nAChR激動劑對左旋多巴致老年大鼠帕金森病異動癥的作用

楊虹 成靜 陳芳

(武漢市第四醫(yī)院 華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛醫(yī)院急診科，湖北 武漢 430034)

帕金森病(PD)是一種主要以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性壞死引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變〔1，2〕。目前PD的一線治療藥物仍是左旋多巴(L-dopa)，它能較好地改善PD所導(dǎo)致的異常運(yùn)動癥狀和提升患者的日常生活能力，但使用該藥5～10年后主要不良反應(yīng)異動癥(LID)發(fā)病率高達(dá)80%〔3，4〕，直接導(dǎo)致患者的運(yùn)動功能亢進(jìn)和致殘率的增加〔5，6〕。異動癥的首選治療藥物是金剛烷胺，但它的治療效果欠佳，而且常常因?yàn)槟退幮院透弊饔玫陌l(fā)生而停藥〔7，8〕。

有研究顯示非選擇性乙酰膽堿受體(nAChR)激動劑可改善L-dopa所致PD的異動癥，但其具體劑量、使用方法和機(jī)制仍不清楚。本研究給予nAChR激動劑腹腔注射老年大鼠異動癥模型，監(jiān)測與異動癥相關(guān)的作用因子和透射電鏡下觀察大鼠紋狀體區(qū)神經(jīng)突觸的超微變化，探索nAChR激動劑對L-dopa致老年大鼠PD異動癥的作用。

1 材料與儀器

1.1實(shí)驗(yàn)動物 選擇體重(220±20)g的(22±2)月齡SD老年大鼠(湖北逸摯誠生物科技有限公司)80只，性別不限。置于(25±1)℃，相對濕度為(50±10)%，在清潔級環(huán)境中白天黑夜各12 h喂養(yǎng)1 w，自由進(jìn)食和飲水。

1.2主要試劑與實(shí)驗(yàn)儀器 主要試劑：6-羥基多巴胺(6-OHDA)、L-dopa、阿撲嗎啡、芐絲肼、nAChR激動劑(Sigma公司)，兔抗大鼠TH(谷歌生物公司)。實(shí)驗(yàn)儀器：腦立體定位儀(美國Stoelting公司)，臺式低溫高速離心機(jī)(Sigma公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)，脫色搖床(杭州佑寧儀器廠)。

1.3大鼠PD模型 大鼠術(shù)前禁食12 h，用10%水合氯醛以3 ml/kg速度給予大鼠腹腔注射，麻醉成功后，將大鼠頭部固定于腦立體定位儀上。局部備皮消毒，依據(jù)Paxinos-Watson腦立體定位圖譜〔9〕，大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)坐標(biāo)定位：正中線右側(cè)1.5 mm，前囟后4.4 mm，硬膜下7.8 mm。抽取6 μl 6-OHDA溶液，進(jìn)針至硬腦膜下-7.8 mm處，按0.5 μl/min速度向MFB注射。在手術(shù)操作14 d后皮下注射阿撲嗎啡(0.1 mg/kg)，誘導(dǎo)大鼠向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)，10 min后計算30 min大鼠的旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。大鼠PD模型標(biāo)準(zhǔn)：平均旋轉(zhuǎn)圈數(shù)>7圈/min。

1.4大鼠PD異動癥模型 建立L-dopa致大鼠PD異動癥模型：造模成功的PD大鼠每日腹腔注射L-dopa(10 mg/kg)和芐絲肼(2.5 mg/kg)1次，持續(xù)14 d。然后每天注射L-dopa 10 min前，給予生理鹽水(1 ml/kg)或nAChR激動劑(0.1 mg/kg)腹腔注射，持續(xù)21 d。

1.5異常不自主運(yùn)動(AIM)評分 AIM分為〔10〕：(1)前肢AIM(2)軸性AIM(3)口面部AIM(4)對側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動AIM。成功建立大鼠PD異動癥模型后，持續(xù)給予生理鹽水或nAChR激動劑治療21 d。在第1天和第21天進(jìn)行6次AIM評分，給藥20 min后，持續(xù)觀察1 min進(jìn)行評分，間隔20 min 1次。AIM評分為4種評分之和。AIM最高評分72分(評分6次，單次最高評分為12分)。

1.6實(shí)驗(yàn)分組 隨機(jī)將造模成功的PD大鼠分為3組：(1)control組(n=20)：手術(shù)毀損大鼠MFB，予以等量生理鹽水35 d；(2)L-dopa對照組(n=20)：建立PD模型后給予L-dopa和芐絲肼連續(xù)14 d，然后在給予L-dopa和芐絲肼治療前10 min給予生理鹽水，連續(xù)21 d；(3)nAChR激動劑組(n=20)：建立PD模型后給予L-dopa和芐絲肼連續(xù)14 d，然后在L-dopa和芐絲肼治療前10 min給予nAChR激動劑連續(xù)注射21 d。

1.7觀察紋狀體神經(jīng)突觸 異動癥模型大鼠在第21天予以L-dopa注射1 h后，10%水合氯醛(5 ml/kg)腹腔注射麻醉，用4%多聚甲醛行心臟灌流固定。取出大鼠腦組織后在毀損側(cè)紋狀體區(qū)切取1 mm×1 mm×1 mm組織塊放入2.5%戊二醛中浸泡。標(biāo)本予以固定、包埋、鉛和鈾雙染色后制成銅網(wǎng)，在透射電鏡下觀察紋狀體區(qū)神經(jīng)突觸后致密帶的寬度和突觸間隙。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1異動癥大鼠模型制作結(jié)果 PD大鼠經(jīng)L-dopa治療后，62只(71.0%)出現(xiàn) AIM，平均出現(xiàn)時間(1.8±1.2)d，16只(20.0%)未出現(xiàn)AIM或AIM評分達(dá)不到異動癥模型標(biāo)準(zhǔn)，2只(3.2%)死亡。異動癥的主要表現(xiàn)為毀損對側(cè)旋轉(zhuǎn)行為和刻板動作， 如對側(cè)前肢不自主上下拍打、抓撓或顫抖；嘴巴出現(xiàn)不自主舔舐、咀嚼；頸部和軀干向健側(cè)扭轉(zhuǎn)；快速地向?qū)?cè)旋轉(zhuǎn)、首尾相連；偶向健側(cè)伸舌等。治療全程中，4～7 d達(dá)到典型異動癥標(biāo)準(zhǔn)， 14～21 d達(dá)到高峰。

2.21 d nAChR激動劑治療不能改善PD大鼠異動癥 PD大鼠注射L-dopa 14 d后隨機(jī)分配到L-dopa對照組和nAChR激動劑組，L-dopa對照組AIM評分〔(32.01±3.22)分〕與nAChR激動劑組〔(29.11±2.88)分〕無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。nAChR激動劑干預(yù)1 d時，L-dopa對照組AIM評分〔(29.51±3.10)分〕與nAChR激動劑組〔(28.82±2.07)分〕無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。表明1 d nAChR激動劑對PD大鼠異動癥無明顯改善作用。

2.321 d nAChR激動劑可減輕PD大鼠異動癥 持續(xù)予以nAChR激動劑21 d后對PD大鼠進(jìn)行AIM評分。nAChR激動劑組AIM評分〔(21.15±2.08)分〕較L-dopa對照組〔(32.01±3.22)分〕顯著降低(P<0.05)。分別比較AIM的4個部分，L-dopa對照組軸性及前肢AIM評分均顯著高于nAChR激動劑組(P<0.05)，而兩組口面部及對側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動AIM評分無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)。見表1。

2.4紋狀體區(qū)神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu) L-dopa對照組與control組比較，突觸后膜致密帶寬度顯著增大,突觸間隙寬度顯著變窄(P<0.05)。nAChR激動劑組與L-dopa對照組相比，突觸后致密帶寬度顯著減小,突觸間隙的寬度顯著變大(P<0.05)，見表1。

表1 各組軸性AIM、前肢AIM、口面部AIM、對側(cè)旋轉(zhuǎn)運(yùn)動AIM評分、紋狀體突觸寬度及致密帶寬度

3 討 論

L-dopa治療PD 5年后有40%～90%患者出現(xiàn)異動癥，嚴(yán)重降低PD患者生活質(zhì)量甚至致殘。治療異動癥的藥物包括作用于多種神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺能、谷氨酸能、5-羥色胺能、γ-氨基丁酸(GABA)能、腺苷受體、腎上腺神經(jīng)的藥物，還有nAChR激動劑、馬福利特、咖啡因等〔11～14〕。本研究PD大鼠異動癥隨治療時間延長程度逐漸加重，這可能和波動性L-dopa治療和黑質(zhì)紋狀體多巴胺能神經(jīng)元變性壞死增多有關(guān)。實(shí)驗(yàn)證明無論是間歇性nAChR激動劑治療還是持續(xù)nAChR激動劑治療,都可能有助于治療PD患者L-dopa所致的運(yùn)動障礙〔15〕。nAChR亞型中有α4β2，α6β2 和α7 nAChR在紋狀體中表達(dá)。Johnston等〔16〕發(fā)現(xiàn)長期服用nAChR激動劑的L-dopa大鼠,無論是間歇注射還是通過滲透泵給藥,nAChR激動劑對改善已建立的口舌部和前肢的表達(dá)有類似作用。Iderberg等〔11,12,17〕發(fā)現(xiàn)nAChR激動劑可減輕PD猴子模型和嚙齒類動物模型的異動癥癥狀，表明nAChR激動劑在多種物種中均有效。有以下可能的作用機(jī)制：①通過 nAChR作用影響多巴胺能神經(jīng)元的活性，促進(jìn)多巴胺釋放，減輕黑質(zhì)紋狀體區(qū)神經(jīng)元的損害 。②nAChR激動劑可激活黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元α7 nAChRs，刺激抗炎的信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(IFN)-γ 和白細(xì)胞介素(IL)-6〔18〕，從而減輕神經(jīng)系統(tǒng)炎癥；通過nAChR降低多巴胺能神經(jīng)元中不穩(wěn)定鐵元素的含量發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用〔19〕。異動癥是L-dopa治療PD后神經(jīng)細(xì)胞產(chǎn)生被動適應(yīng)和可塑變化的結(jié)果 。本研究結(jié)果示持續(xù)21 d nAChR激動劑治療可明顯減輕神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)的變化?？赡芫売谠撍幹委煾蓴_正常多巴胺運(yùn)動神經(jīng)元生理調(diào)控機(jī)制。神經(jīng)元的可塑性表現(xiàn)在功能上的改變?nèi)缟窠?jīng)遞質(zhì)釋放的增加 ，受體敏感性的增強(qiáng)；表現(xiàn)在解剖上的改變比如軸突的再生長，出現(xiàn)萌芽和新生突觸〔20〕。