯合作用,破壞Fenton 反應(yīng)或者Haber-Weiss反應(yīng),抑制了羥基自由基的產(chǎn)生,進而減少了戊糖氧化產(chǎn)物的生成。

    體外消化不能破壞玉米糖肽對羥基自由基的清除能力,這可能歸因于3個方面:與玉米糖肽的氨基酸組成有關(guān)。Ren等[19]發(fā)現(xiàn)含有Pro、Glu和Asp的玉米蛋白水解物對消化酶具有很強的抵抗力,而玉米糖肽富含Pro、Glu和Asp[20];與玉米糖肽的分子結(jié)構(gòu)有關(guān)。玉米糖肽的分子質(zhì)量小,空間構(gòu)象簡單,又由于胃蛋白酶和胰蛋白酶的位點特異性,兩步消化對玉米糖肽的組成和構(gòu)象影響較小,進而沒有對玉米糖肽的羥基自由基清除能力產(chǎn)生顯著性影響;與制備玉米糖肽的蛋白酶種類有關(guān)。Xie等[21]研究了體外消化過程中酪蛋白抗氧化肽的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶Alcalase 可以促進抗胃腸消化肽的產(chǎn)生。

    圖2 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽羥基自由基清除能力的影響

    2.1.3 超氧陰離子自由基清除活性

    以GSH為陽性對照,測定樣品對超氧陰離子自由基的清除活性,結(jié)果如圖3所示。D-氨基葡萄糖的共價修飾使玉米肽的超氧陰離子自由基清除能力顯著增加(P<0.05),且胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用不能破壞玉米糖肽的超氧陰離子自由基清除能力。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,玉米糖肽消化產(chǎn)物的清除率為32.46%,比消化前高3.63%;玉米肽消化產(chǎn)物的清除率為21.93%,比消化前高2.44%;玉米糖肽的清除率為28.82%,比玉米肽高9.33%,可能是因為D-氨基葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)和玉米肽分子中的抗氧化活性氨基酸殘基使玉米糖肽成為良好的供氫體,猝滅了超氧陰離子自由基。

    圖3 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽超氧陰離子自由基清除能力的影響

    2.1.4 還原力

    還原力也是待測樣品抗氧化能力強度的測定,結(jié)果如圖4所示。TGase催化的糖基化反應(yīng)使玉米肽的還原能力顯著增加。在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時,玉米糖肽的還原力為0.909,比玉米肽高0.765,是同濃度GSH的3.56倍,說明D-氨基葡萄糖的共價結(jié)合使玉米肽成為良好的電子供體,具有更強的還原力。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,玉米糖肽和玉米肽的還原力與消化前相比均增加,可能歸因于2個方面:隨著水解程度的增加,更多的極性或帶電荷氨基酸側(cè)鏈基團暴露出來;在消化過程中,肽鍵斷裂提供了質(zhì)子和電子的額外來源,以維持高氧化還原電位。Zhu等[22]研究了體外消化對玉米醇溶蛋白源玉米肽還原力的影響,也發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶1 h和胰酶2 h處理后消化產(chǎn)物的還原能力增加。

    圖4 糖基化修飾對玉米肽及體外消化對玉米糖肽還原力的影響

    2.1.5 Fe2+螯合能力

    Fe2+是過渡態(tài)金屬離子中最強大的助氧化劑,其具有通過Fenton反應(yīng)或Haber-Weiss反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基的能力[23]。因此,具有Fe2+螯合能力就能抑制羥基自由基的產(chǎn)生,進而延遲氧化反應(yīng),待測樣品Fe2+螯合能力的測定結(jié)果如圖5所示。

    圖5 糖基化對玉米肽和體外消化對玉米糖肽Fe2+螯合能力的影響

    與玉米肽相比,糖基化修飾使玉米肽的Fe2+螯合能力顯著增加(P<0.05)。在質(zhì)量濃度為2 mg/mL時,玉米糖肽的Fe2+螯合率比同濃度玉米肽高18.67%,是同濃度GSH的1.68倍。Saiga等[24]發(fā)現(xiàn)酸性氨基酸殘基(Asp和Glu)和堿性氨基酸殘基(His、Lys和Arg)由于自身的電荷特性,側(cè)鏈中的羧基和氨基在肽的Fe2+螯合能力中起著至關(guān)重要的作用。Yang等[25]也發(fā)現(xiàn)包含Glu、Gln和Lys的肽比不包含這些氨基酸的肽表現(xiàn)出更強的Fe2+螯合能力。玉米肽和玉米糖肽均富含Asp、Glu、His和Arg等殘基[20],且玉米肽分子上共價結(jié)合的D-氨基葡萄糖的多羥基結(jié)構(gòu)也有助于螯合Fe2+[26],因此,玉米糖肽和玉米肽均具有Fe2+螯合能力,且玉米糖肽的螯合效果高于玉米肽。

    經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后,玉米糖肽和玉米肽的Fe2+螯合率均顯著降低。孫宏[27]研究了體外消化對棉籽肽的Fe2+螯合能力的影響,發(fā)現(xiàn)經(jīng)胃蛋白酶消化后棉籽肽的Fe2+螯合能力顯著降低(P<0.05)。肽的金屬離子螯合能力可以通過與帶電荷的氨基酸殘基間靜電相互作用完成,也可以在結(jié)構(gòu)上通過對過渡態(tài)金屬離子的俘獲作用完成[28]。經(jīng)胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用導致肽捕獲金屬離子的結(jié)構(gòu)喪失,進而Fe2+螯合活性急劇下降。

    因此,玉米糖肽的抗氧化能力與其供氫及電子轉(zhuǎn)移能力有關(guān),這些活性是糖基部分和作為底物的玉米肽的協(xié)同作用。

    2.2 體外消化對玉米糖肽分子質(zhì)量分布的影響

    將樣品配制成2 mg/mL的溶液,測定玉米糖肽經(jīng)胃蛋白酶消化90 min和玉米糖肽經(jīng)胃蛋白酶消化90 min和胰蛋白酶消化240 min時水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布,洗脫圖譜如圖6所示。

    由圖6a可看出,玉米糖肽的分子質(zhì)量分布比較寬,主要由3個分子質(zhì)量組分構(gòu)成,其中保留時間大于18.69 min的分子質(zhì)量小于300 u的組分質(zhì)量分數(shù)為4.77%;在圖6b中,經(jīng)胃蛋白酶消化90 min后,玉米糖肽消化產(chǎn)物組分的保留時間向右移動,說明與玉米糖肽相比消化產(chǎn)物的分子質(zhì)量減小,具體表現(xiàn)為保留時間為16.92 min組分的含量降低,而保留時間為18.38 min的分子質(zhì)量小于300 u的組分質(zhì)量分數(shù)增加,達到14.29%;在圖6c中,玉米糖肽的分子質(zhì)量進一步減少,由圖6b的3個組分變成6個組分,主要組分的分子質(zhì)量集中在保留時間17.03 min(52.08%),說明胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用,進一步將玉米糖肽的分子質(zhì)量降解為分子質(zhì)量更小的肽段,甚至是游離氨基酸。綜合分析,胃蛋白酶和胰蛋白酶的消化作用使玉米糖肽的分子組成發(fā)生變化,將玉米糖肽清除自由基的抗氧化活性釋放出來,同時破壞了玉米糖肽螯合Fe2+的結(jié)構(gòu)。

    圖6 玉米糖肽及其體外消化產(chǎn)物的凝膠層析洗脫圖譜

    2.3 利用H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型研究玉米糖肽的抗氧化活性

    2.3.1 玉米糖肽對Caco-2細胞的毒性效應(yīng)

    細胞毒性分析是評估功能性食品生物安全性最重要的檢測方法之一。不同濃度玉米糖肽作用Caco-2細胞6 h后,采用MTT法測定細胞存活率,以表征玉米糖肽的預處理是否對Caco-2細胞產(chǎn)生毒性效應(yīng),結(jié)果如圖7所示。

    在質(zhì)量濃度為5~50 μg/mL范圍內(nèi),隨著玉米糖肽濃度的增加,Caco-2細胞存活率呈逐漸增加的變化趨勢,但與對照組相比差異不顯著(P>0.05);當玉米糖肽質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,Caco-2細胞存活率顯著增加(P<0.05),增加了7.05%;玉米糖肽的濃度繼續(xù)增加,Caco-2細胞的存活率略有下降,但與對照組相比也沒有顯著性差異(P>0.05),說明在實驗濃度范圍內(nèi),玉米糖肽對Caco-2細胞沒有毒性,是安全的生物功能因子。

    注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖7 不同濃度玉米糖肽對Caco-2細胞存活率的影響

    2.3.2 玉米糖肽對H2O2誘導損傷的Caco-2細胞存活率的影響

    Caco-2細胞先用玉米糖肽預處理6 h,然后暴露于200 μmol/L H2O2溶液中,研究玉米糖肽對H2O2誘導損傷的Caco-2細胞存活率的影響,結(jié)果如圖8所示。與對照組相比,用200 μmol/L H2O2作用4 h后,Caco-2細胞存活率極顯著降低(P<0.01),降低了40.5%,表明Caco-2氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。玉米糖肽的預處理在一定程度上改善了受損細胞的存活率,且改善的效果呈劑量依賴性。與H2O2組相比,500 μg/mL玉米糖肽的預處理使Caco-2細胞存活率提高12.57%,1 000 μg/mL玉米糖肽的預處理使Caco-2細胞存活率提高18.65%,可能是因為玉米糖肽可以有效地進入細胞內(nèi)并與氧化應(yīng)激相關(guān)途徑相互作用[29,30],加速清除細胞內(nèi)過量的H2O2、超氧陰離子等活性氧自由基而提高了細胞存活率。

    注:**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01),##表示與H2O2組相比差異極顯著(P<0.01)。圖8 玉米糖肽對H2O2誘導的氧化應(yīng)激條件下Caco-2細胞存活率的影響

    2.3.3 玉米糖肽對H2O2誘導損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響

    為了進一步表征玉米糖肽的抗氧化能力,研究了其對氧性損傷Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶活力的影響,結(jié)果如表1所示。與對照組相比,H2O2組細胞內(nèi)CAT、SOD、γ-GCS和GR的活力分別降低了80.08%、31.69%、67.38%和70.40%,進一步說明Caco-2細胞氧化應(yīng)激模型構(gòu)建成功。與H2O2組相比,玉米糖肽以劑量依賴的方式拮抗了氧化應(yīng)激細胞內(nèi)抗氧化酶活力的降低。其中,50 μg/mL玉米糖肽的預處理可以使SOD、γ-GCS、GR和CAT活力顯著提高(P<0.05),分別是H2O2組的1.09、2.75、2.54倍和3.21倍,75 μg/mL玉米糖肽的預處理甚至使4種內(nèi)源抗氧化酶活力恢復到正常水平,與75 μg/mL玉米肽組的GR、SOD、CAT和γ-GCS活力相比分別高6.47%、0.88%、10.77%和0.96%[15],進一步說明D-氨基葡萄糖的糖基化修飾改善了玉米肽的抗氧化活性。這樣,低劑量玉米糖肽的預處理可以通過增加Caco-2細胞內(nèi)抗氧化酶的活力,加速細胞內(nèi)活性氧自由基的清除,進而拮抗了H2O2誘導的Caco-2細胞的氧化性損傷。

    表1 玉米糖肽對H2O2誘導損傷Caco-2細胞內(nèi) 抗氧化酶活力的影響

    3 結(jié)論

    以還原型GSH為陽性對照,研究了糖基化修飾對玉米肽以及體外消化對玉米糖肽抗氧化活性的影響,同時構(gòu)建H2O2誘導的Caco-2細胞氧化性損傷模型,在細胞水平上對玉米糖肽的抗氧化活性進行研究。D-氨基葡萄糖的糖基化修飾使玉米肽的抗氧化活性顯著增加(P<0.05),且具有劑量依賴性,并且除Fe2+螯合能力外,體外模擬消化不能破壞玉米糖肽的自由基清除能力和還原力,說明玉米糖肽在胃腸道消化過程中仍能保持其抗氧化活性,能夠以活性形式到達血液,進而在體內(nèi)發(fā)揮其抗氧化活性。另外,質(zhì)量濃度為5~1 000 μg/mL的玉米糖肽對Caco-2細胞沒有毒性,質(zhì)量濃度為75 μg/mL的玉米糖肽可以顯著提高氧化損傷Caco-2細胞內(nèi)SOD、GR、CAT和γ-GCS抗氧化酶的活力,從提高細胞抗氧化水平的角度提高了細胞存活率。在此基礎(chǔ)上,需要對玉米糖肽的抗氧化機制進行研究。

    猜你喜歡
    糖肽螯合糖基化
    玉米低聚肽螯合鐵(II)的制備和結(jié)構(gòu)表征
    上海藥物所在復雜糖肽合成方面取得進展
    河南化工(2022年5期)2023-01-03 01:13:52
    水產(chǎn)品中三種糖肽類抗生素檢測方法的優(yōu)化
    不同結(jié)構(gòu)的烏鱧螯合肽對抗氧化活性的影響
    靈芝多糖肽對培養(yǎng)乳大鼠心肌細胞缺氧復氧損傷的保護作用
    糖基化終末產(chǎn)物與冠脈舒張功能受損
    螯合型洗滌助劑檸檬酸一氫鈉與Ca2+離子螯合機理的理論研究
    油炸方便面貯藏過程中糖基化產(chǎn)物的變化規(guī)律
    糖基化終末產(chǎn)物對糖尿病慢性并發(fā)癥的早期診斷價值
    精神分裂癥免疫球蛋白核心巖藻糖糖基化水平的檢測分析
    王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 十八禁网站免费在线| av天堂在线播放| 在线观看免费视频日本深夜| 亚洲精品国产区一区二| 国产野战对白在线观看| tube8黄色片| 国产欧美日韩一区二区三区在线| 美女视频免费永久观看网站| 少妇粗大呻吟视频| 午夜福利一区二区在线看| 91精品三级在线观看| 91成年电影在线观看| 国产黄色免费在线视频| 在线观看免费午夜福利视频| 性色av乱码一区二区三区2| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 在线看a的网站| 在线观看免费午夜福利视频| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产又色又爽无遮挡免费看| 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲 欧美一区二区三区| 9热在线视频观看99| 亚洲专区国产一区二区| 乱人伦中国视频| 国产av一区二区精品久久| a级片在线免费高清观看视频| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产av又大| 成人黄色视频免费在线看| av超薄肉色丝袜交足视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 91成年电影在线观看| 热99国产精品久久久久久7| 男女高潮啪啪啪动态图| 国产亚洲一区二区精品| 久久久久精品人妻al黑| 日本一区二区免费在线视频| 午夜91福利影院| 久久人人97超碰香蕉20202| 捣出白浆h1v1| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 99久久国产精品久久久| 久久精品国产综合久久久| 欧美成人午夜精品| 女性被躁到高潮视频| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | kizo精华| 久久精品人人爽人人爽视色| 国产成人精品久久二区二区91| 国产av又大| 一级毛片电影观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 中文字幕人妻熟女乱码| 亚洲欧美一区二区三区久久| 欧美在线黄色| 日本a在线网址| 中文字幕色久视频| 国产精品1区2区在线观看. | 久久中文字幕人妻熟女| 大片电影免费在线观看免费| 欧美成人午夜精品| 久久av网站| 亚洲五月婷婷丁香| 国产免费视频播放在线视频| 精品人妻1区二区| 亚洲性夜色夜夜综合| 国产一区二区在线观看av| 99久久99久久久精品蜜桃| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃| 久久精品国产亚洲av高清一级| 国产亚洲欧美精品永久| 国产亚洲av高清不卡| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 欧美日韩福利视频一区二区| 国产成人免费无遮挡视频| 在线亚洲精品国产二区图片欧美| 天天添夜夜摸| 夜夜夜夜夜久久久久| 午夜91福利影院| 欧美精品高潮呻吟av久久| 亚洲精品中文字幕一二三四区 | 亚洲成av片中文字幕在线观看| 制服诱惑二区| 窝窝影院91人妻| 自线自在国产av| 国产精品九九99| 欧美日韩福利视频一区二区| 热99国产精品久久久久久7| 日韩精品免费视频一区二区三区| 制服诱惑二区| 久久精品亚洲精品国产色婷小说| 国产免费av片在线观看野外av| 高清毛片免费观看视频网站 | 一区在线观看完整版| 久久青草综合色| 999久久久国产精品视频| 成人亚洲精品一区在线观看| 精品久久蜜臀av无| 久久久精品区二区三区| 午夜福利在线免费观看网站| 色综合欧美亚洲国产小说| 欧美精品啪啪一区二区三区| 黄片小视频在线播放| 欧美乱妇无乱码| 免费在线观看日本一区| 日韩欧美国产一区二区入口| 精品福利永久在线观看| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 亚洲成国产人片在线观看| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 天天影视国产精品| 精品乱码久久久久久99久播| 久久中文字幕一级| 精品一区二区三区av网在线观看 | 丁香六月欧美| 下体分泌物呈黄色| 国产一区有黄有色的免费视频| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产成人精品在线电影| 国产激情久久老熟女| 国产视频一区二区在线看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 99香蕉大伊视频| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 啦啦啦在线免费观看视频4| 久久精品国产a三级三级三级| 精品国产乱码久久久久久男人| 在线av久久热| 国产1区2区3区精品| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 一本色道久久久久久精品综合| 精品国产乱子伦一区二区三区| 下体分泌物呈黄色| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美激情 高清一区二区三区| 亚洲av欧美aⅴ国产| av又黄又爽大尺度在线免费看| av不卡在线播放| 丁香六月天网| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 纵有疾风起免费观看全集完整版| 女警被强在线播放| 欧美另类亚洲清纯唯美| 国产精品自产拍在线观看55亚洲 | 国产精品.久久久| 久久精品亚洲av国产电影网| 一本综合久久免费| 一二三四社区在线视频社区8| 制服诱惑二区| 国产精品国产高清国产av | 国产精品成人在线| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 日韩欧美一区视频在线观看| 在线观看免费日韩欧美大片| 中文字幕精品免费在线观看视频| 91精品三级在线观看| e午夜精品久久久久久久| 亚洲一区中文字幕在线| 欧美激情极品国产一区二区三区| 成年女人毛片免费观看观看9 | 欧美+亚洲+日韩+国产| 免费观看av网站的网址| 怎么达到女性高潮| 久久狼人影院| 欧美成狂野欧美在线观看| 色播在线永久视频| 亚洲第一青青草原| 成人三级做爰电影| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 黑人猛操日本美女一级片| 黄色 视频免费看| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 国产97色在线日韩免费| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 亚洲精品美女久久av网站| 性色av乱码一区二区三区2| www.熟女人妻精品国产| 久久久久久久大尺度免费视频| 久久人妻福利社区极品人妻图片| 91老司机精品| 亚洲三区欧美一区| 免费黄频网站在线观看国产| 国产精品av久久久久免费| 国产激情久久老熟女| 欧美日韩亚洲高清精品| 高清黄色对白视频在线免费看| 高潮久久久久久久久久久不卡| 免费看a级黄色片| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产成+人综合+亚洲专区| 国产精品国产av在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 一二三四在线观看免费中文在| 国产三级黄色录像| av福利片在线| 国产精品欧美亚洲77777| 老鸭窝网址在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 中文字幕最新亚洲高清| 中文字幕制服av| 亚洲国产看品久久| 国产成人精品久久二区二区91| www.熟女人妻精品国产| 免费日韩欧美在线观看| 一区福利在线观看| 99精国产麻豆久久婷婷| 电影成人av| 日韩中文字幕视频在线看片| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲美女黄片视频| 精品人妻在线不人妻| 91av网站免费观看| 成人18禁在线播放| 999久久久国产精品视频| 精品久久久久久久毛片微露脸| 老司机午夜十八禁免费视频| 咕卡用的链子| 国产一区有黄有色的免费视频| 男女免费视频国产| 亚洲avbb在线观看| 欧美日韩精品网址| 国产欧美日韩一区二区三| 久久久久国内视频| 青青草视频在线视频观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 亚洲男人天堂网一区| 国产国语露脸激情在线看| 亚洲av成人一区二区三| 午夜福利视频在线观看免费| 老汉色av国产亚洲站长工具| 一进一出抽搐动态| 亚洲国产欧美网| 丝袜在线中文字幕| 欧美黄色片欧美黄色片| 日韩大码丰满熟妇| 久久午夜综合久久蜜桃| 超碰97精品在线观看| 大香蕉久久网| 日韩大片免费观看网站| 丝袜美足系列| 十八禁网站网址无遮挡| 丰满迷人的少妇在线观看| 97在线人人人人妻| av福利片在线| 婷婷成人精品国产| 最新的欧美精品一区二区| 欧美人与性动交α欧美软件| 精品久久久久久久毛片微露脸| 精品第一国产精品| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 在线av久久热| 亚洲少妇的诱惑av| 99热国产这里只有精品6| 在线观看66精品国产| 久久中文字幕人妻熟女| 美女福利国产在线| 亚洲精品国产精品久久久不卡| 国产激情久久老熟女| 涩涩av久久男人的天堂| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 亚洲五月婷婷丁香| 少妇 在线观看| 免费观看av网站的网址| 亚洲午夜理论影院| 国产三级黄色录像| av国产精品久久久久影院| 久久久精品免费免费高清| 最新在线观看一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 久9热在线精品视频| 亚洲专区国产一区二区| cao死你这个sao货| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | 性色av乱码一区二区三区2| 一级毛片精品| 国产在线视频一区二区| 午夜免费鲁丝| 国产片内射在线| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲av国产av综合av卡| 欧美精品亚洲一区二区| 天天操日日干夜夜撸| 香蕉久久夜色| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 亚洲 欧美一区二区三区| 久久中文看片网| 欧美成人免费av一区二区三区 | 欧美黑人精品巨大| 亚洲综合色网址| 国产深夜福利视频在线观看| 一区二区av电影网| 自线自在国产av| 男人操女人黄网站| 在线观看www视频免费| 久久免费观看电影| av免费在线观看网站| 精品免费久久久久久久清纯 | 无遮挡黄片免费观看| 女警被强在线播放| 男人舔女人的私密视频| 人人妻人人澡人人看| 妹子高潮喷水视频| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 18禁国产床啪视频网站| 国产熟女午夜一区二区三区| 成人18禁在线播放| 久久亚洲真实| 国产精品美女特级片免费视频播放器 | 99在线人妻在线中文字幕 | 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲专区中文字幕在线| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产视频一区二区在线看| 久久久久久久久久久久大奶| 真人做人爱边吃奶动态| 99re在线观看精品视频| 日日爽夜夜爽网站| 女人高潮潮喷娇喘18禁视频| 中文字幕另类日韩欧美亚洲嫩草| 91大片在线观看| 一边摸一边抽搐一进一出视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 老司机午夜十八禁免费视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 一进一出好大好爽视频| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 国产精品一区二区精品视频观看| 国产精品一区二区在线观看99| 高清在线国产一区| 97在线人人人人妻| 香蕉国产在线看| 黄色毛片三级朝国网站| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 成人永久免费在线观看视频 | 国产亚洲欧美在线一区二区| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产精品熟女久久久久浪| 黄色视频不卡| 亚洲精品国产一区二区精华液| 欧美日韩亚洲高清精品| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 啦啦啦免费观看视频1| 桃红色精品国产亚洲av| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 他把我摸到了高潮在线观看 | www.自偷自拍.com| 欧美精品一区二区大全| 欧美精品av麻豆av| 日韩欧美国产一区二区入口| 丝袜人妻中文字幕| 9191精品国产免费久久| 1024香蕉在线观看| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 亚洲熟女毛片儿| 极品教师在线免费播放| www.熟女人妻精品国产| 欧美+亚洲+日韩+国产| 中亚洲国语对白在线视频| 99国产精品99久久久久| 国产精品国产av在线观看| 成人国产av品久久久| 亚洲国产看品久久| 成年人黄色毛片网站| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 国产欧美日韩精品亚洲av| 欧美一级毛片孕妇| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 高清黄色对白视频在线免费看| 日日爽夜夜爽网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产成人啪精品午夜网站| 精品一区二区三卡| 欧美成人免费av一区二区三区 | 亚洲,欧美精品.| 国产精品一区二区在线不卡| 十八禁网站网址无遮挡| 精品少妇内射三级| 99国产综合亚洲精品| 亚洲专区字幕在线| 99国产精品一区二区蜜桃av | 精品福利观看| 国产一区二区三区视频了| 亚洲三区欧美一区| videosex国产| 欧美中文综合在线视频| 欧美日韩黄片免| 免费观看人在逋| 午夜久久久在线观看| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 女警被强在线播放| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 99精品欧美一区二区三区四区| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 久久久欧美国产精品| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 国产午夜精品久久久久久| 精品高清国产在线一区| 午夜福利免费观看在线| 不卡av一区二区三区| 国产精品久久久久久人妻精品电影 | 欧美精品高潮呻吟av久久| 国产单亲对白刺激| 欧美黑人精品巨大| 天堂8中文在线网| 99在线人妻在线中文字幕 | 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人系列免费观看| 在线播放国产精品三级| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 色综合婷婷激情| 日韩欧美免费精品| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 男女边摸边吃奶| 久久久久久免费高清国产稀缺| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 韩国精品一区二区三区| 国产单亲对白刺激| 国产精品国产av在线观看| 国产精品一区二区免费欧美| 麻豆国产av国片精品| 老司机福利观看| 国产精品久久久人人做人人爽| 国产一区二区 视频在线| 两个人免费观看高清视频| 国产高清国产精品国产三级| 亚洲精品国产精品久久久不卡| netflix在线观看网站| 国产伦人伦偷精品视频| av免费在线观看网站| 久久精品国产亚洲av高清一级| 九色亚洲精品在线播放| 麻豆国产av国片精品| 国产深夜福利视频在线观看| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜福利乱码中文字幕| 黄色a级毛片大全视频| 国产精品九九99| av电影中文网址| 99国产精品一区二区蜜桃av | 99精品欧美一区二区三区四区| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 在线观看66精品国产| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 欧美日韩亚洲高清精品| 久久精品国产99精品国产亚洲性色 | 亚洲一码二码三码区别大吗| 麻豆乱淫一区二区| 操出白浆在线播放| 日韩成人在线观看一区二区三区| 黑人猛操日本美女一级片| 十八禁网站免费在线| netflix在线观看网站| 99国产精品一区二区蜜桃av | 天堂动漫精品| 香蕉久久夜色| 久久久久国内视频| 男人舔女人的私密视频| 大片电影免费在线观看免费| 中文字幕人妻丝袜一区二区| 天天躁日日躁夜夜躁夜夜| 亚洲av欧美aⅴ国产| 国产一区二区三区视频了| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 巨乳人妻的诱惑在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 成年动漫av网址| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产一区二区在线观看av| 亚洲熟女毛片儿| 这个男人来自地球电影免费观看| 成年人午夜在线观看视频| 免费观看av网站的网址| 丰满少妇做爰视频| 国产男女超爽视频在线观看| 亚洲av片天天在线观看| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 国产成人免费无遮挡视频| 国产精品九九99| 一级毛片精品| 亚洲精品粉嫩美女一区| 免费在线观看日本一区| 国产精品久久久人人做人人爽| 久久人妻av系列| 午夜福利免费观看在线| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产欧美日韩一区二区精品| 国产在线观看jvid| 国产在线精品亚洲第一网站| 黑丝袜美女国产一区| 九色亚洲精品在线播放| 黄色片一级片一级黄色片| 国产真人三级小视频在线观看| 91老司机精品| 黄频高清免费视频| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 蜜桃在线观看..| 大片免费播放器 马上看| 久久亚洲真实| 亚洲 国产 在线| 国产成人啪精品午夜网站| 国产欧美亚洲国产| 国产精品久久久久久精品电影小说| 波多野结衣一区麻豆| 丝袜喷水一区| 国产在线精品亚洲第一网站| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 一级毛片精品| 亚洲av电影在线进入| 国产欧美日韩一区二区三| 天堂中文最新版在线下载| 日本wwww免费看| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 麻豆成人av在线观看| 黄色视频不卡| 国产精品亚洲av一区麻豆| 亚洲成人手机| 精品一区二区三卡| 亚洲人成电影观看| 国产av国产精品国产| 日本五十路高清| 一级片免费观看大全| 午夜久久久在线观看| 在线观看66精品国产| 日韩欧美三级三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 亚洲一区中文字幕在线| 高清视频免费观看一区二区| 国产av又大| 99国产精品一区二区三区| 1024香蕉在线观看| 99香蕉大伊视频| 黄色a级毛片大全视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲一码二码三码区别大吗| 精品一区二区三区av网在线观看 | 少妇粗大呻吟视频| 日本a在线网址| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲专区中文字幕在线| 久久99一区二区三区| 脱女人内裤的视频| 在线观看人妻少妇| 一边摸一边抽搐一进一小说 | 国产一区二区在线观看av| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 日本黄色日本黄色录像| 国产成人欧美在线观看 | 啦啦啦中文免费视频观看日本| av线在线观看网站| 精品福利永久在线观看| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 免费黄频网站在线观看国产| 超色免费av| 亚洲自偷自拍图片 自拍| 黄片小视频在线播放| 两人在一起打扑克的视频| 变态另类成人亚洲欧美熟女 | 下体分泌物呈黄色| 国产在线视频一区二区| 精品欧美一区二区三区在线| 热re99久久精品国产66热6| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 国产精品欧美亚洲77777| 纯流量卡能插随身wifi吗| 69av精品久久久久久 | 欧美在线黄色| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲av电影在线进入| 天堂8中文在线网| 久久狼人影院| 日本wwww免费看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 国产亚洲精品久久久久5区| 亚洲欧美日韩高清在线视频 | 国产国语露脸激情在线看| 久久国产精品影院| 男女之事视频高清在线观看| av国产精品久久久久影院| 另类亚洲欧美激情| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av| 麻豆乱淫一区二区| 日韩欧美免费精品| 啦啦啦在线免费观看视频4| 99在线人妻在线中文字幕 | 黄色a级毛片大全视频| 亚洲中文av在线| 99九九在线精品视频| 免费观看av网站的网址| 五月天丁香电影| 99国产精品一区二区蜜桃av | 国产欧美日韩一区二区三区在线| 波多野结衣一区麻豆| 午夜精品国产一区二区电影| 一进一出抽搐动态| 国产精品影院久久| 欧美黄色淫秽网站| 国产日韩欧美在线精品| 婷婷丁香在线五月| h视频一区二区三区| 搡老乐熟女国产| 国产欧美日韩精品亚洲av|