酪蛋白源降膽固醇肽的酶解制備工藝優(yōu)化

梁小慧，王孝治，趙佳園，金庭飛，黎 旭，羅夢(mèng)帆，譚東虎，劉明真，羅海波，郭宇星,

（1.南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210000；2.廣東益可維生物技術(shù)有限公司，廣東廣州 510000）

根據(jù)流行病學(xué)的研究數(shù)據(jù)，血液中膽固醇含量過高，可能會(huì)增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)。目前用于臨床治療的降膽固醇藥物多屬于化學(xué)類藥物，具有不同程度的毒副作用，因此尋找具有效果且無毒副作用的食源性降膽固醇成分成為了研究熱點(diǎn)。目前，研究報(bào)導(dǎo)用于生產(chǎn)生物活性肽的原料主要有大豆蛋白、乳清蛋白、蠶豆蛋白和酪蛋白等，其中酪蛋白作為牛乳中的主要蛋白，不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，而且還是生物活性物質(zhì)的重要來源。酪蛋白水解產(chǎn)物生物活性研究主要集中在抗氧化活性、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin-I converting enzyme，ACE）抑制活性以及抗菌活性等。除上述活性外，酪蛋白來源活性物質(zhì)因其安全性高、來源廣泛、無副作用等優(yōu)點(diǎn)成為尋找膽固醇防治途徑的重要研究方向。

目前，已有相關(guān)研究報(bào)導(dǎo)了各種動(dòng)植物來源的降膽固醇肽。來源比較多的集中于植物蛋白，如大豆、花生和小麥胚芽等。Sugano 等用微生物蛋白酶酶解得到的大豆多肽，可顯著增加膽汁鹽結(jié)合類固醇的排泄，降低小鼠血清中膽固醇的含量。Huang 等利用超聲輔助亞硫酸氫鈉預(yù)處理大豆蛋白獲得了降膽固醇肽。王才立利用體外模擬膽汁膠束實(shí)驗(yàn)確定小麥胚芽多肽具有降膽固醇作用。乳蛋白源降膽固醇肽報(bào)道較多的來源于乳清蛋白，如吳鳳酶解乳清蛋白得到降膽固醇肽。酪蛋白來源的降膽固醇肽報(bào)道較少，李健公開了利用堿性蛋白酶制備酪蛋白源性的降膽固醇肽，但未對(duì)制備工藝進(jìn)行系統(tǒng)優(yōu)化。因此，本文將研究酪蛋白源降膽固醇肽的制備工藝，進(jìn)一步擴(kuò)大酪蛋白源功能肽市場的研究與應(yīng)用。

本研究以酪蛋白為原料，采用酶解法，以膽固醇膠束溶解度抑制率為指標(biāo)，通過單因素和響應(yīng)面法對(duì)酪蛋白酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化，確定獲得酪蛋白源降膽固醇肽的最佳酶解工藝條件，并優(yōu)化分離方法，獲得制備酪蛋白源降膽固醇肽的最佳工藝。本研究旨在為酶解酪蛋白制備降膽固醇活性肽提供應(yīng)用研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

中性蛋白酶（50 U/mg）、堿性蛋白酶（100 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）南京奧多福尼生物科技有限公司；酪蛋白 中國惠興生化試劑有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉 分析純，南京生化試劑試劑有限公司；鹽酸、TCA（三氯乙酸）分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；?；悄懰徕c、膽固醇、油酸 生工生物工程（上海）股份有限公司；總膽固醇測(cè)定試劑盒 浙江東歐診斷產(chǎn)品有限公司；葡聚糖凝膠G-10 瑞典安瑪西亞有限公司。

GL-22M 高速冷凍離心機(jī) 賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；HH-6 恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；754 紫外可見分光亮度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；PHS-3B 精密pH 計(jì) 上海三信儀表廠；DT5-6C低速平衡臺(tái)式離心機(jī) 北京醫(yī)用離心機(jī)廠；KQ 3200E型超聲波清洗器 昆山市超聲波儀器有限公司；10 mL無菌注射器 常州市回春醫(yī)療器材有限公司；B 型中空纖維超濾儀 上海摩速科學(xué)器材有限公司；CXG-1 電腦恒溫層析柜 上海滬西分析儀器廠有限公司；Sephadex G-10 層析柱（10 mm×500 mm）上海煊盛生化科技有限公司；HL-2 恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；DBS-100 電腦全自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；Biosafer-10A 臺(tái)式冷凍干機(jī) 賽飛（中國）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酪蛋白水解工藝 取5 g 酪蛋白加入100 mL蒸餾水，制備50 mg/mL 的酪蛋白溶液。利用1 mol/L NaOH 和0.5 mol/L HCl 溶液調(diào)至適當(dāng)pH，水浴鍋加熱調(diào)至最適反應(yīng)溫度。采用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶三種蛋白酶分別對(duì)酪蛋白溶液進(jìn)行酶解，分別在堿性蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶最適的酶解條件水解3.5 h，最適pH 分別為6.0～10.0、7.0～9.0、6.0～8.0，反應(yīng)過程中保持溶液pH 恒定。酶解結(jié)束后置于90 ℃水浴鍋中滅活20 min，冷卻至室溫，離心取上清（7000×g,4 ℃,30 min），-20 ℃保存?zhèn)溆茫凑?.2.3 測(cè)定水解度。凍干上清，-20 ℃保存?zhèn)溆茫凑?.2.5 測(cè)定膽固醇膠束溶解度抑制率。

1.2.2 酶解酪蛋白制備降膽固醇多肽工藝優(yōu)化

1.2.2.1 單因素實(shí)驗(yàn) 分別研究溫度、pH、酶與底物比、底物濃度、時(shí)間對(duì)中性蛋白酶水解酪蛋白的影響，實(shí)驗(yàn)如下：稱取干酪素5.0 g，設(shè)置反應(yīng)溫度為55 ℃，底物濃度5 g/100 mL，按酶與底物比6%（m/v），反應(yīng)時(shí)間3.5 h，不同pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）；設(shè)置反應(yīng)pH 為7，底物濃度5 g/100 mL，按酶與底物比6%（m/v），反應(yīng)時(shí)間3.5 h，不同溫度（45、50、55、60、65 ℃）；設(shè)置反應(yīng)pH 為7，溫度為55 ℃，底物濃度5 g/100 mL，反應(yīng)時(shí)間3.5 h，不同酶與底物比（3%、4%、5%、6%、7%（m/v））；設(shè)置反應(yīng)pH 為7，溫度為55 ℃，按酶與底物比6%（m/v），反應(yīng)時(shí)間3.5 h，不同底物濃度（3、4、5、6、7 g/100 mL）；設(shè)置反應(yīng)pH 為7，溫度55 ℃，底物濃度5 g/100 mL，按酶與底物比6%（m/v），反應(yīng)時(shí)間3.5 h，不同水解時(shí)間（0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5 h），經(jīng)水解反應(yīng)后，立即90 ℃滅活10 min，而后7000×g，4 ℃離心10 min，取上清得酪蛋白酶解液。凍干上清，-20 ℃保存?zhèn)溆?，根?jù)1.2.3 和1.2.5 方法測(cè)定水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率。

1.2.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)降膽固醇活性影響最顯著的3 個(gè)因素為變量，運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，以膽固醇膠束溶解度抑制率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酪蛋白的酶解條件（見表1）。按照預(yù)測(cè)的酶解條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，按照1.2.5 測(cè)定膽固醇膠束溶解度抑制率。

表1 響應(yīng)面因素水平編碼表Table 1 Factors and levels of response surface text

1.2.3 水解度（Degree of hydrolysis，DH）測(cè)定 蛋白質(zhì)水解度（DH）的測(cè)定根據(jù)pH-state 法，具體方法如下：水解開始時(shí)，調(diào)節(jié)pH 為7，反應(yīng)結(jié)束后測(cè)定反應(yīng)體系的pH，用0.5 mol/L 的NaOH 將反應(yīng)體系的pH 調(diào)到原來的pH，記錄下所用NaOH 的體積，按公式（1）計(jì)算：

其中，B：NaOH 的體積（mL）；N：NaOH 的濃度（mol/L）；：-氨基的平均解離度，在pH7、50 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)于酪蛋白，1/為2.26；M：底物中蛋白質(zhì)質(zhì)量（g）；h：每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，在pH7、50 ℃的實(shí)驗(yàn)條件下，對(duì)于酪蛋白而言，該值取8.2 mmol/g。

1.2.4 多肽含量測(cè)定 參考張玲等的方法稍作修改，采用雙縮脲法測(cè)定水解液的多肽含量：1 mL 酶解液和1 mL 三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）混合，沉淀后2000×g 離心10 min，加4 mL 雙縮脲，室溫下靜置20 min 后，540 nm 下測(cè)吸光度值。以Gly-Gly-Tyr-Arg 四肽作為標(biāo)準(zhǔn)品，用TCA 溶液配制濃度為依次為0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度（y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.3709x+0.0116（=0.9976）。

1.2.5 膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定 參考Nagaoka 等的方法測(cè)定活性肽對(duì)模擬膽汁膠束膽固醇溶解度的抑制率，并略作修改。按照每10 mL磷酸鹽緩沖溶液加入0.15 g ?；悄懰徕c、0.03 g 膽固醇、50 μL 油酸、0.2 g 氯化鈉，配制膽汁膠束。稱取1 mL 凍干后的酪蛋白酶解多肽溶于蒸餾水配制濃度為0.2 mg/mL 多肽溶液，取10 mL 酪蛋白酶解多肽與膽汁膠束等比混合液作為樣品組，KQ 3200E型超聲波清洗器（114 W,25 ℃）乳化30 min，37 ℃培養(yǎng)24 h。常溫下離心，取上清液，針頭過濾器過濾并測(cè)定其OD。同時(shí)做空白組實(shí)驗(yàn)，用10 mL 的PBS 緩沖液代替酪蛋白水解液。計(jì)算酪蛋白酶解多肽對(duì)模擬膽汁膠束溶液中膽固醇膠束溶解度的抑制率（以下簡稱膽固醇抑制率），即可判斷降膽固醇活性。計(jì)算公式（2）如下：

1.2.6 酪蛋白酶解液超濾 酶解液在90 ℃滅活10 min，而后在7000×g，4 ℃離心10 min，取上清液，用截留分子量為10000 Da 的超濾膜進(jìn)行超濾，室溫，調(diào)整超濾膜壓力為0.1～0.4 MPa，流速為5～10 mL/min，得到分子量10000 Da 以下的超濾多肽溶液，超濾液通過真空冷凍干燥（溫度：-60 ℃，真空度：＜10 Pa，時(shí)間：24 h）進(jìn)行濃縮。

1.2.7 Sephadex G-10 分離酪蛋白降膽固醇肽條件研究 采用處理好的SephadexG-10 用10 mm×500 mm層析柱裝柱與核酸蛋白檢測(cè)儀及恒流泵連接，選擇220 nm 紫外濾光片，室溫用蒸餾水洗脫，每3 min 收集一管，冷凍干燥濃縮。分別研究上樣濃度、上樣體積、洗脫速度對(duì)酪蛋白降膽固醇肽分離的影響。上樣濃度選擇：粗肽上樣體積為2.5 mL，洗脫速度為3.5 mL/min 條件下，設(shè)置不同上樣濃度（40、60、80 mg/mL）進(jìn)行洗脫。上樣體積選擇：粗肽上樣濃度為80 mg/mL，洗脫速度為3.5 mL/min 條件下，設(shè)置不同選擇上樣體積（1.5、2.5、3.5 mL）進(jìn)行洗脫。洗脫速度選擇：粗肽上樣體積為2.5 mL，上樣濃度為80 mg/mL 條件下，設(shè)置不同洗脫速度分別為（2.5、3、3.5 mL/min）進(jìn)行洗脫。按照方法1.2.5 測(cè)定Sephadex G-10 分離后酪蛋白肽的降膽固醇活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

各實(shí)驗(yàn)組重復(fù)三次（n=3），利用Excel 2010 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，采用SPSS 26 軟件進(jìn)行顯著性差異分析，采用Design-Expert 8.05 軟件進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，采用GraphPad Prism 8 軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶種類的選擇

不同蛋白酶因其酶切位點(diǎn)的不同，水解酪蛋白的水解度與膽固醇膠束溶解度抑制率的結(jié)果也不相同。從圖1 可知：堿性蛋白酶水解酪蛋白水解度最高，中性蛋白酶水解度最低；膽固醇膠束溶解度抑制率最高的是中性蛋白酶，最低的是胰蛋白酶。這可能是因?yàn)閴A性蛋白酶作為微生物來源的內(nèi)切酶，其主要成分是絲氨酸蛋白酶，能夠裂解以異亮氨酸、亮氨酸以及纈氨酸等為終端的多種疏水性氨基酸。目前有相關(guān)研究已報(bào)道中性蛋白酶可有效降解酪蛋白，利用此特性制備特色干酪。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，中性蛋白酶水解產(chǎn)物酪蛋白雖然水解度低，但是具有最高的膽固醇膠束抑制率，相似的研究也已報(bào)道，水解度高并不一定說明產(chǎn)生的多肽也具有最高活性。這可能是由于中性蛋白酶具有水解產(chǎn)生降膽固醇肽的特異性酶切位點(diǎn)，具體機(jī)理將進(jìn)一步研究。因此，選擇中性蛋白酶作為制備酪蛋白源降膽固醇肽的工具酶。

圖1 不同工具酶酶解酪蛋白水解度和膽固醇膠束抑制率比較Fig.1 Comparison of enzymatic hydrolysis degree of and cholesterol micellar inhibition rate with different enzymes

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同pH 對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響 蛋白酶通常有其最適的酶活pH，在不同pH 下，即使相同的酶水解相同的底物蛋白，水解度以及產(chǎn)物的性質(zhì)也會(huì)有顯著性差異。如圖2 所示，隨著pH 增加水解度先增大后減小，在pH 為7 時(shí)水解度達(dá)到最大值為19.96%±0.25%。這可能是因?yàn)槔业鞍椎钠骄入婞c(diǎn)為pH 為4.6，在pH 為7 時(shí)酪蛋白分子間的靜電排斥作用增加，從而促進(jìn)了酪蛋白分子與蛋白酶的接觸。當(dāng)pH 在6.0～6.5 范圍時(shí)，膽固醇抑制率隨pH 的增加而逐漸升高達(dá)到最大值，之后膽固醇抑制率隨pH 增加而保持較小幅度的下降趨勢(shì)。因此，綜合考慮水解度和膽固醇抑制率pH 應(yīng)設(shè)定在6.0～7.0 范圍內(nèi)最優(yōu)。

圖2 pH 對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響Fig.2 Effect of pH on preparation cholesterol-lowering peptide

2.2.2 不同溫度對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響 不同溫度條件下中性蛋白酶水解酪蛋白的水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定如圖3 所示。從圖中可發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度在45～55 ℃時(shí)，水解度隨著溫度的升高呈增加趨勢(shì)，在55 ℃時(shí)水解度達(dá)到最大值，當(dāng)溫度繼續(xù)升高水解度呈下降趨勢(shì)。但在45～55 ℃段膽固醇抑制率高于60～65 ℃。這可能是因?yàn)樵谳^低的溫度范圍內(nèi)，反應(yīng)速率隨溫度的升高而加快，而超過某一溫度，酶會(huì)失活。因此，最優(yōu)反應(yīng)溫度應(yīng)設(shè)定在45～55 ℃范圍內(nèi)。

圖3 溫度對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響Fig.3 Effect of temperature on preparation cholesterollowering peptide

2.2.3 不同酶與底物比對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響 不同酶與底物比條件下中性蛋白酶水解酪蛋白的水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定如圖4所示。從圖中可發(fā)現(xiàn)在酶與底物比3%～5%（m/v）時(shí)，水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率都呈現(xiàn)連續(xù)上升趨勢(shì)，這可能是由于在底物濃度一定的情況下，隨著酶量的增加，酶與底物的結(jié)合越來越多，酶解過程不斷進(jìn)行，因而水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率增加較顯著。當(dāng)E/S 到達(dá)5%（m/v）后，隨著加酶量的繼續(xù)增加，酶與底物逐漸達(dá)到飽和。因此，從降膽固醇多肽的產(chǎn)生以及節(jié)約成本考慮，酶與底物比最適范圍選擇5%～7%（m/v）。

圖4 酶比對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響Fig.4 Effect of enzyme rate on preparation cholesterollowering peptide

2.2.4 不同底物濃度對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響不同底物濃度條件下中性蛋白酶水解酪蛋白的水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率的測(cè)定如圖5 所示。從圖中可發(fā)現(xiàn)底物濃度在3～5 g/100 mL 時(shí)水解度無顯著性差異（＞0.05），當(dāng)?shù)孜餄舛仍? g/100 mL時(shí)水解度達(dá)到最大值，且當(dāng)?shù)孜餄舛葹? g/100 mL時(shí)膽固醇膠束溶解度抑制率最高。因此，中性蛋白酶水解酪蛋白的最優(yōu)底物濃度即為5 g/100 mL。

圖5 底物濃度對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響Fig.5 Effect of concentration of substrate on preparation cholesterol-lowering peptide

2.2.5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)酪蛋白源活性肽降膽固醇能力的影響 比較不同反應(yīng)時(shí)間下中性蛋白酶水解酪蛋白的水解度和膽固醇膠束溶解度抑制率。從圖6中可發(fā)現(xiàn)水解度初期隨時(shí)間呈上升趨勢(shì)，且在反應(yīng)0.5～3.5 h 時(shí)膽固醇抑制率有一段躍變，但各個(gè)指標(biāo)在3.5 h 后差異不明顯。因此，反應(yīng)時(shí)間宜定在3.5 h，以充分發(fā)揮中性蛋白酶的水解酪蛋生產(chǎn)降膽固醇肽的最佳性能。

圖6 反應(yīng)時(shí)間對(duì)制備降膽固醇活性肽的影響Fig.6 Effect of reaction time on preparation cholesterollowering peptide

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

選擇以上單因素實(shí)驗(yàn)中溫度（T）、pH、酶與底物濃度比（E/S）三個(gè)可能具有交互作用且影響酶解產(chǎn)物活性較顯著的指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化（如表2）。將T（X）、E/S（X）、pH（X）作為變量，以膽固醇膠束溶解度抑制率（Y）為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化酶解工藝。根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，固定底物濃度為5 g/100 mL，水解時(shí)間為3.5 h。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果表Table 2 Design and result of Box-Behnken experient

利用軟件擬合方程，可以得到抑制率（Y）的二次多項(xiàng)式擬合方程為：

結(jié)合膽固醇膠束溶解度抑制率的方差分析表（表3）的值可判斷該模型顯著性較高，且其中X（溫度）、X（pH），交互項(xiàng)XX以及二項(xiàng)式X、X對(duì)Y（膽固醇抑制率）影響顯著（＜0.05）?？梢耘袛啾碇酗@示抑制率的=0.9326，失擬項(xiàng)值0.3214（＞0.05），這表明模型擬合程度較為合適。此外，值越大，影響越顯著，根據(jù)值，各因素對(duì)水解程度的影響大小依次為：溫度（T）、pH、酶與底物濃度比（E/S）。

表3 膽固醇抑制率的方差分析表Table 3 ANOVA for cholesterol inhibition rate

利用軟件Design-Expert 8.05 進(jìn)行分析，獲得3D模式的溫度、E/S、pH 兩兩交互作用對(duì)膽固醇抑制率的影響（圖7）。結(jié)合表3 結(jié)果，交互項(xiàng)XX對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析均為＜0.05，交互項(xiàng)XX、XX對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的顯著性分析均為＞0.05，表明pH 和酶與底物濃度比（E/S）交互作用顯著，溫度（T）和酶與底物濃度比（E/S）、溫度（T）和pH 交互作用不顯著。預(yù)測(cè)得中性蛋白酶水解酪蛋白制備降膽固醇活性肽的最佳水解條件：溫度為51.3 ℃，酶與底物濃度比（E/S）為6.47%，pH 為6.34，膽固醇抑制率為59.652%。對(duì)以上預(yù)測(cè)條件進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，設(shè)定反應(yīng)溫度為51.3 ℃，酶與底物濃度比為6.47%，pH 為6.34，水解底物濃度5 g/100 mL 的干酪素溶液3.5 h，采用雙縮脲方法測(cè)定酶解液的多肽含量為（0.252±0.05）mg/mL，膽固醇抑制率為58.25%±0.59%，接近于預(yù)測(cè)值，認(rèn)為此預(yù)測(cè)結(jié)果較為成功。

圖7 交互變量對(duì)膽固醇抑制率的相應(yīng)曲面和等高線圖Fig.7 Response surface plots and coutour plots for effect of interactive variables on cholesterol inhibition rate

2.4 Sephadex G-10 分離酪蛋白肽條件的優(yōu)化

中性蛋白酶水解酪蛋白后經(jīng)過10000 Da 的超濾分離后選擇Sephadex G-10 層析進(jìn)一步分離純化。上樣濃度對(duì)酪蛋白降膽固醇肽的分離效果如圖8（A）所示，從圖中可以發(fā)現(xiàn)在不同上樣濃度下，均有較好的分離度，峰型較好，考慮其收集效率，選擇粗肽的最大溶解濃度80 mg/mL 為上樣濃度。上樣體積對(duì)酪蛋白降膽固醇肽分離效果影響見圖8（B），可以發(fā)現(xiàn)上樣體積對(duì)酪蛋白降膽固醇肽的分離效果具有一定的影響，當(dāng)上樣體積為1.5 mL 時(shí)，雖能較好分離，但是目的蛋白收集量少，收集效率低。當(dāng)上樣體積為3.5 mL 時(shí)，第一個(gè)峰后沿較前沿平緩，峰不對(duì)稱，且出現(xiàn)有拖尾現(xiàn)象，因而綜合考慮選擇上樣體積選擇2.5 mL。洗脫速度對(duì)酪蛋白降膽固醇肽分離效果影響見圖8（C），從圖中可以發(fā)現(xiàn)洗脫速度較小時(shí)如2.5 mL/min 時(shí)存在峰的展寬和拖尾現(xiàn)象，并且洗脫時(shí)間太長。隨著洗脫速度增加，展寬和拖尾現(xiàn)象減小。這可能是因?yàn)榱魉龠^低時(shí)樣品橫向擴(kuò)散增大，峰變寬，分辨率降低，洗脫時(shí)間長，分離效果變差。因此洗脫速度選擇3.5 mL/min?？偟膩碚f，上樣濃度、體積、洗脫速度對(duì)多肽分離均勻一定影響，最終選擇濃度80 mg/mL，體積選擇2.5 mL，洗脫速度3.5 mL/min進(jìn)行上酪蛋白降膽固醇肽分離純化。

圖8 Sephadex G-10 分離酪蛋白肽條件的優(yōu)化Fig.8 Optimization of separation conditions of casein peptide by Sephadex G-10

2.5 酪蛋白肽降膽固醇活性測(cè)定

在溫度51.3 ℃、pH6.34、酶與底物濃度比為6.47%（m/v）的條件下，用中性蛋白酶酶解反應(yīng)3.5 h水解酪蛋白制備粗肽，經(jīng)Sephadex G-10 以濃度80 mg/mL，體積選擇2.5 mL，洗脫速度3.5 mL/min進(jìn)行上酪蛋白降膽固醇肽分離純化，分離后的收集兩個(gè)峰分別記為樣品A（峰1）和樣品B（峰2）。峰1和峰2 樣品在100 μg/mL 的膽固醇膠束溶解度抑制率分別為24.20%±0.24%和4.30%±0.16%，峰1 具有較高的膽固醇膠束溶解度抑制率。已報(bào)導(dǎo)的降膽固醇活性肽主要通過評(píng)價(jià)其抑制膽固醇合成關(guān)鍵酶活性和抑制膽固醇的吸收而篩選獲得。三羥基三甲基戊二酸單酰輔酶A 還原酶（HMG-CoA 還原酶）是膽固醇合成的主要限速酶，參與調(diào)控內(nèi)源性膽固醇的生物合成，因此抑制HMG-CoA 還原酶的活性能有效抑制膽固醇的合成。吳鳳研究了-乳球蛋白水解肽對(duì)肝臟HMG-CoAR 活性的抑制率，不同水解條件下得到的多肽產(chǎn)物最大抑制率可達(dá)66.67%。高學(xué)飛等發(fā)現(xiàn)乳清蛋白水解肽對(duì)HMG-CoAR 的活性有明顯的抑制效果。另一種方法是通過抑制膽固醇膠束溶解度抑制膽固醇的吸收，活性肽能降低膽汁中的膽固醇含量，爭奪膽固醇在混合膠束的空間，以干擾膽固醇在小腸的外源吸收。孫丹丹以乳清蛋白WPC80 為原料，以膽固醇膠束溶解度抑制率與水解度為指標(biāo)制備降膽固醇多肽，經(jīng)過超濾處理抑制率為29.71%與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。

3 結(jié)論

本文研究并確定了制備酪蛋白源降膽固醇肽的最佳工藝：以酪蛋白為原料，濃度為5 g/100 mL，采用中性蛋白酶在溫度51.3 ℃，酶與底物濃度比為6.47%（m/v），pH 為6.34，酶解反應(yīng)時(shí)間3.5 h，膽固醇抑制率為58.25%±0.59%。酶解結(jié)束后滅酶，上清液經(jīng)截留分子量為10000 Da 超濾后，采用Sephadex G-10 在上樣濃度80 mg/mL，上樣體積2.5 mL，洗脫速度3.5 mL/min 的條件進(jìn)行分離純化，可制備獲得分子量小于10000 Da，且具有抑制降固醇膠束溶解活性的降膽固醇肽。因此，本文的研究進(jìn)一步拓寬了乳蛋白在功能性食品市場的應(yīng)用，為國民大健康開拓了更多的功能性多肽食品。本文后續(xù)將進(jìn)一步開展對(duì)酪蛋白源降膽固醇肽體外及體內(nèi)活性的測(cè)定、降膽固醇多肽構(gòu)效關(guān)系等研究，以期為降膽固醇肽的開發(fā)提供理論研究基礎(chǔ)。