Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化橘紅提取液的制備工藝

蔡里帆, 李小池

（1.廣州市司法局戒毒醫(yī)院, 廣東廣州 510435；2.廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）, 廣東廣州 510095）

化橘紅為嶺南道地藥材, 具有清熱化痰、消炎止咳、解毒活血等功效, 常用于痰咳、風熱感冒或相關(guān)上呼吸道炎癥的治療, 可單用或配伍組方。研究表明, 化橘紅對體內(nèi)多種炎癥相關(guān)生理因子, 如IL-2、IL-6、TNF-α, 或PPAR系列受體有較好的抑制、調(diào)控作用, 應(yīng)用較為廣泛[1-4]。同時, 化橘紅也可制備成提取物便于使用和調(diào)劑；為提升化橘紅提取液中所含成分對疾病治療的針對性, 提高藥效, 有必要對其制備工藝進行優(yōu)選。

Box-Behnken響應(yīng)面法是目前應(yīng)用較為廣泛的實驗設(shè)計和參數(shù)篩選方法, 相較單因素設(shè)計等傳統(tǒng)方法, 該方法效率較高, 考察較為全面, 具有較好的先進性[5]。此外, 文獻報道顯示, 化橘紅中富含柚皮苷, 該成分具有較強的抗炎、止咳、增強免疫作用, 可以作為本文工藝研究的結(jié)果指標[6-8]。

1 儀器和實驗材料

含量測定使用Waters 2695型高效液相色譜儀, 配備PDA檢測器, 自動進樣器和柱溫箱, 由美國Waters公司生產(chǎn)；樣品稱取使用Mettler-Toledo自動分析天平, 由瑞士Mettler-Toledo公司生產(chǎn)；回流提取使用數(shù)顯控溫電熱套, 由河南愛伯特科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)；制備化橘紅提取液用乙醇為分析純, 由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn)；樣品測定用乙腈、甲酸為色譜純, 由德國Merck公司生產(chǎn)；實驗用水為超純水, 由杭州娃哈哈公司生產(chǎn)；柚皮苷對照品（批號：110722-201815）購自中國食品藥品檢定研究院；實驗用化橘紅藥材飲片購自廣州中芝園藥業(yè)有限公司。

2 方法和結(jié)果

2.1 實驗設(shè)計 選擇提取時間、乙醇含量、提取次數(shù)為考察參數(shù), 范圍分別為15～90min, 20%～100%, 1～3次, 輸入Design Expert軟件中, 由系統(tǒng)自動給出各實驗組參數(shù), 根據(jù)實際情況和儀器性能進行調(diào)整后, 得表1所述工藝參數(shù)。根據(jù)上述參數(shù)制備化橘紅提取液（取樣量為2g/份, 溶劑用量為25ml）, 所得溶液濾過后, 適當濃縮, 置于25ml量瓶中, 加乙醇定容至刻度, 所得溶液待測。

表1 Box-Behnken參數(shù)設(shè)計和實測結(jié)果

2.2 對照品的制備 取柚皮苷對照品, 精密稱取約5mg, 置于5ml量瓶中, 加乙醇溶解并定容至刻度, 得濃度為1mg/ml的對照品溶液, 備用。

2.3 供試品的制備 取“2.1”項下制備的化橘紅提取液, 精密吸取1ml, 置于10ml量瓶中, 加乙醇稀釋至刻度, 搖勻, 濾過, 取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.4 樣品測定方法 使用Waters XBridge C18色譜柱（規(guī)格250mm*4.6mm, 填料粒徑5μm）, 流動相為乙腈（A）-0.2%甲酸水溶液（B）, 梯度洗脫, 程 序 為, 0～15min, 20%～20%A；15～20min, 20%～90%A；20～25min,90%～20%A；流 速1.0ml/min, 檢測波長283nm, 柱溫25℃；測定供試品和對照品所得色譜、光譜圖見圖1、圖2。

圖1 柚皮苷對照品（濃度50μg/ml）和供試品色譜圖

圖2 柚皮苷對照品（濃度50μg/ml）和供試品光譜圖

2.5 含量測定方法學(xué)考察

2.5.1 線性和范圍 取柚皮苷對照品溶液, 加甲醇逐級稀釋, 配制成濃度分別為200、100、50、20、10、5μg/ml的溶液, 所得溶液注入HPLC中, 按“2.4”項下方法測定, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 代入excel軟件中計算回歸方程和相關(guān)系數(shù), 得方程為y=20559x-47302（r2=0.9993, x為濃度, y為峰面積）；上述結(jié)果表明, 方法線性良好, 能夠?qū)舛葹?～200μg/ml的柚皮苷進行準確測定。

2.5.2 精密度考察 取供試品溶液, 連續(xù)使用“2.4”項下方法測定6次, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 計算峰面積的RSD, 結(jié)果顯示, RSD為0.90%, 表明方法精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 將供試品溶液放置在自動進樣器中, 分別于0、2、4、6、8、12h使用“2.4”項下方法測定, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 計算含量和含量的RSD, 結(jié)果顯示, RSD為0.82%, 表明方法所制備樣品穩(wěn)定性良好。

2.5.4重復(fù)性考察 取化橘紅提取液, 按“2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液, 再使用“2.4”項下方法測定, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 計算含量和含量的RSD, 結(jié)果顯示, RSD為0.56%, 表明方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率測定 取化橘紅提取液, 精密吸取0.5ml, 轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中, 按表2所示加入不同量的柚皮苷對照品溶液, 混勻后加乙醇定容至刻度, 濾過, 取續(xù)濾液按“2.4”項下方法測定, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 計算含量、回收率和回收率的RSD, 結(jié)果顯示, 柚皮苷平均回收率為99.21%, RSD2.30%, 表明方法準確度良好。

表2 加樣回收測定結(jié)果（n=3）

2.6 樣品測定 取根據(jù)“2.1”項下設(shè)計參數(shù)制備的化橘紅提取液, 按“2.3”項下方法制備供試品溶液, 再使用“2.4”項下方法測定, 記錄各樣品中柚皮苷的峰面積, 計算含量。所得結(jié)果導(dǎo)入Design Expert軟件中, 得出響應(yīng)面圖, 見圖3。根據(jù)結(jié)果可知, 當提取時間為50min, 乙醇含量60%, 提取次數(shù)2次時, 所制備樣品為最優(yōu), 提取液中化橘紅含量為0.2684-0.2710mg/ml。

圖3 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化結(jié)果（n=3）

3 討論

由表1可知, 提取時間、含醇量、提取次數(shù)三個參數(shù)中, 乙醇含量對柚皮苷的提取效率影響最大, 但當乙醇含量為100%時, 柚皮苷含量并非最高點（最高點為75%）, 同時, 最高點與60%乙醇相比, 柚皮苷含量提升并不明顯, 表明乙醇含量對提取效率的提升并非線性, 應(yīng)當根據(jù)曲線走勢, 結(jié)合提取效率、能耗、溶劑、環(huán)境保護等因素謹慎選擇, 而非以最高點為最優(yōu)。提取時間對柚皮苷含量影響僅次于含醇量, 隨提取時間增加, 柚皮苷含量也隨之增加, 但當提取時間超過70分鐘后, 柚皮苷產(chǎn)量提升不明顯, 表明該時間已經(jīng)能夠較為充分提取柚皮苷, 繼續(xù)增加提取時間并無實際意義。提取次數(shù)的影響與提取時間類似, 當該數(shù)值從1次增加至兩次時, 柚皮苷含量明顯升高, 表明一次提取并不充分；但當提取次數(shù)升至3次后, 所得溶液中柚皮苷含量并無明顯提升。綜合上述分析, 可知系統(tǒng)所建議的提取參數(shù)確為最優(yōu)參數(shù), 表明本文所用實驗設(shè)計方法高效、全面、準確。