基于整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的天龍咳喘靈抗特發(fā)性肺動脈高壓可行性分析及作用機(jī)制

林范杰，李東蕾，林肯，陳少琪，盧文菊

1.呼吸疾病國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家呼吸系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，廣州呼吸健康研究院，廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510030；2.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 510030

特發(fā)性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）是一種罕見的肺血管增殖性疾病，病理特征為叢狀病變、肺小動脈原位血栓形成及肺動脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）過度增殖與抗凋亡，最終可演變?yōu)橛倚乃ソ?。IPAH起病隱匿，臨床表現(xiàn)多以疲勞、虛弱、呼吸短促、心絞痛和暈厥為主。結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論，中醫(yī)認(rèn)為IPAH的關(guān)鍵病機(jī)在于心陽虛衰，病性證素主要為氣滯、痰阻和血瘀，證型主要為大氣下陷證、血瘀證、心氣虛證和肺氣虛證。但針對其辨證施治的醫(yī)案記載甚少，缺乏易推廣的中醫(yī)療法。另外，IPAH目前尚無法治愈。因此，尋找有效的抗IPAH藥物具有重要意義。

天龍咳喘靈是國家級名老中醫(yī)邱志楠教授根據(jù)“溫腎化痰、活血逐瘀”學(xué)術(shù)理念研發(fā)的制劑，在肺病的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)與臨床試驗(yàn)中已取得顯著成效。天龍咳喘靈由10味藥組成，方中熟附子有振奮腎中元陽，復(fù)其氣化衛(wèi)外之能；青天葵兼治痰瘀熱，消痰解毒化瘀又不傷陰血耗氣；炙麻黃、款冬花溫肺平喘，擅治久咳久喘；法半夏溫化痰飲、燥濕降逆；五味子斂肺而滋腎；魚腥草、黃芩清肺瀉火，清熱燥濕；芥子、細(xì)辛溫肺平喘，祛伏寒利肺。藥理學(xué)研究表明，天龍咳喘靈能夠顯著提高慢性低氧性肺動脈高壓大鼠血漿一氧化氮（NO）含量和一氧化氮合成酶（NOS）活力，減輕肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，降低肺動脈壓力。此外，還能抑制哮喘小鼠肺組織高表達(dá)的磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活子3蛋白分子，而該分子可作為轉(zhuǎn)錄因子啟動某些與血管平滑肌增生肥大相關(guān)基因的表達(dá)?？梢?，天龍咳喘靈的功效與IPAH疾病特點(diǎn)相契合，顯示天龍咳喘靈用于抗IPAH具有研究價(jià)值和開發(fā)潛力。因此，本研究采用整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)系統(tǒng)性探究天龍咳喘靈抗IPAH的可能作用機(jī)制，為IPAH的臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 天龍咳喘靈活性成分獲取與篩選

通過TCMSP（https://tcmsp-e.com/）檢索半夏、款冬花、附子、魚腥草、北五味子、黃芩、芥子、細(xì)辛和麻黃的化合物信息，以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18為條件篩選藥物活性成分。因TCMSP未收錄青天葵，故利用本草組鑒（HERB，http://herb.ac.cn/）數(shù)據(jù)庫獲取青天葵的活性成分。

1.2 天龍咳喘靈活性成分靶點(diǎn)預(yù)測

通過HERB數(shù)據(jù)庫獲取每個(gè)活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)信息；利用PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取各活性成分的簡化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular-input line-entry system，SMILES）并依次導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫（http://www.swisstargetprediction.ch/）進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測，選擇物種為“Homo sapiens”，以Probability≥0.5的靶點(diǎn)蛋白作為活性成分作用的靶點(diǎn)。兩者進(jìn)行合并、去重，通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對靶點(diǎn)蛋白名稱進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.3 疾病靶點(diǎn)收集

以“idiopathic pulmonary arterial hypertension”為關(guān)鍵詞，檢索GeneCards（https://www.genecards.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）數(shù)據(jù)庫，所得結(jié)果合并、去除重復(fù)，將篩選出的靶點(diǎn)基因名稱通過UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行規(guī)范。

1.4 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

利用OmicShare平臺（https://www.omicshare.com/）繪制天龍咳喘靈活性成分靶點(diǎn)和IPAH靶點(diǎn)的維恩圖，存在交集的共同靶點(diǎn)可能是天龍咳喘靈抗IPAH的關(guān)鍵靶點(diǎn)。將天龍咳喘靈及其藥味名、疾病名、關(guān)鍵靶點(diǎn)及對應(yīng)的活性成分導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件，構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)置參數(shù)以節(jié)點(diǎn)大小反映其度值大小。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫（https://stringdb.org/）構(gòu)建蛋白相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置蛋白種屬為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為“highest confidence”（0.900）。將PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，設(shè)置參數(shù)以節(jié)點(diǎn)大小和顏色深淺反映其度值大小，以邊的粗細(xì)反映結(jié)合率評分高低。

1.6 GO和KEGG通路富集分析

采用R clusterProfiler 3.16.1軟件對關(guān)鍵靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG通路富集分析。GO富集分析包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞組分（cellular component，CC）三部分，保留校正后的值（.adjust）＜0.01的結(jié)果；通過KEGG通路富集分析以確定關(guān)鍵靶點(diǎn)的作用通路，保留.adjust＜0.01的結(jié)果。

1.7 分子對接驗(yàn)證

將所有核心成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對接，并用臨床治療IPAH的靶向藥物依前列醇、西地那非和波生坦進(jìn)行對照。首先通過PubChem數(shù)據(jù)庫獲得各核心成分的SDF文件，依次導(dǎo)入殷賦云計(jì)算平臺（https://cloud.yinfotek.com/console/）的“小工具-準(zhǔn)備化合物結(jié)構(gòu)”進(jìn)行加氫、加電荷和MMFF94力場下能量優(yōu)化。利用AutoDockTools1.5.6軟件依次檢測可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)目，納入可旋轉(zhuǎn)鍵數(shù)＜10的核心成分進(jìn)行對接。對于核心靶點(diǎn)，首先利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫（http://www.rcsb.org/pdb）依次獲得PDB文件，蛋白種屬設(shè)置為“Homo sapiens”，實(shí)驗(yàn)方法選擇X射線衍射，篩選綜合分辨率、得分最高的蛋白結(jié)構(gòu)，并導(dǎo)入殷賦云計(jì)算平臺的“小工具-處理PDB結(jié)構(gòu)”對蛋白質(zhì)進(jìn)行隱藏溶劑、去水和去配體。經(jīng)AutoDockTools1.5.6軟件處理后，將核心成分和核心靶點(diǎn)導(dǎo)入AutoDock4.2.6進(jìn)行分子對接，采用拉馬克遺傳算法對二者的最佳結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測，設(shè)置初始種群數(shù)為150、能量評定最大次數(shù)為2500 000、對接的構(gòu)象數(shù)目為50個(gè)，其他參數(shù)選擇默認(rèn)值。以結(jié)合能作為評價(jià)指標(biāo)，使用PyMOL2.4軟件對構(gòu)象進(jìn)行可視化及氫鍵繪制。靶向藥物的處理流程同上。

1.8 核心靶點(diǎn)的微陣列芯片驗(yàn)證

為檢驗(yàn)核心靶點(diǎn)可靠性，以“idiopathic pulmonary arterial hypertension”為關(guān)鍵詞，檢索美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）的GEO數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），篩選IPAH相關(guān)的微陣列芯片數(shù)據(jù)集。數(shù)據(jù)采用Robust-Multi-Array（RMA）方法進(jìn)行背景矯正和log標(biāo)準(zhǔn)化處理。使用R PCAtools 2.5.15進(jìn)行主成分分析并進(jìn)行可視化，檢查樣本聚類的一致性。然后利用GEO2R在線平臺（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）篩選IPAH樣本的差異表達(dá)基因（DEGs），篩選閾值為.adjust＜0.05和|log2FC|＞1，利用R EnhanceVolcano 1.6.0繪制火山圖。最后將DEGs與核心靶點(diǎn)取交集，驗(yàn)證上述分析的準(zhǔn)確性。

1.9 xCell評分估計(jì)和相關(guān)性分析

使用R xCell 1.1.0進(jìn)行評分，估計(jì)數(shù)據(jù)集中IPAH組與對照組之間64種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類型的豐度。使用R ggplot23.3.5和R ggpubr 0.4.0繪制箱線圖，以可視化2組之間所有細(xì)胞類型豐度的差異。采用克魯斯卡爾-沃利斯檢驗(yàn)（Kruskal-Wallis test）進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再根據(jù)Travaglini等人類肺部細(xì)胞圖譜篩選差異細(xì)胞類型。然后使用R ggstatsplot 0.9.0對核心靶點(diǎn)和差異細(xì)胞類型進(jìn)行Spearman相關(guān)性分析并進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 天龍咳喘靈活性成分

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索并篩選得到除青天葵外天龍咳喘靈的活性成分，分別為半夏13個(gè)、款冬花22個(gè)、附子21個(gè)、魚腥草7個(gè)、北五味子8個(gè)、黃芩36個(gè)、芥子3個(gè)、細(xì)辛8個(gè)和麻黃23個(gè)。通過HERB數(shù)據(jù)庫獲得青天葵活性成分33個(gè)。兩者合并、去重后得到160個(gè)活性成分，部分活性成分基本信息見表1。

表1 天龍咳喘靈部分活性成分基本信息

2.2 藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

160個(gè)活性成分通過HERB、SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫查找到潛在關(guān)聯(lián)靶點(diǎn)957個(gè)，通過GeneCards、DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索出IPAH相關(guān)靶點(diǎn)86個(gè)，將藥物活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，獲得38個(gè)共同靶點(diǎn)，即天龍咳喘靈抗IPAH的關(guān)鍵靶點(diǎn)，維恩圖見圖1。利用Cytoscape3.8.0軟件構(gòu)建藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，見圖2。

圖1 天龍咳喘靈活性成分、天龍咳喘靈與IPAH共同靶點(diǎn)維恩圖

圖2 天龍咳喘靈抗IPAH藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

該網(wǎng)絡(luò)由121個(gè)節(jié)點(diǎn)（1個(gè)疾病名、1個(gè)藥物名、10個(gè)藥味名、71個(gè)活性成分和38個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)）和294條邊組成。將109個(gè)節(jié)點(diǎn)和214條邊（除去疾病名、藥物名、藥味名和相連成分的邊）納入網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析。所有活性成分平均度值為4.07，高于均值的活性成分有9個(gè)，將其作為天龍咳喘靈抗IPAH的核心成分；所有靶點(diǎn)平均度值為3.93，高于均值的靶點(diǎn)有13個(gè)。核心成分及篩選后的靶點(diǎn)見表2。

表2 天龍咳喘靈抗IPAH藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析

2.3 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)和核心靶點(diǎn)

將38個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。該網(wǎng)絡(luò)包括32個(gè)節(jié)點(diǎn)和75條邊（其中6個(gè)靶點(diǎn)不連接其他蛋白，故不顯示）。經(jīng)Cytoscape3.8.0軟件網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，各節(jié)點(diǎn)的平均度值為4.69，平均介數(shù)為0.05，平均接近中心性為0.46，平均最短路徑長度為2.34。度值、介數(shù)、接近中心性均高于均值且平均最短路徑長度低于均值的靶點(diǎn)共有3個(gè)，見表3。綜合表2、表3，PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA可能是天龍咳喘靈抗IPAH的核心靶點(diǎn)。

圖3 天龍咳喘靈抗IPAH關(guān)鍵靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

表3 天龍咳喘靈抗IPAH PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點(diǎn)基本信息

2.4 GO富集分析

38個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)GO富集分析得到958個(gè)顯著富集條目（.adjust＜0.01），其中BP條目925個(gè)，涉及循環(huán)系統(tǒng)中的血管過程、管徑調(diào)節(jié)、血管直徑調(diào)節(jié)等；CC條目11個(gè)，涉及膜筏、膜微區(qū)、小窩等；MF條目22個(gè)，涉及細(xì)胞因子活性、受體配體活性、細(xì)胞因子受體結(jié)合等。根據(jù).adjust值從小到大選取前10位BP、MF、CC條目繪制氣泡圖，見圖4。

圖4 天龍咳喘靈抗IPAH關(guān)鍵靶點(diǎn)GO功能富集分析

2.5 KEGG通路富集分析

38個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)顯著富集在48條通路上（.adjust＜0.01）。根據(jù).adjust值從小到大選取前10條通路，見圖5。主要通路有糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、TNF信號通路和鈣信號通路等，提示天龍咳喘靈通過作用于多條通路發(fā)揮治療IPAH的作用。

圖5 天龍咳喘靈抗IPAH關(guān)鍵靶點(diǎn)KEGG通路富集分析

2.6 分子對接驗(yàn)證

核心成分、靶向藥物與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果見表4。一般認(rèn)為，受體蛋白與配體結(jié)合能≤0 kcal/mol提示二者存在自發(fā)結(jié)合，結(jié)合能≤-5 kcal/mol時(shí)可能具有較好的結(jié)合活性。分子對接結(jié)果顯示，核心成分與核心靶點(diǎn)幾乎均可自發(fā)結(jié)合，其中PTGS2與槲皮素、木犀草素、2"-脫氧胸苷、熊果酸、山柰酚、漢黃芩素和隱品堿的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol；NOS2與木犀草素、熊果酸、山柰酚、漢黃芩素和隱品堿的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol；ADRB2與槲皮素、木犀草素、熊果酸和隱品堿的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol；VEGFA與熊果酸和隱品堿的結(jié)合能均小于-5 kcal/mol。熊果酸與各核心靶點(diǎn)的平均結(jié)合能最小，表明熊果酸與核心靶點(diǎn)的結(jié)合活性最好，且優(yōu)于依前列醇、西地那非和波生坦的結(jié)合活性。分子對接模式見圖6，顯示熊果酸與核心靶點(diǎn)受體蛋白周圍分子通過氫鍵等范德華力形成較為穩(wěn)定的構(gòu)象。

表4 天龍咳喘靈抗IPAH核心成分、靶向藥物與核心靶點(diǎn)分子對接結(jié)果

圖6 熊果酸與核心靶點(diǎn)分子對接模式

2.7 核心靶點(diǎn)微陣列芯片驗(yàn)證結(jié)果

最終選定微陣列芯片數(shù)據(jù)集GSE130391。該數(shù)據(jù)集基于GPL570 Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0陣列平臺，包含4例IPAH患者和4名健康人肺動脈的RNA樣本，主成分分析結(jié)果見圖7，4例IPAH患者與4名健康人的基因表達(dá)譜區(qū)分度良好，可保證后續(xù)差異表達(dá)分析的準(zhǔn)確性。最終篩選得到DEGs共2469個(gè)，其中表達(dá)上調(diào)1361個(gè)、下調(diào)1108個(gè)，組間差異火山圖見圖8。DEGs與核心靶點(diǎn)取交集后得到2個(gè)交集基因，分別為PTGS2和VEGFA，表明上述分析可靠。

圖7 IPAH數(shù)據(jù)集樣本主成分分析

圖8 IPAH數(shù)據(jù)集樣本DEGs火山圖

2.8 xCell評分估計(jì)結(jié)果

IPAH組與對照組之間64種免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞類型的豐度差異見圖9。組間共有27種細(xì)胞類型差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（＜0.05），再根據(jù)人類肺部細(xì)胞圖譜進(jìn)一步篩選差異細(xì)胞類型，保留上皮細(xì)胞（Epithelial cells）、CD8陽性T細(xì)胞（CD8+T cells）、B細(xì)胞（B cells）、樹突狀細(xì)胞（DC）、內(nèi)皮細(xì)胞（Endothelial cells）、CD8陽性幼稚T細(xì)胞（CD8+naive T cells）、CD4陽性幼稚T細(xì)胞（CD4+naive T cells）、CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞（CD4+Tem）、漿細(xì)胞（Plasma cells）、自然殺傷T細(xì)胞（NKT）、周細(xì)胞（Pericytes）和M1型巨噬細(xì)胞（Macrophages M1）12種細(xì)胞類型作為最終的差異細(xì)胞類型。

圖9 IPAH數(shù)據(jù)集樣本64種細(xì)胞類型豐度箱線圖

2.9 核心靶點(diǎn)與差異細(xì)胞類型相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果表明，PTGS2與自然殺傷T細(xì)胞（=0.74，=0.037）、樹突狀細(xì)胞（=0.74，=0.037）、上皮細(xì)胞（=0.74，=0.037）、周細(xì)胞（=0.71，=0.047）呈正相關(guān)，與CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞（=-0.85，=0.007）、B細(xì)胞（=-0.79，=0.027）、CD8陽性T細(xì)胞（=-0.57，=0.037）、CD4陽性幼稚T細(xì)胞（=-0.74，=0.037）呈負(fù)相關(guān)。VEGFA與B細(xì)胞（=-0.86，=0.007）和CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞（=-0.80，=0.017）呈負(fù)相關(guān)，而ADRB2、NOS2與所有差異細(xì)胞類型無相關(guān)性。

3 討論

天龍咳喘靈針對肺系疾病病機(jī)特點(diǎn)，以“溫腎化痰活血”為核心理念，治療IPAH患者氣虛不固、血行不暢、濕邪阻滯等病證，對改善血管功能障礙、血栓形成等病理表現(xiàn)具有潛在功效。由于天龍咳喘靈多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)，需借助高通量測序技術(shù)、計(jì)算機(jī)輔助技術(shù)、藥物相關(guān)數(shù)據(jù)庫等多學(xué)科交叉的基礎(chǔ)上對藥物的作用機(jī)制進(jìn)行多維度探索。因此，本研究基于整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法對天龍咳喘靈抗IPAH進(jìn)行可行性分析并探討其作用機(jī)制。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接發(fā)現(xiàn)，天龍咳喘靈中抗IPAH相關(guān)的核心成分共9個(gè)，其中與核心靶點(diǎn)結(jié)合活性最好且優(yōu)于對照藥物的是熊果酸。熊果酸存在于青天葵中，具有抗炎、抗腫瘤血管生成、抗氧化及降血壓等多種藥理作用。同時(shí)，熊果酸可改善阿霉素處理小鼠的左心室縮短率和左心室射血分?jǐn)?shù)，提高NO水平，抑制活性氧生成，減少心肌細(xì)胞凋亡。此外，熊果酸還可以通過調(diào)節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體α依賴的脂肪酸代謝抑制野百合堿處理大鼠的右心功能障礙與重構(gòu)、心肌肥大、纖維化和心肌細(xì)胞凋亡。NO缺乏與右心衰竭均為IPAH的病理特征，表明熊果酸具有抗IPAH潛在功效。除熊果酸外，青天葵中的2"-脫氧胸苷和L-色氨酸作為核心成分均可與核心靶點(diǎn)穩(wěn)定結(jié)合。而青天葵作為天龍咳喘靈的君藥，高度提示天龍咳喘靈抗IPAH存在較大的可行性。

通過藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和PPI網(wǎng)絡(luò)分析，從38個(gè)疾病靶點(diǎn)中篩選出4個(gè)核心靶點(diǎn)PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA。PTGS2可將花生四烯酸代謝成特定的前列腺素（PG）產(chǎn)物，研究表明該基因在病理?xiàng)l件下起到雙刃劍作用，一方面刺激促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生而加重炎癥反應(yīng)，另一方面促進(jìn)具有心血管保護(hù)作用的前列環(huán)素產(chǎn)生，或增加肺血管內(nèi)皮細(xì)胞中PGE2的合成以維持血管微環(huán)境穩(wěn)態(tài)，甚至純合敲除PTGS2小鼠在慢性缺氧條件下產(chǎn)生更嚴(yán)重的肺動脈高壓（PAH），提示該基因在PAH的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。NOS2通過半胱氨酸蛋白酶-1激活后可以產(chǎn)生大量NO，而過量的NO會引起氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致肺動脈和右心重塑。ADRB2編碼β腎上腺素能受體，研究表明其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用在PAH中呈現(xiàn)階段性變化：活化的β腎上腺素能受體在病程早期對右心室具有保護(hù)作用，并可能通過促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞的募集改善肺血管重構(gòu)，對PAH的治療具有潛在益處。而在病程晚期則可能激活β-AR-G-PKA/CaMKⅡ信號通路而促進(jìn)右心重塑和心肌細(xì)胞凋亡增加，最終導(dǎo)致右心衰竭。VEGFA是血管內(nèi)皮生長因子家族的成員，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生成，通過PI3K/AKT信號通路抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，維持內(nèi)皮細(xì)胞的活性，有助于肺部受損微血管再生和防止現(xiàn)有血管丟失，延緩PAH的發(fā)生發(fā)展。

鑒于核心靶點(diǎn)與IPAH關(guān)聯(lián)的研究較少，因此借助xCell評估和相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，PTGS2與自然殺傷T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞和周細(xì)胞呈顯著正相關(guān)，與CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞、B細(xì)胞、CD8陽性T細(xì)胞和CD4陽性幼稚T細(xì)胞呈負(fù)相關(guān)，VEGFA與B細(xì)胞和CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞呈顯著負(fù)相關(guān)。研究表明CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞、CD8陽性T細(xì)胞、CD4陽性幼稚T細(xì)胞、B細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在IPAH的病程進(jìn)展中起重要作用；IPAH患者體內(nèi)免疫紊亂，存在自身免疫病理損傷，可能是自然殺傷T細(xì)胞缺乏的主要因素；PAH患者周細(xì)胞功能缺陷可導(dǎo)致肺血管再生障礙。因此，我們推測PTGS2通過升高自然殺傷T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和周細(xì)胞，或減少CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞、CD8陽性T細(xì)胞、CD4陽性幼稚T細(xì)胞、B細(xì)胞，VEGFA通過減少B細(xì)胞和CD4陽性效應(yīng)記憶型T細(xì)胞參與IPAH的發(fā)生發(fā)展。以上假設(shè)還需進(jìn)一步研究來闡明核心靶點(diǎn)和免疫細(xì)胞及其他細(xì)胞類型之間復(fù)雜的相互作用。

GO富集分析表明，天龍咳喘靈抗IPAH可能通過調(diào)節(jié)血管的多種生理功能、能量代謝過程，涉及神經(jīng)遞質(zhì)、血紅素、不同細(xì)胞組分的蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)發(fā)揮療效。KEGG通路富集分析表明，天龍咳喘靈抗IPAH可能主要涉及糖尿病并發(fā)癥AGE-RAGE信號通路、血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、鈣信號通路等。血流剪切應(yīng)力是內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵因素，當(dāng)內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)失衡會導(dǎo)致叢狀病變、慢性炎癥細(xì)胞浸潤和肺動脈原位血栓形成等IPAH特征性病理改變，因此可以通過調(diào)節(jié)血流剪切應(yīng)力來改善內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α是應(yīng)答缺氧應(yīng)激的關(guān)鍵蛋白，有研究表明，在人肺動脈平滑肌細(xì)胞中使用siRNA敲除HIF-1α可以增加miRNA-543的表達(dá)，從而上調(diào)內(nèi)皮素-1（ET-1）的表達(dá)。ET-1通過細(xì)胞膜上的ET-1受體直接作用于人PASMCs，增加肺動脈血管張力。另外，在IPAH患者的上皮細(xì)胞中HIF-1α顯著表達(dá)，刺激血管和紅細(xì)胞的生成。PASMCs胞漿內(nèi)游離Ca濃度的增加也是促使血管收縮和刺激肺動脈平滑肌肥厚的重要因素，已有研究證實(shí)，急性血管反應(yīng)試驗(yàn)陽性的IPAH患者受益于鈣通道阻滯劑，因此調(diào)節(jié)鈣信號通路對治療IPAH具有重要意義?？梢钥闯?，天龍咳喘靈可能通過IPAH的關(guān)鍵信號通路來發(fā)揮治療作用。

綜上所述，本研究通過整合藥理學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)預(yù)測了天龍咳喘靈抗IPAH的核心成分及核心靶點(diǎn)的潛在作用機(jī)制，提示天龍咳喘靈可能通過熊果酸等活性成分靶向PTGS2、NOS2、ADRB2和VEGFA基因，調(diào)節(jié)B細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、CD8陽性T細(xì)胞、CD4陽性幼稚T細(xì)胞等細(xì)胞類型，調(diào)控血流剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化、HIF-1信號通路、鈣信號通路等多條通路發(fā)揮治療作用，可為后續(xù)天龍咳喘靈抗IPAH的藥理學(xué)研究和臨床試驗(yàn)提供理論依據(jù)和豐富線索。