lncRNA LINC00958靶向調控miR-597-5p對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

魏娜 侯凈 王光輝 王舒 倪青

(貴州省人民醫(yī)院乳腺外科，貴州 貴陽 550002)

乳腺癌是一種常見的惡性婦科腫瘤，是導致女性癌癥相關死亡的主要原因之一〔1〕。迄今為止，在分子水平上乳腺癌的發(fā)病機制仍然未知。長鏈非編碼RNA(lncRNA)包含可作為ceRNA的miRNA響應元件，并在各種病理過程中發(fā)揮關鍵作用，包括乳腺癌〔2〕。研究表明，LINC00958在膠質瘤組織和細胞中上調表達，敲低其表達可抑制膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，阻滯細胞周期，LINC00958通過調控miR-203/周期蛋白依賴性激酶(CDK)2在神經膠質瘤的發(fā)生中起著致癌基因的作用〔3〕。LINC00958在口腔鱗癌、非小細胞肺癌組織和細胞中高表達，能促進口腔鱗癌細胞的增殖和遷移，抑制細胞凋亡，而下調LINC00958可抑制非小細胞肺癌細胞的增殖，促進細胞凋亡〔4，5〕。miR-597-5p在人乳頭瘤病毒(HPV)16陽性子宮頸癌組織中表達下調，可能是HPV16感染后宮頸癌發(fā)生的新標志物〔6〕。miR-597在乳腺癌組織中表達下調，上調其表達可抑制乳腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲〔7〕。但LINC00958在乳腺癌組織中的表達及其對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響，且LINC00958是否通過靶向調控miR-597-5p的表達影響乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖、遷移、侵襲和凋亡目前尚未可知。因此，本研究對LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達和在MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡中的作用進行評價，并分析LINC00958與miR-597-5p之間的靶向關系，旨在闡明LINC00958的功能機制。

1 材料與方法

1.1材料 乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院細胞研究所(中國上海)；Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)、Lipofectamine 2000試劑購自Invitrogen公司；四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma-Aldrich公司；靶向LINC00958的siRNA(si-LINC00958)和陰性對照(si-NC)、pcDNA-LINC00958和陰性對照(pcDNA)、miR-597-5p模擬物和陰性對照(miR-NC)、miR-597-5p抑制劑(anti-miR-597-5p)和陰性對照(anti-miR-NC)購自RiboBio公司；反轉錄試劑盒、SYBR Green PCR Master Mix購自TaKaRa公司；Transwell板購自Corning公司；放射免疫沉淀試驗(RIPA)裂解緩沖液、雙辛可寧酸蛋白質分析試劑盒購自Applygen公司；TBS-Tween(TBST)購自OriGene公司；二抗購自ProteinTech公司。41對配對的乳腺癌組織與癌旁組織樣本來自貴州省人民醫(yī)院2017年10月至2018年9月接受手術切除的乳腺癌患者，所有樣品通過手術獲得，并立即將切下的標本浸入液氮中，在-80℃下保存?zhèn)溆谩１狙芯恐惺褂玫慕M織方案通過醫(yī)院倫理審查委員會批準，患者或其家屬知情同意。

1.2細胞培養(yǎng) MDA-MB-231細胞在10% FBS的DMEM中，37℃，5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.3細胞轉染與分組 轉染前，將MDA-MB-231細胞以5×105/孔接種到6孔板。根據制造商的規(guī)程，當MDA-MB-231細胞達到70%～80%融合時，使用Lipofectamine 2000試劑將RNA寡核苷酸轉染到MDA-MB-231細胞中，分為si-NC組、si-LINC00958組、miR-NC組、miR-597-5p組、pcDNA組、pcDNA-LINC00958組、si-LINC00958+anti-miR-NC組、si-LINC00958+anti-miR-597-5p組。轉染48 h，通過qRT-PCR評估siRNA或pcDNA轉染的有效性。

1.4qRT-PCR檢測LINC00958和miR-597-5p表達 通過使用TRIzol試劑從乳腺癌組織或MDA-MB-231細胞中獲得總RNA樣品。然后根據反轉錄試劑盒的指南制備cDNA。對于定量分析，將SYBR Green PCR Master Mix在Step-One Plus實時PCR。比較2-ΔΔCt方法用于計算LINC00958和miR-597-5p相對表達水平。GAPDH或U6被視為內部對照。特異性引物序列如下：LINC00958正向引物5′-GTCTCCCTGGTTTCTCACAGTT-3′，反向5′-TCCCTGGCTACAAATAACCACA-3′；miR-597-5p正向引物5′-ACACTCCAGCTGGGTGTGTCACTCGATGAC-3′，反向5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；U6正向引物5′-CTC-GCTTCGGCAGCACA-3′，反向5′-AACGCTTCACGA-ATTTGCGT-3′；GAPDH正向引物5′-CTGGGCTACACT-GAGCACC-3′，反向5′-AAGTGGTCGTTGAG-GGCAATG-3′。

1.5MTT檢測MDA-MB-231細胞增殖 將轉染的1×104個MDA-MB-231細胞接種在96孔板中。48 h時，取100 μl MTT溶液(0.5 mg/ml)加入每個孔中，再孵育4 h后，加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)。在490 nm的波長下讀取酶標儀OD值。

1.6Transwell檢測MDA-MB-231細胞遷移、侵襲 對于Transwell遷移測定，將無血清DMEM(200 μl)中5×104個MDA-MB-231細胞添加到Transwell的上腔室，而下腔室(600 μl)的DMEM中添加10% FBS。在37℃培養(yǎng)24 h，用棉簽除去膜上表面的細胞，室溫下用甲醇固定，0.1%的結晶紫將下表面的MDA-MB-231細胞染色20 min。使用TE2000-S倒置光學顯微鏡從3個獨立的樣本中捕獲3個不同視野的圖像，對遷移的細胞數進行定量分析。對于Transwell侵襲測定，上腔室預先涂布40 μl基質膠。后續(xù)操作步驟同Transwell遷移測定。

1.7流式細胞術檢測MDA-MB-231細胞凋亡 膜聯蛋白(Annexin)V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒用于確定轉染的MDA-MB-231細胞凋亡。MDA-MB-231細胞在冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)中洗滌2次，重懸于包含5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶溶液的100 μl結合緩沖液中。在黑暗中孵育，15 min內上FACScan流式細胞儀確定凋亡細胞的比例。

1.8Western印跡檢測Ki-67、基質金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關X蛋白(Bax)表達 在RIPA裂解緩沖液中裂解MDA-MB-231細胞，使用二喹啉甲酸蛋白質分析試劑盒對蛋白濃度進行定量，并將每個樣品中等量的蛋白(20 μg)加載到10%十二烷基硫酸鈉(SDS)凝膠上，進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離并轉移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜。在室溫下，用5%脫脂牛奶在TBST中封閉膜1 h，然后在4℃下與一抗(稀釋為1∶10 000)孵育過夜。第2天，將PVDF膜用TBST洗滌3次，并與適當的辣根過氧化物酶耦聯的免疫球蛋白(Ig)G二抗(稀釋為1∶10 000)在室溫下放置1 h。通過增強的化學發(fā)光試劑盒觀察免疫反應帶，Image-pro plus進行Western印跡的光密度分析。GAPDH用作負載對照。

1.9雙熒光素酶報告實驗分析LINC00958與miR-597-5p的靶向關系 使用pGL3-reporter熒光素酶載體構建包含miR-597-5p結合位點的pGL3-LINC00958野生型(WT)或突變型(MUT)載體，分別記為WT-LINC00958或MUT-LINC00958。之后將其分別于miR-NC或miR-597-5p共同轉染MDA-MB-231細胞，轉染48 h后，用雙熒光素酶報告基因測定系統(tǒng)測定WT-LINC00958或MUT-LINC00958的熒光素酶活性。

1.10統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達 與癌旁組織比較，乳腺癌組織中LINC00958表達水平顯著升高，miR-597-5p表達水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00958和miR-597-5p在乳腺癌組織中的表達

2.2抑制LINC00958蛋白表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組MDA-MB-231細胞的LINC00958、ki-67蛋白表達水平、細胞增殖均顯著降低(P<0.05)。見圖1、表2。

圖1 Western印跡檢測Ki-67蛋白表達

2.3抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組遷移、侵襲細胞數、MMP-2、MMP-9表達水平均顯著降低(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲的影響

2.4抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響 與si-NC組比較，si-LINC00958組細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)，Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖3、表3。

表3 抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡的影響

2.5LINC00958靶向調控miR-597-5p的表達 LncBase Predicted v.2預測出LINC00958與miR-597-5p含有互補的核苷酸序列，見圖4。miR-597-5p組比miR-NC組顯著降低WT-LINC00958熒光素酶活性(P<0.05)，miR-597-5p組與miR-NC組MUT-LINC00958熒光素酶活性無顯著變化(P>0.05)，見表4。pcDNA-LINC00958組miR-597-5p表達水平(0.42±0.04)顯著低于pcDNA組(1.00±0.05，P<0.05)，si-LINC00958組miR-597-5p表達水平(3.07±0.28)顯著高于si-NC組(1.03±0.07，P<0.05)。

圖4 LINC00958的序列中含有與miR-597-5p互補的核苷酸序列

表4 雙熒光素酶報告實驗

2.6miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響 與miR-NC組比較，miR-597-5p組MDA-MB-231細胞的miR-597-5p表達水平升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，細胞增殖降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數顯著減少(P<0.05)，凋亡率顯著增加(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平顯著降低(P<0.05)，Bax表達水平顯著升高(P<0.05)。見圖5、表5、圖6。

圖5 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達

表5 miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的影響

圖6 miR-597-5p過表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和凋亡的影響(結晶紫染色，×400)及細胞凋亡流式圖

2.7干擾miR-597-5p表達逆轉了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用 與si-LINC00958+anti-miR-NC組比較，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組MDA-MB-231細胞的miR-597-5p表達水平顯著降低(P<0.05)，細胞增殖顯著升高(P<0.05)，遷移、侵襲細胞數顯著增加(P<0.05)，凋亡率顯著減少(P<0.05)，Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達水平顯著升高(P<0.05)，Bax表達水平顯著降低(P<0.05)。見表6、圖7、圖8。

表6 干擾miR-597-5p表達逆轉了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用

圖7 干擾miR-597-5p表達逆轉了抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞遷移、侵襲和凋亡的作用(結晶紫染色，×400)及細胞凋亡流式圖

1～2：si-LINC00958+anti-miR-NC組，si-LINC00958+anti-miR-597-5p組圖8 增殖、遷移侵襲和凋亡相關蛋白表達

3 討 論

缺乏特異性的診斷和預后生物標志物可能導致乳腺癌患者的低生存率。研究表明，lncRNA在許多生物學過程中都起重要作用，而ceRNA活性與癌癥的發(fā)展密切相關〔8〕。lncRNA的頻繁失調與許多細胞過程和腫瘤的發(fā)病機制有關。從機制上講，lncRNA的異常表達通過調節(jié)轉錄、多個靶標和途徑而參與癌細胞的功能紊亂和許多分子過程，從而引起腫瘤的發(fā)生〔9〕。有學者提出LINC00958是與多種癌癥的發(fā)生和發(fā)展有關的致癌lncRNA〔10，11〕。LINC00958在頭頸部鱗狀細胞癌組織和細胞系中表達上調，其上調與腫瘤分化，晚期腫瘤分期和患者總體生存期縮短有關。在體外，LINC00958表達誘導頭頸部鱗狀細胞癌細胞活力和集落形成〔12〕。LINC00958在子宮頸癌組織和細胞中升高，LINC00958通過負調節(jié)miR-625-5p的表達，促進子宮頸癌細胞增殖和轉移〔13〕。LINC00958在鼻咽癌組織標本和細胞系中上調，LINC00958過表達與鼻咽癌患者的腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)、TNM分期和較差的總體生存率顯著相關。而LINC00958下調抑制了鼻咽癌細胞增殖、遷移和侵襲，并在體外誘導了細胞凋亡〔14〕。由此可見，LINC00958在多種癌癥中起著癌基因的作用。本研究結果提示LINC00958在乳腺癌中同樣作為致癌lncRNA，在乳腺癌MDA-MB-231細胞惡性表型中發(fā)揮關鍵作用。

miRNA異常表達參與了人類惡性腫瘤的發(fā)生，進展、轉移和耐藥性，已經成為乳腺腫瘤中基因表達的重要調節(jié)劑〔15〕。研究〔16，17〕報道m(xù)iR-597-5p在結直腸癌、胰腺癌組織和細胞中表達下調，研究〔16〕顯示，miR-597-5p可抑制結直腸癌細胞的遷移和侵襲。miR-597-5p可以減弱胰腺癌細胞的活力、菌落形成、侵襲，并降低Ki67、Bcl-2的表達，同時增加了胰腺癌細胞的凋亡及Bax的表達〔17〕。本研究結果表明，miR-597-5p過表達使乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲能力顯著降低，細胞凋亡則顯著升高，并且Ki-67、MMP-2、MMP-9、Bcl-2表達被抑制，Bax表達被促進，與前人研究〔17〕相吻合。

研究證實，lncRNA可以充當ceRNA，競爭性地靶向miRNA并調節(jié)miRNA的功能〔18，19〕。類似的，胰腺癌中的LINC00958可以作為ceRNA競爭性結合miR-330-5p〔20〕。LINC00958可與miR-5095結合通過核糖核苷酸還的酶亞單位(RR)M2來調節(jié)宮頸癌對放射療法的細胞敏感性〔21〕。LINC00958通過靶向miR-378a-3p上調類胰島素生長因子(IGF)1R促進膀胱癌細胞的增殖和轉移〔22〕。本研究結果證實LINC00958可以靶向結合miR-597-5p并調節(jié)miR-597-5p的功能。在功能上，LINC00958上調降低miR-597-5p的水平，LINC00958下調提高miR-597-5p的水平。干擾miR-597-5p表達后，抑制LINC00958表達對乳腺癌MDA-MB-231細胞增殖、遷移、侵襲和凋亡的作用被逆轉?？梢奓INC00958通過miR-597-5p調節(jié)了乳腺癌的發(fā)展。

綜上，LINC00958在乳腺癌組織中表達上調，抑制LINC00958表達可抑制乳腺癌MDA-MB-231細胞的增殖，遷移和侵襲，同時誘導凋亡，機制與靶向miR-597-5p有關。LINC00958對miR-597-5p的調控可能是乳腺癌中新的致癌調控機制。LINC00958和miR-597-5p可能成為用于預防乳腺癌患者的腫瘤進展和轉移的候選治療靶標。