響應(yīng)面法優(yōu)化花生中黃曲霉毒素的提取及其在快檢評(píng)價(jià)中的應(yīng)用

趙 萍,張盈月,周家宏,陳 飛2,

(1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)(2.南京師范大學(xué)南京市特色生物資源功能成分開(kāi)發(fā)工程研究中心,江蘇 南京 210023)(3.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023)

真菌毒素對(duì)糧食的污染在全球范圍內(nèi)都較普遍. 據(jù)聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì),全世界每年約有25%的糧食受到真菌毒素污染,約有2%的農(nóng)作物因污染嚴(yán)重而失去利用價(jià)值. 黃曲霉毒素是常見(jiàn)的污染之一. 黃曲霉毒素(Aflatoxin B1/B2/G1/G2,AFTS)主要是由黃曲霉(Aspergillusflavus)及寄生曲霉(Aspergillusparasiticus)產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物. 黃曲霉毒素主要污染糧油及其制品,特別是花生和玉米等含水量較高的禾谷類(lèi)及油料作物[1],其中黃曲霉毒素B1(AFB1)毒性最大,是一種強(qiáng)遺傳毒性致癌物.

國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)已將AFB1和自然發(fā)生的AFTS混合物歸類(lèi)為第1類(lèi)致癌物質(zhì)(人類(lèi)致癌物質(zhì);國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu),IARC 1993,2002年)[2]. 鑒于AFTS的強(qiáng)毒性,全球已有60多個(gè)國(guó)家制訂了食品和飼料中的AFTS限量標(biāo)準(zhǔn)和法規(guī)[3-4]. 國(guó)際食品法典委員會(huì)(CAC)規(guī)定,食品中AFTS的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為15.0 μg/kg;歐盟規(guī)定直接食用花生中AFB1的限量值為2.0 μg/kg,AFTS總和為4.0 μg/kg;美國(guó)食品與藥物監(jiān)督管理局(FDA)規(guī)定,食品中AFTS的限量值為15.0 μg/kg;我國(guó)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定玉米、花生中AFB1的限量20.0 μg/kg,稻谷、糙米、大米中AFB1的限量為10.0 μg/kg,小麥及其他谷物中AFB1的限量為5.0 μg/kg. 相比于發(fā)達(dá)國(guó)家,我國(guó)制定的限量標(biāo)準(zhǔn)只對(duì)AFB1總量作出規(guī)定,并無(wú)對(duì)AFTS總量的限制要求[5].

隨著各種法規(guī)所規(guī)定的食品和飼料中黃曲霉毒素限量水平的降低,迫切需要開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證更可靠的分析方法來(lái)測(cè)定真菌毒素. 目前常用的分析技術(shù)包括快速篩查和確證定量[6-10]. 快速篩查主要以免疫化學(xué)為基礎(chǔ),如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、膠體金免疫滲濾法、膠體金免疫層析法等,市場(chǎng)上大部分關(guān)于真菌毒素的快檢產(chǎn)品即基于上述免疫化學(xué)技術(shù)原理,這些檢測(cè)方法具有快速、簡(jiǎn)便、靈敏度高等特點(diǎn). 確證定量主要以色譜技術(shù)為基礎(chǔ),如高效液相色譜法、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等,色譜類(lèi)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性高、重現(xiàn)性好、靈敏度高,但對(duì)設(shè)備依賴(lài)性強(qiáng),檢測(cè)成本高. 我國(guó)快檢技術(shù)較起步較晚,技術(shù)不成熟,快檢產(chǎn)品評(píng)價(jià)體系不完善,市場(chǎng)上的快檢產(chǎn)品良莠不齊,部分產(chǎn)品無(wú)法滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,易出現(xiàn)重復(fù)性差、假陰性率高等情況,特別是對(duì)復(fù)雜基質(zhì)進(jìn)行額外處理導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn),造成對(duì)食品安全監(jiān)管的阻礙[11]. 因此,規(guī)范試劑盒的使用,并確保所使用的快檢產(chǎn)品符合相關(guān)質(zhì)量管理與質(zhì)量控制要求,成為了保障食品安全的重點(diǎn)之一.

分析檢測(cè)在食品安全的控制和管理中起著至關(guān)重要的作用,開(kāi)發(fā)改進(jìn)樣品中真菌毒素的提取方法一直是研究的熱點(diǎn),是關(guān)系著分析檢測(cè)能否成功的關(guān)鍵因素[12-14]. 快檢產(chǎn)品雖然具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便、靈敏等特點(diǎn),可用于糧油產(chǎn)品的質(zhì)量監(jiān)控,但市場(chǎng)上仍有部分產(chǎn)品無(wú)法滿足標(biāo)準(zhǔn)要求,因此在快檢產(chǎn)品使用前,有必要應(yīng)用更為可靠的方法對(duì)其進(jìn)行評(píng)價(jià)驗(yàn)證. 本文提出對(duì)參考方法的提取條件利用超聲輔助響應(yīng)面設(shè)計(jì)的方法進(jìn)行優(yōu)化[15],使樣品中的黃曲霉毒素釋放更加完全,毒素檢測(cè)值更接近真實(shí)水平,從而提高參考方法的準(zhǔn)確度,進(jìn)一步提高快檢試劑盒驗(yàn)證指標(biāo)的準(zhǔn)確性,可用于試劑盒評(píng)價(jià).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

去殼花生米(河南蘭考);甲醇、乙腈、乙醇(TEDIA,色譜純);AFB1標(biāo)準(zhǔn)品溶液、AFTS混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、AFTS免疫親和柱(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司);AFB1試劑盒:定性試劑盒8家,定量試劑盒2家.

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀Agilent 1100(配有熒光檢測(cè)器)(安捷倫科技有限公司);HF2500柱后光化學(xué)衍生器(北京華安麥科生物有限公司,需另配);SCIENTZ-650E超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司);D3024R高速冷凍離心機(jī)(大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);XH-A旋渦混合器(南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所).

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 黃曲霉毒素的提取

花生去殼后粉碎并過(guò)24目篩后備用. 稱(chēng)取上述花生樣品5 g,根據(jù)設(shè)計(jì)的體積分?jǐn)?shù)及料液比加入溶劑,渦旋混勻,根據(jù)設(shè)計(jì)的不同超聲時(shí)間及超聲功率進(jìn)行超聲破碎,在8 000 r/min下離心10 min,取上清備用.

1.3.2 色譜條件

色譜柱:C18(2.1 mm×150 mm;1.7 μm);進(jìn)樣量:20 μL;柱溫:40 ℃;流動(dòng)相:甲醇∶水=50∶50;流速:1.0 mL/min. 熒光檢測(cè)器:激發(fā)波長(zhǎng):360 nm;發(fā)射波長(zhǎng):440 nm. 另配光化學(xué)衍生器.

1.3.3 黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

AFTS標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的制備:以濃度為2.6 μg/mL的AFTS(AFB1∶AFB2∶AFG1∶AFG2=3∶1∶3∶1)混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液,溶解于甲醇,分別配制5.2、13、26、52、104 ng/mL不同梯度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

1.3.4 黃曲霉毒素提取工藝優(yōu)化

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[12,16-19]中關(guān)于AFB1的提取工藝,選擇甲醇、乙腈、乙醇3種不同溶劑及5種對(duì)花生中AFTS提取量有較大影響的因素(不同體積分?jǐn)?shù)、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率)進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn). 在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上,采用Box-Benhnken Design中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法優(yōu)化AFTS的提取工藝.

1.3.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

研究不同的溶劑及體積分?jǐn)?shù)(60%甲醇、60%乙腈、60%乙醇;70%甲醇、70%乙腈、70%乙醇;80%甲醇、80%乙腈、80%乙醇)、料液比(1∶3,1∶4,1∶5,1∶6,1∶7(g∶mL))、超聲時(shí)間(5、10、15、20、30 min)、超聲功率(160、180、200、220、240 W)對(duì)花生中AFTS提取量的影響,重復(fù)3次,取均值.

1.3.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ),通過(guò)Design-Expert 11軟件,根據(jù)Box-Benhnken Design 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理對(duì)花生中黃曲霉毒素提取的溶劑比、料液比、超聲時(shí)間、超聲功率進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),以AFTS提取量為響應(yīng)值(Y),設(shè)計(jì)四因素三水平的相應(yīng)實(shí)驗(yàn),如表1所示.

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.3.5 參考方法的驗(yàn)證

按照優(yōu)化后的提取條件進(jìn)行樣品制備,標(biāo)準(zhǔn)工作溶液為AFB1(濃度分別為0.5、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0 ng/mL),以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程. 對(duì)空白花生進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn),加標(biāo)水平為10、15、20 μg/kg,重復(fù)3次,取均值,計(jì)算擬合度R2和加標(biāo)回收率.

1.3.6 快檢試劑盒驗(yàn)證[20]

根據(jù)GB2761—2017《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):食品中真菌毒素限量》,花生及其制品中黃曲霉毒素B1的限量指標(biāo)為20 μg/kg;將AFB1含量>20 μg/kg的樣品稱(chēng)為陽(yáng)性樣品,<20 μg/kg的樣品稱(chēng)為陰性樣品.

1.3.6.1 定性試劑盒驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)方法:選擇市場(chǎng)上8家不同品牌的主流AFB1定性試劑盒廠家的產(chǎn)品進(jìn)行實(shí)驗(yàn),依次編號(hào)1-8,產(chǎn)品基本信息如表2所示. 根據(jù)不同廠家試劑盒的說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行相應(yīng)的前處理,制備陰性樣品(加標(biāo)水平10 μg/kg)、陽(yáng)性樣品(加標(biāo)水平30 μg/kg),平行測(cè)定5次.

驗(yàn)證指標(biāo):靈敏度、特異性、假陰性率、假陽(yáng)性率、符合率.

1.3.6.2 定量試劑盒驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)方法:選購(gòu)市場(chǎng)上兩家主流的AFB1酶聯(lián)免疫試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià),編號(hào)A、B,基本信息如表2所示. 分別評(píng)價(jià)低(加標(biāo)水平10 μg/kg)、中(加標(biāo)水平30 μg/kg)、高(加標(biāo)水平40 μg/kg)3個(gè)水平的樣品. 每個(gè)水平制備2個(gè)樣品,每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定3次,即一個(gè)水平的樣品重復(fù)測(cè)定6次(n=6);制備兩個(gè)空白樣品(不加標(biāo)),每個(gè)平行測(cè)定10次(n=20).

表2 試劑盒基本信息

驗(yàn)證指標(biāo):準(zhǔn)確度、線性和范圍、檢測(cè)限和定量限、參考方法一致性.

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel及Origin Pro 9.1軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析;采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行響應(yīng)面中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì),對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合,作出響應(yīng)曲面圖,并進(jìn)行線性回歸和方差分析. 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值,P<0.05,為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著差異.

2 結(jié)果與分析

對(duì)按照1.3.3節(jié)制備的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè),得到AFTS的標(biāo)準(zhǔn)曲線公式為y=79 768x+53 302,R2=0.999 5.

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示. 由圖1(a)可以觀察到,在相同溶劑不同的體積分?jǐn)?shù)下,提取量隨著體積分?jǐn)?shù)的增加呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),這可能是由于黃曲霉毒素難溶于水,因此有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)小的提取量低,隨著有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)的增加花生中脂溶性等成分溶出量也會(huì)增加,這些成分影響黃曲霉毒素的溶出率,從而導(dǎo)致提取量低[21]. 因此考慮60%～80%的溶劑體積分?jǐn)?shù)為進(jìn)一步的優(yōu)化范圍. 在相同體積分?jǐn)?shù)下,甲醇、乙腈、乙醇3種不同溶劑對(duì)黃曲霉毒素的提取量是甲醇>乙腈>乙醇. 綜上,選取60%～80%的甲醇溶液進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

圖1 單因素實(shí)驗(yàn)對(duì)提取量的影響

由圖1(b)可以發(fā)現(xiàn),隨著料液比的增加,提取量呈現(xiàn)先上升后下降的現(xiàn)象,這可能是隨著樣品與溶劑的接觸面積加大且伴隨著溶劑濃度的增加[22],促使樣品中的黃曲霉毒素溶出率增加;增加到一定量后,溶劑趨于飽和,黃曲霉毒素的溶出趨于平衡,提取量幾乎不再變化;此時(shí)再提高料液比,反而會(huì)使樣品中其他雜質(zhì)成分溶出,阻礙了黃曲霉毒素與溶劑的結(jié)合,導(dǎo)致提取量降低. 因此,本文選擇料液比1∶3、1∶4、1∶5(g∶mL)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

由圖1(c)可以發(fā)現(xiàn),隨著超聲時(shí)間增加,黃曲霉毒素提取量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì). 超聲有助于黃曲霉毒素的提取,在一定程度上,超聲時(shí)間越長(zhǎng),黃曲霉毒素提取量越大;超聲時(shí)間大于15 min后,提取量反而降低,可能是過(guò)長(zhǎng)的超聲時(shí)間導(dǎo)致雜質(zhì)溶出,影響黃曲霉毒素的釋放[23]. 因此,本文選擇超聲時(shí)間10、15、20 min進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

由圖1(d)可以發(fā)現(xiàn),黃曲霉毒素提取量隨超聲功率的加強(qiáng)先增加后減少. 超聲有助于黃曲霉毒素的提取,隨著超聲頻率的增加,促進(jìn)了黃曲霉毒素的溶解,從而提取量增加;當(dāng)超聲功率增加到220 W后,提取量反而減少,可能是過(guò)高的頻率使樣品中的其他雜質(zhì)溶出阻礙了黃曲霉毒素的溶解[24]. 因此,選取180、200、220 W進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn).

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果確定因素與水平,以黃曲霉毒素提取量為響應(yīng)值,采用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化黃曲霉毒素提取工藝,設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 黃曲霉毒素提取的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

利用Design-Expert 11軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合,得到二次多項(xiàng)回歸模型方程:

Y=7.307 04+0.072 192A+0.056 850B+0.352 667C+0.059 233D-0.000 012AB+0.000 375AC+1.927 92×10-17AD+

0.000 18BC+0.000 027BD-0.000 600CD-0.000 505A2-0.000 130B2-0.051 875C2-0.002 090D2.

從表4結(jié)果可知,模型P值<0.050 0,說(shuō)明模擬項(xiàng)顯著,表明回歸模型達(dá)到顯著水平[23].在這種情況下,A、B、D、A2、B2、C2、D2都是重要的模型項(xiàng).失擬項(xiàng)的P值大于0.050 0，表示失擬項(xiàng)不顯著,模型不失擬,選擇合理.預(yù)測(cè)的R2為0.943 7,與調(diào)整后的R2差值小于0.2,說(shuō)明模型符合,能夠用于對(duì)花生中AFTS的提取工藝條件進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)[25].

表4 回歸方程的方差分析

等高線的形狀反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小,圓形表示兩種因素交互作用不顯著,而橢圓形則與之相反[26]. 由圖2可知,甲醇體積分?jǐn)?shù)、超聲功率、料液比和超聲時(shí)間之間的交互作用對(duì)花生中AFTS提取效果的影響均出現(xiàn)拋物面型關(guān)系,所得到的響應(yīng)面都存在一個(gè)極大值點(diǎn).

圖2 兩因素交互作用對(duì)AFTS提取效果影響的響應(yīng)面和等高線

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化,根據(jù)擬合二階模型公式得到理論上花生中黃曲霉毒素的最佳提取工藝條件為:甲醇溶液濃度65.578%,超聲功率206.696 W,料液比1∶4.064,超聲時(shí)間14.700 min. 在此最優(yōu)條件下,AFTS提取量的理論值為18.346 μg/kg. 考慮到實(shí)際操作的可行性,將上述最優(yōu)條件調(diào)整為甲醇體積分?jǐn)?shù)65%,超聲功率206 W,料液比1∶4,超聲時(shí)間15 min. 為了驗(yàn)證該模型的有效性及實(shí)用性,在此最佳提取條件下對(duì)該模型做3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn),花生中AFTS的提取量均值為18.06 μg/kg,與預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致. 可見(jiàn),該模型能較好地預(yù)測(cè)實(shí)際黃曲霉毒素的提取情況[27],因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中使用該最佳提取工藝條件.

2.3 參考方法驗(yàn)證

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)作圖,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如圖3所示. 標(biāo)準(zhǔn)品工作液的線性關(guān)系良好,R2=0.999 7,能夠滿足檢測(cè)的要求.

圖3 AFB1標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.1 基質(zhì)實(shí)驗(yàn)

選取花生樣品按照參考方法處理后進(jìn)行檢測(cè),重復(fù)3次,計(jì)算后發(fā)現(xiàn)基質(zhì)樣品中的AFB1值低于檢測(cè)限,說(shuō)明樣品中AFB1含量極少,可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn).

2.3.2 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

對(duì)優(yōu)化后的參考方法進(jìn)行加標(biāo)回收驗(yàn)證,如表5所示,參考方法的3種加標(biāo)水平的平均回收率在90%～100%,符合回收率允許限. 與其他檢測(cè)黃曲霉毒素的方法相比,回收率相當(dāng),如姚譽(yù)陽(yáng)等[28]通過(guò)優(yōu)化提取條件、凈化方法和色譜條件建立了QuEChERS-高效液相色譜-柱后光化學(xué)衍生法檢測(cè)糧谷類(lèi)食品中的AFTS,對(duì)陰性樣品進(jìn)行3種水平的添加回收實(shí)驗(yàn),回收率均值在86.4%～97.8%;Li等[29]采用一種表面增強(qiáng)拉曼散射傳感策略來(lái)用于花生樣品中AFB1的定量測(cè)定,回收率在89%～121%之間;Jia等[30]建立了一種基于量子點(diǎn)納米棒的橫向流動(dòng)熒光條免疫傳感器,對(duì)低、中、高3種添加水平的蓮子的AFB1進(jìn)行測(cè)定,回收率在94.0%～116.0%之間. 說(shuō)明優(yōu)化后的參考方法可靠性較高,可采用此參考方法對(duì)試劑盒進(jìn)行評(píng)價(jià)驗(yàn)證.

表5 參考方法的加標(biāo)回收率

2.4 AFB1定性試劑盒驗(yàn)證

首先采用參考方法對(duì)兩種不同加標(biāo)水平的花生樣品中AFB1的含量進(jìn)行確證,結(jié)果如表6所示. 表7所示為定性試劑盒檢測(cè)結(jié)果. 如表8所示,經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,AFB1定性試劑盒檢測(cè)結(jié)果的靈敏度為100%,特異性為0.98,假陰性率為0,假陽(yáng)性率為2%;卡方檢驗(yàn)結(jié)果為0<3.84,表示試劑盒檢測(cè)方法與參考方法的陽(yáng)性確證比率在5%的置信區(qū)間內(nèi),無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,說(shuō)明試劑盒檢測(cè)結(jié)果與現(xiàn)有方法一致.

表6 參考方法檢測(cè)結(jié)果(n=5)

表7 AFB1定性試劑盒測(cè)定結(jié)果(n=5)

表8 AFB1定性試劑盒檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析

從檢測(cè)結(jié)果看,市場(chǎng)上的AFB1定性快檢技術(shù)已相對(duì)成熟,與實(shí)驗(yàn)室參考方法較為一致. 但實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中仍存在一些問(wèn)題. 由于膠體金法不能進(jìn)行準(zhǔn)確定量,只通過(guò)T線和C線的顯色判斷結(jié)果,若抗原濃度在小范圍波動(dòng)時(shí)難以準(zhǔn)確讀取測(cè)定結(jié)果,當(dāng)樣品的毒素含量在產(chǎn)品檢出限水平附近時(shí),可能會(huì)因檢驗(yàn)人員的主觀因素導(dǎo)致不同的判斷結(jié)果,從而導(dǎo)致結(jié)果呈現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的可能[31-32]. 實(shí)驗(yàn)室參考方法對(duì)花生中黃曲霉毒素的前處理進(jìn)行優(yōu)化后,無(wú)需復(fù)雜的試劑及儀器,加標(biāo)樣品的回收率>85%,說(shuō)明優(yōu)化后的提取方式能夠使樣品中的黃曲霉毒素盡可能地全部釋放出來(lái),使檢測(cè)結(jié)果更接近樣品中黃曲霉毒素的實(shí)際值. 可見(jiàn),試劑盒的質(zhì)量不僅體現(xiàn)于試紙條的靈敏度,還需要對(duì)樣品前處理方法進(jìn)行把控,使其在快速簡(jiǎn)便的基礎(chǔ)上保證更大程度地提取樣品中的毒素量,從而提高結(jié)果的準(zhǔn)確度.

2.5 AFB1定量試劑盒驗(yàn)證

圖4所示為兩家AFB1定量試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖. 如表9所示,試劑盒檢測(cè)空白(未加標(biāo))樣品的值均<1 μg/kg?20 μg/kg. 從表10和11可以看出,定量試劑盒檢測(cè)的結(jié)果與參考方法之間的偏倚程度較小,說(shuō)明試劑盒方法可靠性較高;兩家試劑盒的平均回收率都在85%以上,說(shuō)明試劑盒準(zhǔn)確度較高. 根據(jù)試劑盒自帶不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行檢測(cè),得到A廠家試劑盒定量的線性范圍為0.03～2.43 μg/kg;B廠家試劑盒定量的線性范圍為0.1～8.1 μg/kg. 兩家試劑盒的檢測(cè)限分別為1.706和2.261 μg/kg,遠(yuǎn)低于《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn):食品中真菌毒素限量標(biāo)準(zhǔn)》中的黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)值;定量限分別為1.909和2.274 μg/kg,均在線性范圍內(nèi);RSD分別為0.02和0.07,由此可知試劑盒的精密度較高且重復(fù)性較好.

表10 參考方法與AFB1定量試劑盒檢測(cè)結(jié)果(加標(biāo)樣品)對(duì)比

圖4 AFB1定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

表9 參考方法與AFB1定量試劑盒檢測(cè)結(jié)果(空白樣品)對(duì)比

AFB1是常見(jiàn)的一類(lèi)真菌毒素,市場(chǎng)上關(guān)于AFB1的酶聯(lián)免疫試劑盒技術(shù)相對(duì)成熟,檢測(cè)結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室參考方法對(duì)比進(jìn)行指標(biāo)評(píng)價(jià)后呈現(xiàn)較一致且良好的結(jié)果. 在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中對(duì)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備專(zhuān)業(yè)性、實(shí)驗(yàn)人員操作熟練度要求較高,否則易出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合度較差、檢測(cè)結(jié)果呈假陰性或假陽(yáng)性的情況. 本文在參考方法中以超聲輔助提取對(duì)花生樣品的前處理進(jìn)行了優(yōu)化,檢測(cè)結(jié)果的回收率>85%. 提高AFB1檢測(cè)結(jié)果的真實(shí)水平不僅依賴(lài)于儀器的精密度以及酶聯(lián)免疫試劑盒中檢測(cè)試劑的質(zhì)量,更需從源頭提高樣品中AFB1的提取量,減小因操作熟練度等造成的誤差[33].

表11 定量試劑盒驗(yàn)證指標(biāo)結(jié)果

3 結(jié)論

本文通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及超聲輔助響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)對(duì)花生中AFTS提取方法進(jìn)行了優(yōu)化,通過(guò)高效液相色譜—光化學(xué)柱后衍生法檢測(cè)花生中AFTS的提取量,結(jié)合實(shí)際操作可行性,確定了最優(yōu)的提取方式:甲醇體積分?jǐn)?shù)65%,超聲波功率206 W,料液比1∶4,超聲時(shí)間15 min. 利用上述最佳提取工藝并結(jié)合高效液相色譜—光化學(xué)柱后衍生法對(duì)花生中AFB1進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明花生中AFB1的低、中、高3種水平的加標(biāo)回收率均>85%,說(shuō)明此法可作為AFB1膠體金快檢方法和酶聯(lián)免疫快檢方法的參考方法.

本文對(duì)膠體金和酶聯(lián)免疫快檢方法進(jìn)行評(píng)價(jià)驗(yàn)證,經(jīng)數(shù)據(jù)分析可知AFB1定性及定量試劑盒的檢測(cè)結(jié)果基本能滿足市場(chǎng)監(jiān)管要求;但在實(shí)際檢測(cè)過(guò)程中,部分廠家的試劑盒存在前處理耗時(shí)過(guò)長(zhǎng)、試劑不常規(guī)且專(zhuān)業(yè)設(shè)備依賴(lài)性強(qiáng),從而失去了快速現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的意義;有些產(chǎn)品定性檢測(cè)判讀可視信號(hào)不明顯,易出現(xiàn)假陰性、假陽(yáng)性情況. 因此,不僅要對(duì)快檢方法的試劑及試紙條進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)管,還要注意快檢產(chǎn)品對(duì)樣品前處理方式的要求,在保證溶劑常規(guī)化的情況下要盡量?jī)?yōu)化提取步驟,使樣品中毒素的提取量盡可能接近真實(shí)水平,減小因儀器、人員操作等問(wèn)題產(chǎn)生的誤差,從而提高檢測(cè)效率.

本文通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化提取方法來(lái)提高花生中AFTS的提取量和檢測(cè)效率,同時(shí)增強(qiáng)了參考方法的可靠性,提高了對(duì)快檢方法評(píng)價(jià)驗(yàn)證指標(biāo)的要求. 本文認(rèn)為,有必要進(jìn)行試劑盒樣品基質(zhì)處理方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果干擾等方面的研究,尤其是檢測(cè)含有油脂類(lèi)的復(fù)雜基質(zhì),樣品的前處理方式對(duì)結(jié)果的準(zhǔn)確性影響尤為顯著. 本文從樣品處理方式對(duì)AFTS檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了研究,其他因素對(duì)于商品化試劑盒質(zhì)量的影響仍需進(jìn)一步的研究,從而使商品化試劑盒質(zhì)量的評(píng)價(jià)驗(yàn)證體系越來(lái)越完善,以切實(shí)保障食品安全.