肺腺癌中KISS1、E-cadherin和vimentin蛋白的表達(dá)及臨床意義

婁 寧，潘洪濤，王新立，蔡仁萍，楊 帆

肺癌是發(fā)病率、病死率較高的惡性腫瘤，肺腺癌是肺癌最常見的類型。早發(fā)現(xiàn)、早診斷能顯著改善患者的預(yù)后，手術(shù)切除是治療肺腺癌的主要方法[1]。目前，由于缺乏有效的檢測(cè)方法，只有少數(shù)患者能夠在早期得到治療，而大多數(shù)患者就診時(shí)腫瘤已進(jìn)展為中晚期，已發(fā)生周圍組織浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等，5年生存率不足20%[2-3]。因此，探討肺腺癌浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制、尋找新的治療靶點(diǎn)，已成為亟需解決的問(wèn)題。KISS1缺失或表達(dá)下調(diào)促進(jìn)腫瘤的形成、發(fā)生及發(fā)展，EMT起關(guān)鍵性作用，但兩者在肺腺癌中的關(guān)系研究鮮有報(bào)道。因此，本文著重探討肺腺癌中KISS1的表達(dá)及與EMT相關(guān)分子標(biāo)志物(E-cadherin和vimentin)的關(guān)系，為臨床與病理醫(yī)師提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2015年1月～2017年12月濟(jì)南市第八人民醫(yī)院及山東第一醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科存檔的103例肺腺癌及對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)，標(biāo)本均經(jīng)病理學(xué)明確診斷?；颊吣挲g37～79歲，平均61.8歲；男性60例，女性43例，其中>60歲者67例，≤60歲者36例。TNM分期：Ⅰ+Ⅱ期43例，Ⅲ+Ⅳ期60例。納入標(biāo)準(zhǔn)：患者行肺葉切除術(shù)，病理診斷為肺腺癌；臨床資料完整，可追蹤隨訪；術(shù)前均未行放、化療或免疫治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤者；有嚴(yán)重肝、腎等重要臟器功能損害或其他嚴(yán)重基礎(chǔ)病者。

1.2 方法手術(shù)標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)HE染色，免疫組化采用SP法。兔抗人KISS1、vimentin、E-cadherin多克隆抗體、免疫組化SP試劑盒和DAB顯色試劑盒，均購(gòu)自北京中杉金橋公司。切片經(jīng)65 ℃烤2.5 h，脫蠟水化，微波爐內(nèi)枸櫞酸鈉緩沖液(pH 6.5)沸騰后，經(jīng)抗原修復(fù)10 min，室溫下冷卻。3%過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，山羊血清封閉非特異性位點(diǎn)，加入KISS1、E-cadherin、vimentin，4 ℃恒溫過(guò)夜。PBS溶液代替一抗作為陰性對(duì)照。次日洗滌后加入二抗、辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，DAB顯色，蘇木精復(fù)染、脫水、透明、封固。

1.3 判讀標(biāo)準(zhǔn)染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師采用雙盲法閱片，采用半定量法并結(jié)合染色強(qiáng)度和染色范圍進(jìn)行判斷。KISS1、vimentin以腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性；E-cadherin以腫瘤細(xì)胞胞膜呈棕黃色為陽(yáng)性。光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)高倍鏡視野進(jìn)行觀察：(1)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分：無(wú)著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(2)根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)計(jì)分：≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將上述兩項(xiàng)得分結(jié)果相乘：0～3分為陰性，4～12分為陽(yáng)性。

1.4 隨訪采用電話進(jìn)行隨訪，截至2020年12月31日，隨訪時(shí)間3～36個(gè)月，失訪者的隨訪時(shí)間按截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)指標(biāo)(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)及Spearman等級(jí)相關(guān)分析；應(yīng)用Kaplan-Meier法計(jì)算生存率，組間生存曲線的比較采用Log-rank檢驗(yàn)；以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌中KISS1及E-cadherin、vimentin的表達(dá)103例肺腺癌組織中KISS1定位于腫瘤細(xì)胞質(zhì)，KISS1陽(yáng)性50例(48.5%)(圖1A、B)，陰性53例(51.5%)；癌旁正常組織中陽(yáng)性93例(90.3%)，陰性10例(9.7%)，KISS1在肺腺癌癌組織及癌旁組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。103例肺腺癌組織中E-cadherin染色定位于細(xì)胞膜，陽(yáng)性46例(44.7%)(圖1C、D)，陰性57例(55.3%)；vimentin染色定位于細(xì)胞質(zhì)，陽(yáng)性55例(53.4%)(圖1E、F)，陰性48例(46.7%)。

圖1 肺腺癌中各蛋白的表達(dá)：A.肺腺癌中KISS1呈弱陽(yáng)性；B.肺腺癌中KISS1呈強(qiáng)陽(yáng)性；C.肺腺癌中E-cadherin呈弱陽(yáng)性；D.肺腺癌中E-cadherin呈強(qiáng)陽(yáng)性；E.肺腺癌中vimentin呈弱陽(yáng)性；F.肺腺癌中vimentin呈強(qiáng)陽(yáng)性，SP法

2.2 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系肺腺癌組織中，KISS1、E-cadherin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著低于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而vimentin在腫瘤低分化、Ⅲ+Ⅳ期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中的表達(dá)顯著高于腫瘤高中分化、Ⅰ+Ⅱ期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。KISS1、E-cadherin、vimentin與患者性別、年齡、腫瘤最大徑、組織類型均無(wú)關(guān)(P>0.05，表1)。

表1 肺腺癌中KISS1、E-cadherin、vimentin表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 KISS1表達(dá)與E-cadherin、vimentin表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析103例肺腺癌組織中KISS1與E-cadherin和vimentin的表達(dá)，結(jié)果顯示：KISS1與E-cadherin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.534，P<0.05)，KISS1與vimentin的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.611，P<0.05，表2)。

表2 KISS1表達(dá)與E-cadherin、vimentin表達(dá)的相關(guān)性

2.4 肺腺癌中KISS1、E-cadherin及vimentin表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系本組中位生存期顯示：KISS1陽(yáng)性組26個(gè)月，陰性組19個(gè)月；E-cadherin陽(yáng)性組26個(gè)月，陰性組21個(gè)月；vimentin陽(yáng)性組20個(gè)月，陰性組26個(gè)月。根據(jù)肺腺癌患者的預(yù)后資料分析患者的3年生存率，結(jié)果顯示：KISS1陽(yáng)性組顯著高于陰性組(χ2=9.226，P=0.002)；E-cadherin陽(yáng)性組顯著高于陰性組(χ2=5.140，P=0.023)；vimentin陽(yáng)性組顯著低于陰性組(χ2=5.903，P=0.015，圖2)。

圖2 肺腺癌中KISS1(A)、E-cadherin(B)、vimentin(C)表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3 討論

大多數(shù)肺癌患者確診時(shí)多為中晚期且預(yù)后較差，因此對(duì)肺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制研究具有重要意義。在結(jié)直腸癌、胃癌等腫瘤中，KISS1突變或者表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)腫瘤發(fā)生及進(jìn)展[4-5]，但在肺腺癌中與EMT相關(guān)因子(E-cadherin、vimentin)表達(dá)的相關(guān)性尚未見報(bào)道，與患者預(yù)后的關(guān)系也尚存在爭(zhēng)議。

KISS1是最先在黑色素瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的腫瘤抑制基因，位于染色體1q32～q41區(qū)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中具有重要意義[6]。Guzman等[7]研究發(fā)現(xiàn)KISS1在胰腺癌和卵巢癌發(fā)展的初始階段上調(diào)起抑癌作用。然而，當(dāng)KISS1被某些機(jī)制(如啟動(dòng)子高甲基化)下調(diào)后，患者的預(yù)后較差。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)肺腺癌腫瘤組織中KISS1陽(yáng)性率(48.5%)遠(yuǎn)低于癌旁組織(90.3%)，與上述研究結(jié)論相吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證了KISS1可能作為肺腺癌的潛在抑癌基因，進(jìn)而抑制腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移。Zheng等[8]研究發(fā)現(xiàn)KISS1 mRNA和蛋白表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、組織學(xué)類型無(wú)相關(guān)性，而與臨床分期、有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Zheng等報(bào)道一致，進(jìn)一步表明KISS1下調(diào)或突變?nèi)笔Т龠M(jìn)了肺腺癌的進(jìn)展。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺腺癌患者KISS1陽(yáng)性組3年生存率顯著高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

腫瘤浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移是多分子、多基因相互作用的結(jié)果，其中EMT是重要的步驟之一。EMT是指上皮性的細(xì)胞(包括正常上皮和腫瘤上皮)表現(xiàn)出間質(zhì)細(xì)胞的特征，獲得了遷徙、運(yùn)動(dòng)能力[9]。EMT是正常胚胎發(fā)育的過(guò)程，同樣也是最常見的腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移的起始原因，其標(biāo)志特征是上皮細(xì)胞完整性的丟失，而這種丟失會(huì)伴隨維持上皮細(xì)胞間接觸的黏附連接下降[10-11]。E-cadherin和vimentin是癌細(xì)胞EMT表面和支架的典型代表標(biāo)志物，E-cadherin蛋白主要參與細(xì)胞間質(zhì)之間特異性黏附連接過(guò)程，其功能的缺失與各種惡性上皮源性腫瘤的不良預(yù)后顯著有關(guān)。胡麗霞等[12]研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin mRNA和蛋白在乳腺癌組織中呈陰性；其蛋白表達(dá)與臨床分期、脈管侵襲、組織學(xué)分級(jí)等表達(dá)間差異均有顯著性，可能參與乳腺癌的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)在肺腺癌組織中，E-cadherin蛋白與KISS1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)；推測(cè)其表達(dá)可能與腫瘤分化程度、脈管累及、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期相關(guān)，與胡麗霞等在乳腺癌組織中的研究結(jié)果相吻合。

當(dāng)細(xì)胞發(fā)生EMT時(shí)細(xì)胞極性喪失、細(xì)胞間連接解體、肌動(dòng)蛋白骨架改變等一系列變化，導(dǎo)致細(xì)胞表面上皮標(biāo)志物E-cadherin等表達(dá)逐漸降低，而間充質(zhì)標(biāo)志物不斷升高，基膜降解最終使細(xì)胞獲得遷移和侵襲從而發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[13-14]。本實(shí)驗(yàn)E-cadherin在低分化、有浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及TNM分期較晚的肺腺癌組中陽(yáng)性率降低，提示在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中隨著其丟失或陰性，腫瘤細(xì)胞間的黏附力下降，促進(jìn)EMT的發(fā)生。vimentin在正常上皮細(xì)胞中不表達(dá)，但在TNM分期較晚、低分化、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)，同樣可增加EMT活性[15]。經(jīng)過(guò)EMT的細(xì)胞失去了它們的上皮細(xì)胞特征，表達(dá)間充質(zhì)標(biāo)志物特性[16]。vimentin在癌組織中過(guò)表達(dá)后促進(jìn)癌細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)，減弱細(xì)胞黏附，且無(wú)法維持細(xì)胞完整性，最終導(dǎo)致癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。本組相關(guān)性分析顯示，vimentin與KISS1蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示在肺腺癌組織中E-cadherin陰性和vimentin陽(yáng)性與腫瘤組織的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，E-cadherin表達(dá)下調(diào)及vimentin表達(dá)上調(diào)在浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，同時(shí)提示患者預(yù)后較差。文獻(xiàn)報(bào)道KISS1抑制間皮瘤細(xì)胞EMT的發(fā)生，抑制了腫瘤的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移。但是，KISS1與EMT的關(guān)系在肺腺癌研究中尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)探討了KISS1與EMT表達(dá)的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)隨著KISS1表達(dá)的降低，E-cadherin表達(dá)下調(diào)而vimentin表達(dá)上調(diào)。因此，作者認(rèn)為肺腺癌中KISS1表達(dá)下調(diào)參與EMT的發(fā)生，具體通過(guò)哪種通路促進(jìn)EMT發(fā)生有待后續(xù)進(jìn)一步分析。

綜上所述，KISS1可能作為一種抑癌基因參與肺腺癌的發(fā)生、發(fā)展，表達(dá)降低可誘導(dǎo)EMT發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后較差，但具體分子機(jī)制尚需進(jìn)一步證實(shí)。