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    基于UCP2-SIRT3通路探討瑞舒伐他汀聯(lián)合丹參川芎嗪注射液對腦缺血/再灌注的影響

    2022-09-25 11:33:02田洪濤姚永新隋媛王其亮
    中國老年學(xué)雜志 2022年18期
    關(guān)鍵詞:生物科技川芎嗪孵育

    田洪濤 姚永新 隋媛 王其亮

    (青島市中醫(yī)醫(yī)院(青島市海慈醫(yī)院) 1神經(jīng)外科,山東 青島 266033; 2健康管理科;3藥劑科)

    腦缺血/再灌注是長時(shí)間大腦嚴(yán)重缺血或缺氧引起的腦梗死,出現(xiàn)腦水腫和腦細(xì)胞壞死,損傷器官。在臨床上具有較高的發(fā)病率和死亡率,嚴(yán)重危害中老年患者健康,需要及時(shí)采取措施進(jìn)行治療〔1,2〕。瑞舒伐他汀(RS)屬于選擇性還原酶抑制劑,臨床上具有降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化,治療腦梗死的作用〔3〕。丹參川芎嗪注射液(DS)為復(fù)方制劑,其組分為鹽酸川芎嗪,對腦阻塞、腦血栓等腦血管疾病具有較好的效果〔4〕。研究表明,RS類藥物聯(lián)合丹參川芎嗪可以治療腦缺血、心血管疾病,還可以降低血壓等。UCP2-SIRT3信號通路是調(diào)控機(jī)體氧化應(yīng)激和線粒體動(dòng)力的一種途徑,已經(jīng)腦缺血/再灌注疾病中發(fā)揮功能〔5〕。本實(shí)驗(yàn)基于UCP2-SIRT3通路探討RS聯(lián)合DS對腦缺血/再灌注損傷的影響。

    1 材料與方法

    1.1材料

    1.1.1藥物 RS購自美國Sigma公司,批號:Y0001719。DS購自貴州拜特制藥有限公司,批號:20210209,規(guī)格:每支5 ml。將DS稀釋成原濃度的15%,配制成100 μmol/L〔1〕。

    1.1.2細(xì)胞和試劑 人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SH-SY5Y系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);改良培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(FBS,美國Gibco公司);噻唑藍(lán)(MTT)試劑盒(上海碧云天生物科技有限公司);酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(上海酶聯(lián)免疫生物科技有限公司);JC-1染色液(七海復(fù)泰生物科技公司);放射免疫沉淀測定(RIPA)緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(北京索萊寶生物科技有限公司);UCP2單抗、SIRT3單抗、TOMM20單抗、羊抗兔IgG二抗(武漢博士的生物科技有限公司);Trizol試劑(日本Takara公司)。

    1.2方法

    1.2.1構(gòu)建氧糖剝奪/復(fù)氧(OGD/R)模型 SH-SY5Y細(xì)胞置于DMEM培養(yǎng)基中(不含F(xiàn)BS和抗生素),在37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱條件下,進(jìn)行氧糖剝奪8 h,之后更換為含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h,OGD/R模型建立成功。

    1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和分組 常規(guī)培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞作為Control組。構(gòu)建OGD/R模型的細(xì)胞作為OGD/R組。采用低濃度(2.5 μmol/L)、高濃度(40 μmol/L)的RS處理OGD/R細(xì)胞,再分別添加DS,作為OGD/R+RS-L+DS、OGD/R+RS-H+DS組。將si-NC、si-UCP2轉(zhuǎn)染至OGD/R細(xì)胞中,再用高濃度的RS和DS處理,作為OGD/R+si-NC組、OGD/R+si-NC+RS-L+DS組、OGD/R+si-NC+RS-H+DS組,OGD/R+si-UCP2組、OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS組、OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS組。

    1.2.3MTT檢測細(xì)胞增殖 將細(xì)胞接種于96孔板,每孔添加10 μl MTT溶液,37℃條件下培養(yǎng)4 h,離心后去除上清液,向每孔中添加100 μl二甲基亞砜(DMSO)溶液。分光光度計(jì)檢測各孔450 nm的吸光度。將吸光度換算成細(xì)胞存活率。

    1.2.4ELISA檢測細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-10水平

    根據(jù)ELISA試劑盒的說明書檢測細(xì)胞中IL-6、IL-8、IL-10水平,實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照操作流程進(jìn)行。

    1.2.5共聚焦法觀察UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)和定位 用預(yù)冷的4%多聚甲醛固定各組細(xì)胞15 min,觀察細(xì)胞形態(tài)。在細(xì)胞中滴加正常山羊血清,室溫封閉1 h。吸棄血清,加入稀釋的一抗(1:1 000),4℃孵育過夜;加入稀釋的二抗(1∶2 000),室溫避光孵育2 h。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)染色8 min,滴加50%甘油,共聚焦熒光拍照。

    1.2.6建立UCP2沉默細(xì)胞系 SH-SY5Y細(xì)胞在含10% FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將si-UCP2-673、si-UCP2-853、si-UCP2-1235和陰性對照si-NC分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞中,檢測基因和蛋白表達(dá)水平,篩選沉默效果最好的UCP2用于后續(xù)研究。

    1.2.7Western印跡檢測細(xì)胞中UCP2蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞,加入RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測定蛋白濃度,應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,封閉2 h,室溫孵育一抗稀釋液(UCP2稀釋比1∶1 000),4℃孵育過夜,TBST洗滌,孵育二抗稀釋液(稀釋比1∶2 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,滴加ECL顯影,應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

    1.2.8qRT-PCR檢測細(xì)胞中UCP2 mRNA和PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá) 采用Trizol法提各組細(xì)胞中總RNA,應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計(jì)檢測RNA濃度。反轉(zhuǎn)錄將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件:25℃ 10 min,37℃ 60 min,95℃ 5 min,4℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系:RNA 2 μl,10×RT緩沖液2 μl,dNTP 0.4 μl,Multiscripe RT 1 μl,10×Random Primer 2 μl,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系:SYBR Green Master Mix 10 μl,正反向引物0.8 μl,cDNA 1 μl,RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至20 μl;反應(yīng)條件:95℃ 2 min,95℃ 15 s,60℃ 30 s,72℃ 30 s,共循環(huán)40次。UCP2:上游引物5′-TAGACGTGGTCAAGACGAGATA-3′,下游5′-AGGGCATGAA CCCTTTGTAG-3′。PGC1:上游引物5′-CCAAACCAACAACTTTATCTCTTCC-3′,下游5′-CACACTTAAGGTGCGTTCAATAGTC-3′;Drp1:上游引物 5′-CACCCGGAGACCTCTCATTC-3′,下游5′-CCCCATTCTTCTGCTTCCAC-3′;Opa1:上游引物5′-GTGCTGCCCGCCTAGAAA-3′,下游5′-TGACAGGCACCCGTACTCAGT-3′; GADPH:上游引物5′-AGGTTGTCTCCTGCGACTTC-3′,下游5′-CTTGCTCAGTGTCCTTGCTG-3′。以GADPH為內(nèi)參。采用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對表達(dá)量。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn),方差分析。

    2 結(jié) 果

    2.1RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞增殖的影響 與Control組〔(100.00±10.92)%〕相比,OGD/R組細(xì)胞存活率顯著降低〔(41.40±4.33)%,P<0.05〕;與OGD/R組相比,OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組細(xì)胞存活率顯著升高〔(78.94±9.11)%、(86.49±7.37)%,P<0.05〕。

    2.2RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞炎性因子水平的影響 與Control組相比,OGD/R組細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-10水平顯著升高(P<0.05);與OGD/R組相比,OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組細(xì)胞IL-6、IL-8、IL-10水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

    表1 RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞炎性因子水平的影響

    2.3建立UCP2沉默細(xì)胞系 與NC組相比,si-NC組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度無顯著變化(P>0.05),si-UCP2-673組、si-UCP2-1235組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度顯著降低(P<0.05);與NC組、si-NC組比較,si-UCP2-853組UCP2 mRNA和蛋白表達(dá)水平及濃度極顯著降低(P<0.05)。所以,采取UCP2-853進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表2,圖1。

    表2 建立UCP2 沉默細(xì)胞系

    1~5:NC組、si-NC組、si-UCP2-673組、si-UCP2-853組、si-UCP2-1235組圖1 各組UCP2蛋白表達(dá)

    2.4RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)和定位的影響 與Control組相比,OGD/R組細(xì)胞UCP2、SIRT3免疫熒光明顯減弱(P<0.05);與OGD/R組相比,RS聯(lián)合DS顯著增強(qiáng)細(xì)胞UCP2、SIRT3免疫熒光(P<0.05)。見表3。抑制UCP2表達(dá)前后,各組SIRT3表達(dá)水平無顯著差異(P>0.05)。抑制UCP2表達(dá)前,與OGD/R-si-NC組比較,RS聯(lián)合DS顯著升高TOMM20表達(dá)水平(P<0.05);抑制UCP2后,各組TOMM20表達(dá)水平均顯著降低(P<0.05)。見表3。

    2.5RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)的影響 與Control組相比,OGD/R組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與OGD/R組相比,OGD/R+RS-L+DS組、OGD/R+RS-H+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著降低,Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。與OGD/R組或OGD/R+si-NC組相比,OGD/R+si-UCP2組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。與OGD/R+RS-L+DS組或OGD/R+si-NC+RS-L+DS組相比,OGD/R+si-UCP2+RS-L+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05);與OGD/R+RS-H+DS組或OGD/R+si-NC+RS-H+DS組相比,OGD/R+si-UCP2+RS-H+DS組PGC1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表3。

    表3 RS聯(lián)合DS對腦OGD/R細(xì)胞UCP2、SIRT3和TOMM20分子表達(dá)熒光強(qiáng)度、PGC1、Drp1、Opa1 mRNA表達(dá)的影響

    3 討 論

    腦缺血/再灌注是大腦在長時(shí)間缺血缺氧情況下造成的組織不可逆損傷,減弱了增強(qiáng)線粒體功能,降低線粒體跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝,抑制腦細(xì)胞存活〔7,8〕。RS治療動(dòng)脈粥樣硬化性腦血管病的臨床效果較好,安全性較高〔9〕。RS可以降低腦梗死患者血脂、炎癥因子水平,臨床價(jià)值顯著,沒有不良反應(yīng)〔10〕。DS是由丹參提取液和鹽酸川芎嗪組成的,DS下調(diào)了急性腦梗死患者血清hs-CRP、TNF-α、IL-6水平,改善了腦環(huán)境〔11〕。DS能有效減輕腦神經(jīng)功能損傷,改善血液流變,治療腦血栓〔12〕。有類似的研究報(bào)道,丹紅注射液聯(lián)合RS治療不穩(wěn)定型心絞痛〔13〕。復(fù)方丹參滴丸聯(lián)合瑞舒伐他汀治療冠心病合并的高脂血癥〔14〕。已經(jīng)有文獻(xiàn)結(jié)果,RS通過UCP2-SIRT3信號調(diào)控降低腦腦缺血/再灌注對神經(jīng)元的損傷,減低OGD/R細(xì)胞凋亡,提高細(xì)胞存活率,阻止OGD/R細(xì)胞膜電位下降〔15〕。RS通過調(diào)控UCP2-SIRT3通路減輕腦缺血/再灌注對神經(jīng)元線粒體的損傷,增加OGD/R細(xì)胞中UCP2、SIRT3分子表達(dá)〔16〕。綜上,RS聯(lián)合DS通過調(diào)控UCP2-SIRT3通路減輕腦缺血/再灌注造成的損傷,為治療該疾病提供理論基礎(chǔ)。

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