哮喘和ABPA血清蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的篩選

楊雷，王筠，2，金美玲，帥迪全，蔡慧，葉伶，李水明，沈波

1）深圳大學(xué)生命與海洋科學(xué)學(xué)院，廣東深圳 518071；2）汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院廣東省感染病與分子免疫病理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515041；3）復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海200032

哮喘作為全球常見的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，其病因復(fù)雜，病理生理特征是慢性炎癥急性發(fā)作和氣道過度反應(yīng)，導(dǎo)致咳嗽、喘息、呼吸困難和胸悶.引起哮喘的內(nèi)外因素很多，包括致敏原暴露、呼吸道感染、遺傳因素、吸煙和肥胖等［1-2］.目前全世界超過3億人患有哮喘，已對患者、家庭和衛(wèi)生保健系統(tǒng)造成沉重的負(fù)擔(dān)［3］.針對哮喘的治療，近幾十年來仍主要沿用支氣管擴(kuò)張和抗炎藥物的傳統(tǒng)方法［4］.隨著更多哮喘亞類的確認(rèn)，許多個性化診療方案隨之產(chǎn)生.例如，對過敏性哮喘常采用抗血清免疫球蛋白IgE 治療和抗細(xì)胞因子治療［5］；對嗜酸性哮喘，則采用抗白細(xì)胞介素治療［6］.當(dāng)前越來越多的研究關(guān)注于挖掘哮喘的新型生物標(biāo)記物及其潛能，以區(qū)分不同哮喘的亞型，從而對患者進(jìn)行早期精準(zhǔn)干預(yù).

肺部煙曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的定植可導(dǎo)致肺局部組織的超敏反應(yīng)，即變應(yīng)性支氣管肺曲霉菌病（allergic bronchopulmonary aspergillosis，ABPA）.這一疾病是HINSON于1952年在英國首次發(fā)現(xiàn)，當(dāng)時共報告了8例病例.直至1968年才在美國被確診，并在全球范圍內(nèi)得以公認(rèn).患者年齡通常介于30～50 歲，兒童發(fā)病也較常見，尤其更多見于哮喘和囊性纖維化的患者.流調(diào)數(shù)據(jù)顯示，在哮喘患者人群中ABPA 的患病率為2.5%［7］.2013年，國際人類和動物真菌學(xué)學(xué)會（International Society for Human and Animal Mycology，ISHAM）的ABPA并發(fā)哮喘工作組，依據(jù)患者臨床體征（如支氣管痙攣、炎癥細(xì)胞肺部浸潤、嗜酸性粒細(xì)胞明顯增多和血清總IgE 水平升高，特別是煙曲霉菌特異性IgE 和IgG 升高［8-9］），提出了對ABPA 的診斷、鑒別診斷、分期標(biāo)準(zhǔn)和治療方案［10］.然而，ABPA 患者的臨床表現(xiàn)與肺部其他感染性疾病的臨床特征相似，極易誤診或漏診.由于缺乏早期有效治療，常導(dǎo)致該病快速進(jìn)展，形成肺部不可逆的損害（如肺纖維化、慢性支氣管擴(kuò)張或伴有肺功能嚴(yán)重下降的持續(xù)性哮喘）［11］.

人外周循環(huán)血中富含多種游離蛋白質(zhì)，是全身分泌型蛋白質(zhì)的儲存庫，并富含許多與疾病發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的特異性蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，可動態(tài)反映及調(diào)控機(jī)體的生理和病理狀況，具有重要的臨床應(yīng)用價值［12-13］.例如：許多細(xì)胞因子是調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的關(guān)鍵功能分子，當(dāng)患者發(fā)生感染、炎癥或其他免疫響應(yīng)時，體內(nèi)細(xì)胞因子的濃度會發(fā)生明顯異化［14］.因此，細(xì)胞因子被視為是影響多種疾病發(fā)生發(fā)展的重要分子標(biāo)志物.

與其他組學(xué)檢測方法相比，高通量蛋白質(zhì)芯片是較早廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)與臨床研究的技術(shù)（包括癌癥、自身免疫性疾病、心力衰竭和真菌感染），該技術(shù)可以定性與定量分析成千上萬的蛋白質(zhì)［15］.

本研究擬利用已知蛋白質(zhì)的高通量蛋白質(zhì)芯片檢測技術(shù)，通過對不同亞型類受試者血清蛋白質(zhì)的比對分析，挖掘出與哮喘和ABPA疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物，以期開發(fā)靈敏、簡便、快速地診斷與鑒別診斷檢測工具，并為針對性的靶向治療和早期預(yù)警提供新途徑.

1 研究對象與材料方法

1.1 研究對象及分組

選取在上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸科就診患者，依據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)分組為哮喘組（61 例）、ABPA組（48例）和正常對照組（48例）.

哮喘組納入標(biāo)準(zhǔn)：①反復(fù)發(fā)作喘息、咳嗽，伴胸悶；②肺功能檢查提示具有可變氣流受限的客觀依據(jù).

ABPA組納入標(biāo)準(zhǔn)：①有哮喘病史；②煙曲霉菌特異性血清/血漿IgE 水平升高（變應(yīng)原水平＞0.35 IU/mL），或皮膚對煙曲霉菌的直接反應(yīng)過度；③總IgE 水平升高（＞1 000 IU/mL）；④嗜酸性粒細(xì)胞總數(shù)增加（＞500 μL-1）；⑤胸部電子計算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）見支氣管擴(kuò)張；⑥血清中存在抗煙曲霉菌的沉淀抗體.

正常對照組：類似年齡段和性別比，無呼吸道疾病和其他重大慢性疾病的健康志愿者.

該研究獲得上海復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理審查委員會的批準(zhǔn)，所有參與受試者已簽署了知情同意書.

1.2 血清樣本的收集

抽取受試者循環(huán)外周血5 mL，常規(guī)凝血，收集血清，并以500 μL/管分裝，置于-80 ℃低溫冰箱保存.

1.3 蛋白質(zhì)芯片的檢測

血清標(biāo)本按前述標(biāo)準(zhǔn)分為哮喘、ABPA 和正常對照3 組，每組提取等體積的8 例樣本混成1 個待檢樣品，每組共混成3個待檢樣品.剩余標(biāo)本用作候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的單例驗(yàn)證標(biāo)本.采用人440 種細(xì)胞因子的抗體芯片（QAH-CAA-440，美國RayBiotech），按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測.然后由Axon GenePix激光掃描儀采集信號強(qiáng)度，再將采集數(shù)據(jù)導(dǎo)入Raybiotech 軟件，去除蛋白質(zhì)芯片的非特異背景，歸一化后進(jìn)行分析處理.

1.4 差異表達(dá)細(xì)胞因子的篩選

將哮喘和ABPA 患者的檢測數(shù)據(jù)分別與正常對照受試者的進(jìn)行比較，以兩組表達(dá)差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）大于1.5或小于0.67的細(xì)胞因子和P＜0.05 的統(tǒng)計學(xué)顯著性差異為閾值，篩選哮喘和ABPA 患者之間特異性表達(dá)差異的蛋白質(zhì)，作為與疾病病變相關(guān)的候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物.

1.5 生物信息學(xué)分析

首先，根據(jù)細(xì)胞因子的差異表達(dá)量，制作可視化基因表達(dá)熱圖和火山圖.然后，使用David 6.8數(shù)據(jù)庫（https：//david.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號通路富集的分析.最后，使用STRING數(shù)據(jù)庫在線平臺（https：//string-db.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interactiion，PPI）網(wǎng)絡(luò)分析.

1.6 多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜

檢測 標(biāo)本為15 例哮喘、15 例ABPA 和14 例健康對照血清樣本.多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（multiple reaction monitoring，MRM）實(shí)驗(yàn)過程如下：①建庫：將各組血清分別混合成3組蛋白質(zhì)樣品，用Tripsin酶進(jìn)行水解，再各取10 μg 酶解后的肽段混成1 個樣品，使用Triple TOF?6600 質(zhì)譜儀進(jìn)行檢測.使用ProteinPilot?Software 5.0.1 軟件對下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行蛋白質(zhì)搜庫，獲得必要的建庫信息；②獲得待驗(yàn)證的蛋白質(zhì)序列；③利用Skyline 軟件選取合適質(zhì)譜檢測的蛋白質(zhì)肽段母離子對；④將單例血清樣本分別加入β-半乳糖苷酶和iRT作為內(nèi)參，酶切，對肽段進(jìn)行6500-QTRAP MRM 掃描；⑤將質(zhì)譜檢測數(shù)據(jù)導(dǎo)入Skyline 軟件，提取目標(biāo)蛋白質(zhì)在質(zhì)譜上的掃描信息，利用Msstats 3.18.5 軟件計算蛋白質(zhì)的相對豐度.通過Benjamini-Hochberg 方法對P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，P＜0.05的差異表達(dá)蛋白質(zhì)被認(rèn)為是具有統(tǒng)計學(xué)意義的.

1.7 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

通過商品化酶聯(lián)免疫吸附測定法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA，武漢博士德生物），對已收集的15 例哮喘患者和15 例ABPA 患者，以及8 例正常受試者血清標(biāo)本進(jìn)行了8 個候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物（CD14、CSF1、TNFRSF10CCSF1、CXCL9、CXCL9、CD6、TNFRSF1A 和CXCL13）的驗(yàn)證.

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 22.0 軟件分析患者的臨床特征與檢測數(shù)據(jù)的關(guān)聯(lián)統(tǒng)計.計量資料以±s表示，兩組之間用學(xué)生t-檢驗(yàn)（student'st-test），多組之間用方差分析（analysis of variance，ANOVA）；計數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn).P＜0.05 為具有統(tǒng)計學(xué)意義.利用MRM 或ELISA 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，繪制受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線，計算曲線下面積（area under the curve，AUC）A，并檢驗(yàn)A是否具有統(tǒng)計學(xué)意義，以及計算尤登指數(shù)最大值作為最佳診斷臨界值，獲得對應(yīng)的靈敏度、特異度和置信區(qū)間（confidence interval，CI），評估候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物對哮喘和ABPA的診斷與鑒別診斷的價值.

2 結(jié)果與分析

2.1 研究對象臨床特征

本研究共收集了61例哮喘患者、48例ABPA患者和48 例正常受試者的血清標(biāo)本.所有標(biāo)本的臨床特征小結(jié)于表1.其中，n為樣本數(shù).由表1 可見，各組受試者的年齡和性別無統(tǒng)計學(xué)差異；ABPA 組、哮喘組與正常對照組的嗜酸性粒細(xì)胞計數(shù)呈現(xiàn)顯著性差異，而且ABPA組的嗜酸性粒細(xì)胞個數(shù)明顯高于哮喘組和正常對照組，ABPA 組的血清總IgE 水平明顯高于哮喘組.ABPA 組和哮喘組的所有受試者都進(jìn)行了血清過敏試驗(yàn).所有ABPA患者均對煙曲霉特異性過敏，其中有11 例患者對屋塵螨過敏，10 例患者對粉塵螨過敏，26 例患者還對青霉菌過敏，以及16例患者對鏈格孢霉過敏.另外，哮喘患者有37 例對屋塵螨過敏和35 例患者對粉塵螨過敏.此外，ABPA患者的胸片多顯示中央型支氣管擴(kuò)張伴感染.對照組沒有檢測血清總IgE和煙曲霉特異性IgE.

表1 不同組別受試者的臨床資料1）(± s)Table 1 General characteristics of subjects in different subtypes(± s)

表1 不同組別受試者的臨床資料1）(± s)Table 1 General characteristics of subjects in different subtypes(± s)

1）酸性粒細(xì)胞各組之間的P ＜0.01，總IgE水平兩組之間P ＜0.01.

2.2 哮喘、ABPA與正常受試者血清蛋白質(zhì)芯片的分析

2.2.1 哮喘組與正常對照組血清蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析

根據(jù)篩選閾值，對分析結(jié)果進(jìn)行可視化展示見哮喘組和對照組差異表達(dá)蛋白質(zhì)（differentially expressed protein，DEP）的火山圖和聚類熱圖（圖1）.通過比較哮喘組與對照組血清中440個細(xì)胞因子的表達(dá)譜，共獲得7個顯著差異表達(dá)蛋白質(zhì).其中，表達(dá)上調(diào)的有5個；表達(dá)下調(diào)的有2個（表2）.

圖1 哮喘組與正常對照組血清DEPs的（a）火山圖和（b）聚類熱圖Fig.1 (a)Volcano map and(b)expression profile heatmap of serum DEPs compared asthma patients to healthy controls.

表2 哮喘與正常對照組的血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 2 Serum DEPs compared asthma patients to healthy controls

對這7 個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，每個功能術(shù)語按照P值進(jìn)行升序排列，對結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①GO 富集包括生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）和 分 子 功 能（molecular function，MF）.其中，BP 中P＜0.05 的有18 條，CC 中P＜0.05 的有3 條，MF 中P＜0.05 的有8 條.排名前3條的分別是免疫反應(yīng)調(diào)控、巨核細(xì)胞正向調(diào)控和自然殺傷細(xì)胞凝集素樣受體結(jié)合.②KEGG富集的通路中P＜0.05的有12條，排名前3條的通路分別是Jak-STAT 信號通路、細(xì)胞因子及其受體互作通路和自然殺傷細(xì)胞毒性通路.

圖2 哮喘組與正常對照組血清DEPs的（a）GO和（b）KEGG分析（排名前10位）Fig.2 Top 10 of(a)GO and(b)KEGG analyses of serum DEPs compared asthma patients to healthy controls.

蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果如圖3，其中，血小板衍生生長因子B 亞基（platelet-derived growth factor subunit B，PDGFB）、白細(xì)胞介素13 受體α2 亞基（interleukin-13 receptor subunit alpha 2，IL13RA2）和促血小板生成素（thrombopoietin，THPO）能夠形成互作網(wǎng)絡(luò)；Fas 配體（Fas ligand，F(xiàn)ASLG）和MHC 類多肽相關(guān)序列B（MHC class I polypeptide-related sequence B，MICB）有互作關(guān)系.

圖3 哮喘與正常對照組血清候選DEP的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of serum protein candidates between asthma patients and healthy controls.

2.2.2 ABPA組與正常對照組的蛋白質(zhì)表達(dá)差異分析

比較ABPA 組和對照組血清中細(xì)胞因子的表達(dá)量，根據(jù)篩選條件，共獲得15 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)（表3）.其中，上調(diào)表達(dá)的有7個；下調(diào)表達(dá)的有8個.將分析結(jié)果可視化，獲得ABPA組和對照組差異表達(dá)蛋白質(zhì)的火山圖和聚類熱圖（圖4）.對這15個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，按照P值進(jìn)行升序排列，對結(jié)果進(jìn)行氣泡圖展示（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：①GO富集分析，BP中P＜0.05的有30條，CC中P＜0.05的有5條，MF中P＜0.05的有7條.前3條分別是質(zhì)膜的固有成分、脂多糖應(yīng)答和適應(yīng)性免疫反應(yīng).②KEGG 富集的通路其中P＜0.05 的有7 條，前3 條通路分別是細(xì)胞因子受體相互作用通路、趨化因子信號通路和脂肪細(xì)胞因子信號通路.

表3 ABPA組與對照組的血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 3 Serum DEPs compared ABPA patients to controls

圖4 ABPA與正常對照組血清DEPs的（a）火山圖和（b）聚類熱圖Fig.4 （a）Volcano map and（b）expression profile heatmap of serum DEPs compared ABPA patients to healthy controls.

圖5 ABPA與正常對照血清DEPs的（a）GO和（b）KEGG分析（排名前10位）Fig.5 Top 10 of(a)GO and（b）KEGG analyses of serum DEPs compared ABPA patients to healthy controls.

蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果如圖6.由圖6 可見，脂肪連接蛋白（adiponectin，ADIPOQ）、CXC趨化因子配體9（C-X-C motif chemokine ligand 9，CXCL9）、內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子（endothelial cell adhesion molecule，ESAM）、C 反應(yīng)蛋白質(zhì)（C-reactive protein，CRP）、TNF 受體超家族成員1A（TNF Receptor Superfamily Member 1A，TNFRSF1A）、C-C 基序趨化因子配體24（C-C motif chemokine ligand 24，CCL24）、白介素17A（interleukin 17A，IL17A）、血小板因子（platelet factor 4，PF4）、CXC 趨化因子配體13（C-X-C motif chemokine ligand 13，CXCL13）、TNF 受體超家族成員 21（TNF receptor superfamily member 21，TNFRSF21）、T 細(xì)胞分化抗原CD6 和T 細(xì)胞活化抗原CD27共12個蛋白質(zhì)形成互作網(wǎng)絡(luò).這些互作蛋白質(zhì)主要富集在細(xì)胞因子受體相互作用通路和趨化因子信號通路.

圖6 ABPA與正常對照組血清候選DEPs的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.6 PPI network of serum candidate DEPs between ABPA patients and healthy controls.

2.2.3 ABPA組與哮喘組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)分析

依據(jù)篩選閾值，通過比較ABPA 組和哮喘組患者血清中細(xì)胞因子的表達(dá)譜，共獲得15 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)（表4），其中，表達(dá)上調(diào)的有4 個；表達(dá)下調(diào)的有11 個.對分析結(jié)果進(jìn)行可視化展示見ABPA 組和哮喘組差異表達(dá)蛋白質(zhì)的火山圖和聚類熱圖（圖7）.

表4 ABPA與哮喘兩組的血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)Table 4 Serum DEPs compared ABPA patients to asthma patients

圖7 ABPA與哮喘組血清DEPs的（a）火山圖和（b）聚類熱圖Fig.7 (a)Volcano map and(b)expression profile heatmap of serum DEPs compared ABPA patients to asthma patients.

對這15 個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 和KEGG 富集分析，按照P值進(jìn)行升序排列，結(jié)果如圖8.由圖8可見：①GO 富集分析，BP 中P＜0.05 的有39 條，CC 中P＜0.05 的有5 條，MF 中P＜0.05 的有9 條.前3條分別是細(xì)胞膜、跨膜信號受體活性和細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號通路.②KEGG 富集的通路其中P＜0.05 的有24 條，前3 條通路分別是細(xì)胞因子及其受體相互作用通路、絲裂原活化蛋白激酶信號通路和瘧疾通路.

圖8 ABPA與哮喘組血清DEPs的（a）GO和（b）KEGG分析（排名前10位）Fig.8 Top 10 of(a)GO and(b)KEGG analysis of serum DEPs compared ABPA patients to asthma patients.

蛋白質(zhì)互作分析結(jié)果如圖9，單核細(xì)胞分化抗原CD14、集落刺激因子1（colony stimulating factor 1，CSF1）、淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1（lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor 1，LYVE1）、TNFRSF1A、Fms 相關(guān)受體酪氨酸激酶（fms related receptor tyrosine kinase 3，F(xiàn)LT3）、雙調(diào)蛋白（amphiregulin，AREG）、TNF 受體超家族成員（10c TNF receptor superfamily member 10c，TNFRSF10C）、血小板衍生生長因子受體（platelet derived growth factor receptor beta，PDGFRB）、選擇素E（selectin E，SELE）、T 淋巴細(xì)胞活化抗原CD80、CD40 抗原配體（CD40LG）、MHC類多肽相關(guān)序列B（mhc class I polypeptide-related sequence B，MICB）、血小板與內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（platelet and endothelial cell adhesion molecule 1，PECAM1）、CXCL13和CD27共14個蛋白質(zhì)形成互作網(wǎng)絡(luò).

圖9 ABPA與哮喘組血清候選DEPs的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.9 PPI network of serum candidate DEPs between ABPA patients and asthma patients.

2.3 哮喘、ABPA與正常受試者血清蛋白質(zhì)MRM實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

為了獲得更多的候選生物標(biāo)志物，本研究從已報道過的、通過iTRAQ方法篩選ABPA和哮喘患者血清的差異表達(dá)蛋白質(zhì)中挑選了38個候選靶標(biāo)［16］，利用MRM 方法檢測ABPA 與哮喘組單個樣本的蛋白質(zhì)表達(dá)水平與差異.

MRM 的驗(yàn)證結(jié)果如下：①哮喘組和正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)3 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分別是Serpin 家族F 成員2（serpin family F member 2，SERPINF2）、補(bǔ)體C6 和透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白2（hyaluronan binding protein 2，HABP2），見圖10（a）；②ABPA 組和正常對照組比較，發(fā)現(xiàn)2個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分別是SERPINF2和凝血因子10（coagulation factor X，F(xiàn)10），見圖10（b）；③ABPA 組和哮喘組比較，發(fā)現(xiàn)2 個差異表達(dá)蛋白質(zhì)，分別是羧肽酶N 亞基2（carboxypeptidase N subunit 2，CPN2）和免疫球蛋白類 肽5（immunoglobulin lambda like polypeptide 5，IGLL5），見圖10（c）.

圖10 MRM驗(yàn)證哮喘和ABPA血清候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物（a）SERPINF2在哮喘組和正常對照組血清中的相對表達(dá)量；（b）C6在哮喘組和正常對照組血清中的相對表達(dá)量；（c）HABP2在哮喘組和正常對照組血清中的相對表達(dá)量；（d）SERPINF2在ABPA組和正常對照組血清中的相對表達(dá)量；（e）F10在ABPA組和正常對照組血清中的相對表達(dá)量；（f）CPN2在ABPA組和哮喘組血清中的相對表達(dá)量；（g）IGLL15在ABPA組和哮喘組血清中的相對表達(dá)量Fig.10 Verification of serum candidate protein biomarkers of asthma and ABPA with MRM.（a）Relative abundance of SERPINF2 in the serum of asthma and control group，（b）relative abundance of C6 in the serum of asthma and control group，（c）relative abundance of HABP2 in the serum of asthma and control group，（d）relative abundance of SERPINF2 in the serum of ABPA and control group，（e）relative abundance of F10 in the serum of ABPA and control group，（f）relative abundance of CPN2 in the serum of ABPA and asthma group，（g）relative abundance of IGLL15 in the serum of ABPA and asthma group.

2.4 與哮喘和ABPA 疾病相關(guān)的候選蛋白質(zhì)的ELISA驗(yàn)證分析

為從以上生信分析得到的、影響哮喘和ABPA發(fā)生發(fā)展的候選細(xì)胞因子中，挑選出可能參與哮喘和ABPA發(fā)病調(diào)控的關(guān)鍵因子，以及具有診斷價值和預(yù)后干預(yù)潛能的相關(guān)細(xì)胞因子，本研究運(yùn)用ELISA試劑盒對候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物的單個樣本進(jìn)行驗(yàn)證，包括：細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片篩選出來的差異表達(dá)蛋白質(zhì)5個（CD14、CSF1、TNFRSF10C、CXCL13 和CD6）以及MRM 檢測的明顯差異表達(dá)蛋白質(zhì)1個（IGLL5），實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11.由圖11（a）可見，CSF1蛋白質(zhì)在ABPA患者血清水平顯著低于哮喘組，而TNFRSF10C在ABPA患者血清水平顯著高于哮喘組.其他經(jīng)ELISA法驗(yàn)證的血清細(xì)胞因子水平，在兩兩比對分析時，均呈現(xiàn)無顯著性變化，見圖11（b）.

圖11 ELISA驗(yàn)證哮喘和ABPA血清候選蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物（a）CSF1在ABPA和哮喘組血清中的水平；（b）TNFRSF10C在ABPA和哮喘組血清中的水平；（c）CD6在ABPA、哮喘和正常對照組血清中的水平；（d）CD14在ABPA、哮喘和正常對照組血清中的水平；（e）CXCL13在ABPA、哮喘和正常對照組血清中的水平；（f）IGLL15在ABPA、哮喘和正常對照組血清中的水平Fig.11 Verification of serum candidate proteins between asthma and ABPA by ELISA.(a)Serum levels of CSF1 in the ABPA and asthma group,(b)serum levels of TNFRSF10C in the ABPA and asthma group,(c)serum levels of CD6 in the ABPA,asthma and control group,(d)serum levels of CD14 in the ABPA,asthma and control group,(e)serum levels of CXCL13 in the ABPA,asthma and control group,(f)serum levels of IGLL15 in the ABPA,asthma and control group.

2.5 哮喘和ABPA 患者血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的ROC曲線分析

利用MRM 和ELISA 的檢測結(jié)果，繪制ROC 曲線，評估經(jīng)驗(yàn)證表現(xiàn)出有顯著表達(dá)差異蛋白質(zhì)的診斷價值.在MRM結(jié)果中，由于SERPINF2在哮喘與正常對照組、ABPA 與正常對照組兩兩比較中都有明顯的差異表達(dá)，表明它不具有對這兩個亞型的鑒別診斷價值，故沒有進(jìn)行ROC曲線分析.

ROC 曲線分析結(jié)果如下：①差異蛋白質(zhì)對哮喘與正常對照組的診斷價值，見圖12（a）.由圖12（a）可見，A（C6）=0.914（95%CI為0.797～1.000，P＜0.05），敏感度為73.3%，特異性為99.9%.A（HABP2）=0.833（95% CI 為0.670～0.996，P＜0.05），敏感度為86.7%，特異性為78.6%.兩個指標(biāo)聯(lián)合診斷的ROC 曲線AUC 為0.905（95% CI 0.784～1.000，P＜0.05），敏感度為80.0%，特異性為92.9%.以上結(jié)果表明，對于哮喘和正常對照組比較A（C6）高于A（HABP2）以及兩個指標(biāo)的聯(lián)合診斷，提示C6 可能是哮喘的生物標(biāo)志物的AUC.②差異蛋白質(zhì)對ABPA與正常對照組的診斷價值見圖12（b）.由圖12（b）可見，A（F10）=0.871（95%CI 為0.734～1.000，P＜0.05），敏感度為80.0%，特異性為85.7%.A（F10）較高，說明F10 可能是ABPA 的生物標(biāo)志物.③差異蛋白質(zhì)對ABPA 和哮喘組的診斷價值見圖12（c）.A（CPN2）=0.867（95% CI 為0.726～1.000，P＜0.05），敏感度為86.7%，特異性為80.0%.A（IGLL5）=0.827（95%CI 為0.678～0.975，P＜0.05），敏感度為93.3%，特異性為66.7%.CPN2 和IGLL5 聯(lián)合診斷的ROC 曲線AUC 為0.902（95% CI 為0.781～1.000，P＜0.05），敏感度為100%，特異性為80.0%.A（TNFRSF10C）=0.576（95% CI 為0.726～1.000，P=0.44），由于AUC ＜0.7，并且P＞0.05，沒有統(tǒng)計學(xué)意義.所以，TNFRSF10C的診斷價值較差，不能作為生物標(biāo)志物.以上結(jié)果表明，CPN2 和IGLL5聯(lián)合診斷的AUC最高，敏感度和特異性也較好，所以CPN2 和IGLL5 的組合是區(qū)分ABPA 和哮喘的較佳指標(biāo).

圖12 哮喘、ABPA和正常對照組之間血清差異表達(dá)蛋白質(zhì)的診斷價值ROC曲線評估（a）C6和HABP2的ROC曲線；（b）F10的ROC曲線；（c）CPN2和IGLL5的ROC曲線Fig.12 Diagnotic values of serum DEPs for asthma and ABPA by ROC.(a)ROC curves of C6 and HABP2,(b)ROC curve of F10,(c)ROC curves of CPN2 and IGLL5.

3 討論

本研究利用440種細(xì)胞因子特異性抗原-抗體反應(yīng)的蛋白質(zhì)芯片來檢測哮喘和ABPA患者血清多種與炎癥-免疫相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，這是一種檢測與分析體液樣本中蛋白質(zhì)表達(dá)水平的大通量定性和定量的方法.該方法本身具有較高的靈敏度，可發(fā)現(xiàn)樣本中與疾病病變和特征密切相關(guān)的一些低豐度蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物.多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜（multiple reaction monitoring mass spectrometry，MRM-MS）是一種靶向質(zhì)譜方法，已在臨床實(shí)驗(yàn)中用于血漿、血清和尿液中小分子的準(zhǔn)確定量.通過以上兩種高通量研究方法，篩選并驗(yàn)證哮喘和ABPA的蛋白質(zhì)診斷標(biāo)志物，可以更好地鑒別這兩種不同病因所致臨床表型相近的肺過敏反應(yīng).并通過ROC 曲線分析候選蛋白標(biāo)志物-與疾病相關(guān)差異表達(dá)蛋白質(zhì)的診斷價值，可挖掘潛在的、有助于精準(zhǔn)診療的新生物標(biāo)志物.

基于大通量細(xì)胞因子蛋白質(zhì)芯片的方法，本研究針對哮喘、ABPA 和健康對照3 組受試者，比較不同組別血清中的細(xì)胞因子表達(dá)譜，并通過生物信息學(xué)分析ABPA 比對照組、哮喘比對照組、ABPA比哮喘組，獲得1批與這兩個不同亞型疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的候選蛋白質(zhì)標(biāo)志物.

通過MRM 和ELISA 方法，比較分析哮喘與正常對照組結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SERPINF2、C6 和HABP2 這3個蛋白質(zhì)的表達(dá)具有明顯的差異表達(dá).SERPINF2是一種纖溶酶的抑制劑，長期持續(xù)性哮喘可能發(fā)生肺部纖維化，而SERPINF2 與纖維化的進(jìn)展有關(guān)，可能充當(dāng)纖維化變化的局部調(diào)節(jié)劑［18］.C6 是補(bǔ)體級聯(lián)的組成部分，由C5b、C6、C7、C8 和C9 組成一種獨(dú)立于C3a 和C5a 活性的另一途徑的復(fù)合物，在體內(nèi)激活核苷酸結(jié)合域和NLRP3 炎癥小體.活化后，產(chǎn)生具有生物活性的IL-1β和IL-18，促進(jìn)中性粒細(xì)胞募集和Th17 細(xì)胞的極化.已發(fā)現(xiàn)重癥哮喘、類固醇抵抗性哮喘和中性粒細(xì)胞性哮喘都與C6 參與激活的NLRP3 表達(dá)增加有關(guān)［17］.血漿蛋白HABP2，也被稱為因子Ⅶ激活蛋白酶，編碼透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白.文獻(xiàn)［19］報道，HABP2 通過激活因子Ⅶ和前尿激酶降解細(xì)胞外基質(zhì)，并在凝血過程中發(fā)揮作用.

在ABPA 與正常對照組比較的結(jié)果中，F(xiàn)10 和SERPINF2呈顯著性差異表達(dá)，SERPINF2也出現(xiàn)在哮喘和正常對照組的比較中，說明SERPINF2 的表達(dá)差異不是特異性的，可能是過敏反應(yīng)的1個關(guān)鍵調(diào)控因子.F10 基因編碼血凝級聯(lián)的維生素K 依賴凝血因子Ⅹ，可能在哮喘中發(fā)揮重要作用，參與凝血酶激活，并且是蛋白酶激活受體-1（recombinant protease activated receptor 1，PAR-1）激動劑［20］.在本研究中F10 的ROC 曲線AUC 較高，敏感度和特異性也較好，這說明F10 可能可開發(fā)作為ABPA 的診斷生物標(biāo)志物.

本研究還發(fā)現(xiàn)，ABPA 組與哮喘組的差異表達(dá)蛋白質(zhì)有TNFRSF10C、CSF1、CPN2 和IGLL5.TNFRSF10C 是TNF 受體超家族的成員；CSF1 是調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能的多效細(xì)胞因子；CSF1 及其受體（CSF1R）能夠調(diào)節(jié)骨髓細(xì)胞的功能，在先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮關(guān)鍵作用［21］.本研究中，TNFRSF10C 和CSF1 在蛋白質(zhì)芯片和ELISA 實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)趨勢是相反的，這可能是由于ELISA 實(shí)驗(yàn)時同1批樣本中部份樣本所剩量不足，造成被檢樣本數(shù)量偏低，使得樣本的個體差異偏大，需要擴(kuò)大樣本進(jìn)一步驗(yàn)證.

經(jīng)過對這些候選蛋白質(zhì)進(jìn)行ROC 分析，發(fā)現(xiàn)C6 的AUC 高于HABP2.另外，如果將它們兩兩組合用于診斷，其靈敏度和特異性也比較高，由此表明，C6 蛋白質(zhì)可能可以作為哮喘診斷的一個優(yōu)質(zhì)生物標(biāo)志物.另外，ROC 分析結(jié)果還表明CPN2 和IGLL5聯(lián)合診斷的AUC最高，敏感度和特異性也較好，所以CPN2 和IGLL5 的組合可能是區(qū)分ABPA和哮喘的較佳指標(biāo).

結(jié)語

利用蛋白組學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，篩選哮喘患者和ABPA 患者血清發(fā)現(xiàn)1 批與疾病病變相關(guān)的蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物.通過ROC 曲線分析，預(yù)估了這些新型蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的診斷與鑒別診斷的潛能.下一步需深入了解它們在哮喘和ABPA病變中的分子調(diào)控機(jī)制，以更好地開發(fā)它們臨床應(yīng)用的價值.