基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接研究黃芪-附子治療慢性心力衰竭的機(jī)制

李鈺鑫 閻美卉 李 森

(北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京，102488)

慢性心力衰竭(Chronic Heart Failure，CHF)，又稱為慢性充血性心力衰竭，是一種臨床綜合征，表現(xiàn)為各種原因?qū)е滦呐K功能及結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，引起舒張功能障礙，血液不能正常充盈心臟，或指心臟無(wú)法將血液充分地泵出，使心排血量減少，進(jìn)而引起肺/體循環(huán)淤血、各組織灌注不足，甚至引發(fā)器官灌注受損。據(jù)統(tǒng)計(jì)，心力衰竭現(xiàn)已成為現(xiàn)代社會(huì)一個(gè)重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其發(fā)病率、死亡率高，預(yù)后差。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在發(fā)達(dá)國(guó)家55歲人群中，約有三分之一的人將發(fā)展為心力衰竭，且其診斷后5年生存率僅有35%[1]。2018年中國(guó)心血管病報(bào)告指出，我國(guó)心血管疾病死亡率占居民死亡率的40%，心力衰竭患病率約有1.3%，而心力衰竭的發(fā)病率與年齡正相關(guān)，中國(guó)老齡化問(wèn)題日趨嚴(yán)重，心力衰竭發(fā)病率及死亡率處于上升階段，因此防治心力衰竭已成為重要民生問(wèn)題[2]。心力衰竭最早出現(xiàn)于《金匱要略》，張仲景首次提出“心水”病，并記載：“其身重而少氣，不得臥，煩而燥，其人陰腫?！爆F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為心力衰竭大致屬于中醫(yī)基礎(chǔ)理論的“心水”“驚悸”“怔忡”“喘證”“水腫”等范疇[3-4]。

歐洲心臟病學(xué)會(huì)(European Society of Cardiology)指出，常用于治療心力衰竭的藥物大致有血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑、抗醛固酮?jiǎng)?、利尿劑、β受體阻滯藥、強(qiáng)心苷類等，盡管這些藥物能夠在短期內(nèi)提供較好療效，但某些藥物長(zhǎng)期使用會(huì)產(chǎn)生很多不良反應(yīng)，如長(zhǎng)期使用利尿劑可能導(dǎo)致低血鉀癥、心律失常等，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑可能會(huì)引發(fā)中性粒細(xì)胞減少、腎功能損傷等[5-8]。中醫(yī)治療心力衰竭的歷史悠久，療效突出，不良反應(yīng)小，中醫(yī)認(rèn)為心力衰竭病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，病位在心，并與肺、肝、脾、腎相關(guān)[9-10]。心力衰竭可分為氣虛血瘀、陰虛血瘀、陽(yáng)虛血瘀等基本證型[11]。在臨床中，心腎陽(yáng)虛證患者所占比例最大，對(duì)該類患者運(yùn)用益氣溫陽(yáng)、利水消腫法則具有很好療效[12]。黃芪、附子均為益氣溫陽(yáng)藥，黃芪可補(bǔ)氣健脾，升舉陽(yáng)氣，固表，利水，消腫，可補(bǔ)益后天之陽(yáng)；附子回陽(yáng)救急，溫腎助陽(yáng)，散寒止痛，可溫壯元陽(yáng)，大扶先天之陽(yáng)，二者配伍，可互相為用，增效減毒，臨床上此藥對(duì)常用于治療心力衰竭。含有黃芪-附子藥對(duì)的如芪附湯，常用來(lái)治療心力衰竭，芪藶強(qiáng)心膠囊，以黃芪附子為君藥，可增強(qiáng)心肌收縮以及改善心臟功能，療效顯著[13-15]；另外還有參附芪養(yǎng)心湯、麻黃附子黃芪湯、加味麻黃附子細(xì)辛湯、桂附養(yǎng)心湯、強(qiáng)心方均應(yīng)用這一藥對(duì)，臨床研究發(fā)現(xiàn)這些方劑對(duì)心律失常、心力衰竭均都有很好療效[16-20]。黃芪-附子藥對(duì)使用廣泛，但因其有效成分眾多，靶點(diǎn)復(fù)雜，涉及的分子機(jī)制尚不明確。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是通過(guò)構(gòu)建“中藥-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”的網(wǎng)絡(luò)，揭示小分子調(diào)控的原理，其優(yōu)點(diǎn)在于系統(tǒng)、全面分析多靶點(diǎn)藥物對(duì)各類疾病的作用。本研究通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)、PubChem等數(shù)據(jù)庫(kù)篩選此藥對(duì)的有效成分，并統(tǒng)計(jì)其成分的作用靶點(diǎn)，通過(guò)人類基因數(shù)據(jù)庫(kù)(GeneCards)、在線人類孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)等數(shù)據(jù)篩選并收集心力衰竭相關(guān)靶點(diǎn)，導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)并初步構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)，利用PubChem、RSCB PBD等數(shù)據(jù)庫(kù)收集蛋白信息，并在AutoDock Vina進(jìn)行分子對(duì)接。最后利用David等進(jìn)行生物富集分析，將所有結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并根據(jù)結(jié)果進(jìn)行后續(xù)分析討論，為黃芪-附子藥對(duì)提供分子機(jī)制支持。

1 資料與方法

1.1 “黃芪-附子”藥對(duì)活性成分與作用靶點(diǎn)的篩選與收集 TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)是基于中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)的框架建立的一個(gè)綜合研究中藥的分析平臺(tái)，包括499種中藥材，含有29 384個(gè)化學(xué)成分，3 311個(gè)靶點(diǎn)[21]。UniProt(http://www.uniprot.org/)是一個(gè)公開(kāi)、免費(fèi)的蛋白質(zhì)序列和功能信息資源數(shù)據(jù)庫(kù)。利用TCMSP分別檢索“黃芪”“附子”，選擇利用類藥性(Drug Likeness，DL)≥0.18和口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%來(lái)篩選該藥對(duì)的活性成分，將符合條件的活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)導(dǎo)出，通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為Gene Name，其檢索條件設(shè)置為Human-Reviewed，將每個(gè)靶點(diǎn)名規(guī)范為基因名并導(dǎo)入Excel[22]。

1.2 CHF靶標(biāo)的獲取與收集 GeneCards(https://www.genecards.org/)是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，建立了基因與疾病之間的聯(lián)系，并集成了來(lái)自150個(gè)網(wǎng)站來(lái)源的基因數(shù)據(jù)[23]。OMIM( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)是一個(gè)是基于基因和遺傳表型以及它們之間的關(guān)系的綜合數(shù)據(jù)庫(kù)[24]。以“chronic heart failure”“cardiac failure”“heart failure”“myocardial failure”“congestive heart failure”為關(guān)鍵詞檢索GeneCards與OMIM，在OMIM的gene map檢索處輸入關(guān)鍵詞，將數(shù)據(jù)一同導(dǎo)出，2次數(shù)據(jù)去重合并[25]。

1.3 藥物與疾病靶點(diǎn)的篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)提供了評(píng)估與整合直接(物理)和間接(功能)作用的PPI網(wǎng)絡(luò)的數(shù)據(jù)庫(kù)[26]。Cytoscape 3.8.0(https://cytoscape.org/)是一個(gè)開(kāi)源軟件，可用于集成任何可視化復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)[27]。將藥物靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)合并并去重，取二者的交集，輸入String數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“Homo sapiens”，最低互作分?jǐn)?shù)選擇0.9(Highest Confidence)，將數(shù)據(jù)輸出為tsv格式。將靶點(diǎn)文件及說(shuō)明文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0，選擇Analyze Network，并根據(jù)分析結(jié)果中的度(Degree)值，調(diào)節(jié)節(jié)點(diǎn)大小。Degree值指的是連接到網(wǎng)絡(luò)中其他節(jié)點(diǎn)的節(jié)點(diǎn)數(shù)，Degree越大，節(jié)點(diǎn)越關(guān)鍵。

1.4 基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG) David數(shù)據(jù)庫(kù)(https://david.ncifcrf.gov/home.jsp)是在線基因注釋富集分析工具。為分析重合靶點(diǎn)中的基因功能，進(jìn)行GO富集分析及KEGG通路富集分析，將上述結(jié)果輸入Fictional Annotation，將列表與背景均設(shè)置為“智人”，篩選條件為P<0.01[28]。將前30位結(jié)果導(dǎo)出，并根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)研究，篩選心力衰竭相關(guān)通路，并將通路與上述結(jié)果合并到Cytoscape。

1.5 分子對(duì)接(Molecular Docking)反向驗(yàn)證 AutoDock Vina(http://vina.scripps.edu/)是基于AutoDock 4的一個(gè)更優(yōu)更高效的分子對(duì)接程序，用于預(yù)測(cè)大分子受體與小分子配體的結(jié)合構(gòu)象和結(jié)合親和力[29]。PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)是一個(gè)免費(fèi)獲取化學(xué)信息的網(wǎng)站，包括化學(xué)成分名稱，分子式，結(jié)構(gòu)等。RCSB PDB(http://www.rcsb.org/)包含實(shí)驗(yàn)已確定的蛋白質(zhì)、核酸等的結(jié)構(gòu)的信息。分子對(duì)接通過(guò)“鎖鑰原理”預(yù)測(cè)藥物小分子與蛋白受體相互作用，并計(jì)算模擬配體與受體之間的對(duì)接模式和對(duì)接分?jǐn)?shù)。通過(guò)分子對(duì)接的虛擬篩選，對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行二次驗(yàn)證。將PPI網(wǎng)絡(luò)中Degree導(dǎo)出，篩選前5位靶標(biāo)，將其基因名轉(zhuǎn)化為PDB ID，在RCSB PDB中下載相應(yīng)3D結(jié)構(gòu)，并利用AutoDock Vina軟件，將這5個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)與黃芪-附子要對(duì)的活性成分結(jié)構(gòu)進(jìn)行分子對(duì)接，其Affinity(kcal/mol)(1 cal=4.184 J)值即代表二者結(jié)合的親和力[30]。

2 結(jié)果

2.1 黃芪-附子化合物及其靶標(biāo) 符合OB≥30%、DL≥0.18篩選條件的共有41個(gè)化學(xué)成分，其中黃芪20個(gè)，附子21個(gè)。黃芪包括異鼠李素、山柰酚、槲皮素、刺芒柄花素等；附子包括德?tīng)柾滓?、干華豆晶等。見(jiàn)表1。共獲得211個(gè)靶點(diǎn)。

表1 黃芪-附子主要化學(xué)成分及簡(jiǎn)稱

2.2 CHF靶標(biāo)篩選 在GeneCards與OMIM分別找到12 598與641個(gè)相關(guān)靶點(diǎn)，匯總?cè)ブ?，共?3 051疾病靶點(diǎn)，將藥物靶點(diǎn)與心力衰竭靶點(diǎn)進(jìn)行合并，二者交集共207靶點(diǎn)，最終得到183節(jié)點(diǎn)與808條交互關(guān)系。其Degree值前5位的分別為AKT1、MAPK1、JUN、TP53、TNF。見(jiàn)圖1。

圖1 基于String的黃芪-附子對(duì)心力衰竭的PPI網(wǎng)絡(luò)

2.3 分子對(duì)接二次驗(yàn)證 部分分子對(duì)接結(jié)果效果見(jiàn)圖2。共有174個(gè)對(duì)接結(jié)果Affinity≤-6.25 kcal/mol。見(jiàn)圖3～4。

圖2 分子對(duì)接顯示靶標(biāo)與其結(jié)合能前5位藥物分子的結(jié)合情況

2.4 GO富集分析、KEGG富集分析與PPI構(gòu)建 對(duì)與心力衰竭關(guān)聯(lián)的黃芪-附子的183靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析與KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)共有887條GO功能與134條KEGG信號(hào)通路。見(jiàn)圖5～6。GO富集分析包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、凋亡調(diào)控、細(xì)胞增殖、炎癥反應(yīng)、對(duì)藥物的反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程；涉及細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)、質(zhì)膜、線粒體等細(xì)胞組分；并與蛋白質(zhì)結(jié)合、酶結(jié)合、ATP結(jié)合等分子功能相關(guān)。而黃芪-附子對(duì)心力衰竭涉及的KEGG信號(hào)通路主要包括HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll-like Receptor信號(hào)通路等，將KEGG通路相關(guān)靶點(diǎn)匯總于上述Cytoscape 3.8.0，并完成PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。見(jiàn)圖7。

圖3 前5位靶標(biāo)與藥物成分進(jìn)行分子對(duì)接得到的各自最低結(jié)合能熱圖

圖4 分子對(duì)接驗(yàn)證數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

圖5 黃芪-附子-心力衰竭靶標(biāo)的GO富集分析

圖6 黃芪-附子-心力衰竭靶標(biāo)的KEGG通路富集分析

圖7 中藥-成分-靶點(diǎn)-通路-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

3 討論

分子對(duì)接二次驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，其Affinity(kcal/mol)為負(fù)數(shù)的數(shù)值越低，代表結(jié)合活性越強(qiáng)[31]，從該結(jié)果可看出，AKT1、MAPK1、JUN、TP53、TNF這5位靶標(biāo)與黃芪-附子中活性成分結(jié)合力較強(qiáng)，因此驗(yàn)證了前期研究的可信性。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，對(duì)黃芪-附子這一藥對(duì)的活性成分進(jìn)行了篩選。黃芪發(fā)揮治療心力衰竭藥效可能的化學(xué)成分為山柰酚、芒柄花素、槲皮素、異鼠李素等，它們都屬于黃酮類化合物；而附子發(fā)揮藥效的可能化學(xué)成分為石防風(fēng)素和水黃皮素。

研究表明，山柰酚(Kaempferol)可以抑制核因子κB與MAPKs信號(hào)通路激活，緩解心肌炎癥反應(yīng)，通過(guò)調(diào)節(jié)AMPK/Nrf2信號(hào)通路對(duì)由AngⅡ誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)進(jìn)行抑制，從而減緩膠原蛋白沉積，預(yù)防心臟纖維化，改善心臟重構(gòu)，應(yīng)用于心力衰竭治療[32-33]。芒柄花黃素(Formononetin)被證實(shí)可以有效改善缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)下H9C2心肌細(xì)胞的細(xì)胞狀態(tài)與成活率，降低ROS水平，提高血管內(nèi)皮細(xì)胞中內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)水平，減少功能異常，進(jìn)而對(duì)心血管系統(tǒng)提供保護(hù)[33-34]。槲皮素(Quercetin)被證實(shí)能夠通過(guò)上調(diào)蛋白激酶Cε的表達(dá)水平抵抗心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷，使乙酰膽堿增強(qiáng)心房利尿鈉肽分泌的功能得到提升，同時(shí)提高心肌組織中利尿鈉肽受體-A和內(nèi)皮型一氧化氮合酶的表達(dá)效應(yīng)，令A(yù)NP/NO信號(hào)通路得到激活，由此改善心律失常、降低心臟負(fù)擔(dān)、有效防治心力衰竭[35-36]。異鼠李素(Isorhamnetin)可清除羥基自由基，顯著抗油脂氧化，通過(guò)多條通路發(fā)揮降壓、緩解心肌肥厚、抗血栓形成等功能，實(shí)現(xiàn)心血管系統(tǒng)的總體保護(hù)，預(yù)防心力衰竭[37]。水黃皮素(Karanjin)，又稱干華豆晶4，通過(guò)抑制I-κB降解來(lái)降低活性氧水平并限制核因子κB的表達(dá)，發(fā)揮抗氧化作用為心肌細(xì)胞提供保護(hù)[38]。石防風(fēng)素(Deltoin)，又稱德?tīng)柾滓颍锌剐穆墒С５墓δ?，同時(shí)作為一種香豆素類化合物可以抑制鈣離子進(jìn)入細(xì)胞，發(fā)揮降壓及松弛血管，促進(jìn)凝血酶原發(fā)揮抗凝作用，進(jìn)而保護(hù)各種誘因引起的CHF[39]。其他化合物和靶標(biāo)也具有更深一步研究探索的潛力。

通過(guò)KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，黃芪-附子藥對(duì)治療心力衰竭的主要信號(hào)通路包括HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路。研究表明，HIF信號(hào)通路，參與機(jī)體適應(yīng)低氧或缺氧環(huán)境，可促進(jìn)血管生成，參與心肌細(xì)胞葡萄糖的攝入和轉(zhuǎn)運(yùn)，增強(qiáng)線粒體氧化磷酸化，激活血管張力調(diào)節(jié)和紅細(xì)胞生成有關(guān)的基因，其通過(guò)降低氧氣消耗、上調(diào)厭氧過(guò)程、調(diào)節(jié)氧穩(wěn)態(tài)來(lái)響應(yīng)缺氧環(huán)境，進(jìn)而減少心肌梗死并抑制急性心肌梗死中心臟功能障礙的發(fā)展[40-43]。MAPK信號(hào)通路包括MAPK/ERK家族、BMK-1、JNK、p38信號(hào)家族，該通路參與細(xì)胞增殖、分化與凋亡、炎癥和先天免疫等，其中p38通路參與介導(dǎo)負(fù)性肌力，并可能促使心肌肥大的發(fā)生[44-47]。p38通路的激活會(huì)誘使心肌收縮力降低，舒張功能受損，肥大基因表達(dá)與心力衰竭特定重塑[46]。PI3K-AKT信號(hào)通路則參與調(diào)節(jié)心臟生長(zhǎng)、血管生成和心肌細(xì)胞死亡，通過(guò)影響心肌鈣循環(huán)進(jìn)而改善心肌收縮功能，通過(guò)抑制心肌細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕心力衰竭[48-49]。TNF信號(hào)通路與心肌肥大、左心室重塑、內(nèi)皮功能障礙相關(guān)，且其腫瘤壞死因子-α降低了一氧化氮生物利用度，增加了細(xì)胞內(nèi)活性氧[50-51]。心力衰竭是由許多損害心肌的情況引起的，有證據(jù)表明，炎癥與心力衰竭有密切關(guān)系，Toll樣受體信號(hào)通路，在心力衰竭期間參與炎癥反應(yīng)，并促進(jìn)心力衰竭的發(fā)展[52]。

綜上所述，本研究探索了黃芪-附子藥對(duì)的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)該藥對(duì)可通過(guò)多靶點(diǎn)對(duì)心力衰竭起到治療作用，為臨床研究提供一定的參考，但其具體通路及靶標(biāo)有待進(jìn)一步研究。