透骨血竭散外敷對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠T細胞抗原受體通路中Lck、Fyn蛋白表達及滑膜細胞凋亡的影響

畢四麗，陳杜，姜如，鄧文雯，肖智

（長沙市第三醫(yī)院，湖南長沙 410000）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是臨床常見的以對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要特征的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、僵直、變形為主要臨床表現(xiàn)，發(fā)病率及致殘率較高[1]。本課題組前期研究表明，外敷透骨血竭散對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者治療可直接用于病灶處，能迅速緩解關(guān)節(jié)疼痛，減輕患者痛苦，改善癥狀[2-3]，其機制與抑制白細胞介素（IL）-6及腫瘤壞死因子（TNF）-α表達進而減輕炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫有關(guān)[4]，但具體作用機制尚不完全清楚。RA的病情進展體現(xiàn)了炎癥、自身免疫和滑膜增生這3種病理生理過程[5]。相關(guān)研究表明，T細胞在RA發(fā)生發(fā)展中起核心作用。T細胞是獲得性免疫系統(tǒng)中的主要功能細胞，T細胞抗原受體（T cell receptor，TCR）是T細胞表面關(guān)鍵的受體分子，可特異性地識別各種多肽抗原并通過胞內(nèi)區(qū)免疫酪氨酸受體激活基序（ITAM）磷酸化傳遞抗原刺激信號，進而引發(fā)T細胞的免疫效應(yīng)，其中以Src激酶（Lck、Fyn）所主導(dǎo)的蛋白磷酸化在跨膜信號傳遞及激活T細胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用[6]。又有研究表明，RA的關(guān)節(jié)軟骨和骨組織損害，與滑膜細胞的過度增生活化及凋亡不足密切相關(guān)[7]。因此，本研究通過建立RA大鼠模型，觀察透骨血竭散外敷對RA大鼠TCR通路Lck、Fyn表達及滑膜細胞凋亡的影響，探討透骨血竭散對RA大鼠關(guān)節(jié)的保護作用，以期為其臨床應(yīng)用治療RA提供實驗基礎(chǔ)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物取50只SPF級成年雄性SD大鼠，體質(zhì)量200～250 g，鼠齡4～5周，購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SYXK（粵）2019-0020。動物實驗的實施嚴格遵照《實驗動物護理和使用指南》。所有實驗動物于開始實驗前，適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周。

1.2 藥物、試劑與儀器透骨血竭散由透骨草10 g、桂枝10 g、青風(fēng)藤9 g、白芥子6 g、補骨脂10 g、土鱉蟲6 g、當歸10 g、艾葉10 g、白芍6 g、血竭6 g、紅花6 g、忍冬藤10 g等組成，所有中藥材均購自廣州福東海藥業(yè)；扶他林軟膏（雙氯芬酸二乙胺乳膏劑，北京諾華制藥有限公司生產(chǎn)，批號：H19990291）。弗氏完全佐劑（FCA，美國Sigma公司）；Lck抗體、Fyn抗體[（艾比瑪特醫(yī)藥科技有限公司（上海）]；Bax抗體、Bcl-2抗體（碧云天生物技術(shù)有限公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記親和純化山羊抗人IgG二抗、蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（上海莼試生物有限公司）。JY-YLS-7C足容積測量儀（北京金洋萬達科技有限公司）；光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）；蛋白電泳儀（北京六一儀器）。

1.3 分組與造模將44只大鼠按照隨機數(shù)字表分為假手術(shù)組、模型組、透骨血竭散組及扶他林組，每組11只。除假手術(shù)組外，其他各組大鼠均參考文獻方法[8]構(gòu)建RA模型：將大鼠固定，1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，用1 mL注射器在大鼠左足足墊皮下朝向踝關(guān)節(jié)方向注射0.1 mL弗氏完全佐劑。假手術(shù)組給予等體積0.9%氯化鈉溶液同法注射。造模后2 h出現(xiàn)左側(cè)足趾到踝部的急性炎癥腫脹，造模后3 d左右出現(xiàn)左側(cè)踝關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹和顏色改變，對側(cè)肢體或者前肢、耳、尾部發(fā)生紅腫或者出現(xiàn)炎癥結(jié)節(jié)，提示造模成功。

1.4 干預(yù)方法建模成功后，次日透骨血竭散組大鼠于左后足足跖部及踝關(guān)節(jié)外敷透骨血竭散（取藥物研磨成末，清水調(diào)制成糊狀）10 g·kg-1·d-1，扶他林組相同部位外敷扶他林軟膏（0.4 g·kg-1·d-1），模型組、假手術(shù)組相同部位外敷空白凝膠膏劑（明膠32 g、聚丙烯酸鈉5g、羧甲基纖維素鈉2 g、聚乙烯吡咯烷酮5 g、甘油120 g、水140 mL），每日1次，每次4 h，連續(xù)給藥21 d。干預(yù)過程觀察并防止大鼠舔舐藥物。

1.5 觀察指標與方法

1.5.1 繼發(fā)側(cè)足爪腫脹度[9]建模前及建模后第1天及治療后第7、14、21天分別應(yīng)用足容積測量儀測量大鼠左后足的腫脹體積（踝關(guān)節(jié)以下）、繼發(fā)側(cè)足腫脹度（△V）?！鱒=致炎后的足體積-致炎前的足體積。

1.5.2 HE染色法觀察踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)及炎癥細胞浸潤評分 末次治療1 h后，采用頸部脫臼法處死大鼠，取踝關(guān)節(jié)置于10%甲醛溶液中固定，縱向切成2部分，放入脫鈣劑中脫鈣，后石蠟包埋切片4μm，低溫保存。踝關(guān)節(jié)石蠟切片采用二甲苯脫蠟后按照100%-95%-85%及75%乙醇進行逐層脫水，蘇木素染色10 min，鹽酸（1%）處理，伊紅復(fù)染，100%-95%-85%及75%乙醇脫水，封片后光學(xué)顯微鏡下觀察組織形態(tài)。炎癥細胞浸潤評分標準[10]：無，計0分；輕度炎癥，可見少量白細胞浸潤，計1分；中度炎癥，可見2個或以上的白細胞聚集物，計2分；重度炎癥，出現(xiàn)白細胞融合及浸潤顯著，計3分。

1.5.3 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶（TdT）介導(dǎo)的dUTP缺口末端標記（TUNEL）法觀察踝關(guān)節(jié)滑膜細胞凋亡 踝關(guān)節(jié)滑膜切片逐層乙醇脫水，PBS沖洗3次，每次5 min，放入20μg/mL蛋白酶K溶液，23℃孵育30 min；PBS沖洗后，放入3%H2O2孵育15 min；PBS沖洗，擦片后放入50μL TUNEL反應(yīng)液，37℃孵育60 min；PBS沖洗，加入50μL轉(zhuǎn)化劑POD，DAB顯色，蘇木素進行復(fù)染3 min，0.2%氨水返藍，逐層乙醇脫水，最后二甲苯透明、樹脂封片。激光共聚焦顯微鏡下觀察非凋亡細胞呈現(xiàn)藍色，凋亡細胞呈棕黃色，每張切片選擇5個非重疊視野，計算滑膜細胞凋亡率?；ぜ毎蛲雎?凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達 取踝關(guān)節(jié)組織用PBS沖洗后切碎，加入1 mL細胞裂解液，以10 000 g、4℃離心5 min；取上清液，用二喹啉甲酸（BCA）法測總蛋白濃度。每孔上樣蛋白20μg，十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰氨凝膠電泳（PAGE）后于100 mA恒流下進行轉(zhuǎn)膜，TBST洗膜3次，用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗Lck（1∶500稀釋）、Fyn（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜。第2天，TBST洗膜3次，加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫孵育2 h，TBST洗膜3次，采用化學(xué)發(fā)光（ECL）法顯影，使用ImageJ軟件分析蛋白灰度值，計算目的蛋白與內(nèi)參GADPH的灰度值比值。

1.5.5 免疫組織化學(xué)法檢測踝關(guān)節(jié)滑膜組織中Bax、Bcl-2陽性表達 取踝關(guān)節(jié)滑膜組織切片，二甲苯脫蠟，經(jīng)梯度乙醇脫水、抗原修復(fù)后，滴加5%牛血清白蛋白（BSA）封閉20 min。加入Bax抗體（1∶500稀釋）、Bcl-2（1∶700稀釋）抗體室溫孵育1 h，加入HRP標記親和純化山羊抗人IgG二抗（1∶2 500稀釋）37℃孵育20 min，滴加SABC 25℃孵育20 min，上述每次孵育后均用PBS沖洗。加3，3’-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色后，蒸餾水洗滌，蘇木素復(fù)染5 min，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片、晾干。200倍光學(xué)顯微鏡下，隨機選擇不重疊的5個視野，采用IPP 6.0圖像分析系統(tǒng)計數(shù)陽性著色細胞百分比（Bax在細胞漿中呈現(xiàn)陽性棕黃色表達，Bcl-2在細胞膜中呈現(xiàn)陽性棕黃色表達），取平均值。

1.6 統(tǒng)計方法采用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠足爪腫脹度比較表1結(jié)果顯示：建模前，各組大鼠足爪腫脹度比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。建模后第1天，與假手術(shù)組比較，其他各組大鼠足爪腫脹度均增加（P＜0.05）。治療后第7、14、21天，與假手術(shù)組比較，模型組足爪腫脹度增加；與模型組比較，透骨血竭散組及扶他林組大鼠足爪腫脹度降低，透骨血竭散組更低（P＜0.05）。

表1 各組大鼠足爪腫脹度比較Table 1 Comparison of rat paw swelling degree among various groups （±s，%）

表1 各組大鼠足爪腫脹度比較Table 1 Comparison of rat paw swelling degree among various groups （±s，%）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與扶他林組比較

組別假手術(shù)組模型組透骨血竭散組扶他林組F值P值鼠數(shù)/只11 11 11 11建模前1.60±0.10 1.55±0.21 1.59±0.14 1.62±0.12 0.332 0.855建模后第1天1.65±0.08 52.25±8.51①53.06±7.65①52.69±8.06①146.200＜0.001治療第7天1.62±0.11 52.41±7.58①46.62±6.58①②③49.25±7.04①②168.900＜0.001治療第14天1.65±0.12 53.06±8.04①43.24±5.96①②③46.39±6.03①②175.200＜0.001治療第21天1.61±0.09 61.20±8.55①36.55±4.55①②③40.28±5.29①②220.600＜0.001

2.2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)及炎癥細胞浸潤評分比較圖1結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜上皮細胞排列整齊；模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜上皮增生明顯，炎癥細胞浸潤并存在間質(zhì)水腫，關(guān)節(jié)軟骨層破壞嚴重，并形成血管翳；透骨血竭散組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞紊亂改善，間質(zhì)水腫緩解，僅存在少量炎癥細胞；扶他林組踝關(guān)節(jié)滑膜上皮增生緩解，但仍有部分炎癥細胞浸潤。

圖1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)比較（HE染色，×200）Figure1 Comparison of histopathological morphology of rat ankle tissue among various groups（by HE staining，×200）

圖2結(jié)果顯示：假手術(shù)組、模型組、透骨血竭散組及扶他林組的炎癥細胞浸潤評分分別為（0.00±0.00）、（2.25±0.31）、（1.06±0.18）及（1.36±0.26）分。進一步比較，模型組炎癥細胞浸潤評分高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組比較，透骨血竭散組及扶他林組的炎癥細胞浸潤評分均降低（P＜0.05）；與扶他林組比較，透骨血竭散組大鼠炎癥細胞浸潤評分更低（P＜0.05）。

圖2 各組大鼠炎癥細胞浸潤評分比較Figure 2 Comparison of inflammatory cell infiltration score of rats among various groups（±s）

2.3 各組大鼠滑膜細胞凋亡率比較圖3、圖4結(jié)果顯示，假手術(shù)組、模型組、透骨血竭散組及扶他林組的滑膜細胞凋亡率分別為（2.34±0.20）%、（1.66±0.17）%、（15.40±2.40）%及（12.41±1.74）%。進一步比較，與模型組比較，透骨血竭散組及扶他林組的滑膜細胞凋亡率均升高（P＜0.05）；與扶他林組比較，透骨血竭散組大鼠滑膜細胞凋亡率更高（P＜0.05）。

圖3 各組大鼠滑膜細胞凋亡情況（TUNEL法，×200）Figure 3 Apoptosis of synovial cells in various groups of rats（by TUNEL method，×200）

圖4 各組大鼠滑膜細胞凋亡率比較（±s）Figure 4 Comparison of apoptosis rate of rat synovial cells among various groups（±s）

2.4 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達比較表2、圖5結(jié)果顯示：模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達水平高于假手術(shù)組（P＜0.05）；與模型組比較，透骨血竭散組及扶他林組的踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達水平均降低（P＜0.05）；與扶他林組比較，透骨血竭散組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達水平更低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達比較Table 2 Comparison of protein expression of Lck and Fyn in rat ankle tissue among various groups（±s）

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白表達比較Table 2 Comparison of protein expression of Lck and Fyn in rat ankle tissue among various groups（±s）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與扶他林組比較

組別假手術(shù)組模型組透骨血竭散組扶他林組F值P值鼠數(shù)/只11 11 11 11 Lck蛋白相對表達量0.47±0.08 1.55±0.14①0.69±0.11①②③0.80±0.10①②201.100＜0.001 Fyn蛋白相對表達量0.36±0.06 0.95±0.09①0.62±0.12①②③0.71±0.14①②57.190＜0.001

圖5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn蛋白電泳圖Figure 5 Electrophoretogram of protein Lck and Fyn in ankle tissue in various groups of rats

2.5 各組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax、Bcl-2陽性細胞表達比較表3、圖6結(jié)果顯示：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax陽性細胞比率降低，Bcl-2陽性細胞比率升高（均P＜0.05）；與模型組比較，透骨血竭散組及扶他林組的踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax陽性細胞比率升高，Bcl-2陽性細胞比率降低（均P＜0.05）；與扶他林組比較，透骨血竭散組大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax陽性細胞比率升高，Bcl-2陽性細胞比率降低（均P＜0.05）。

表3 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax、Bcl-2陽性細胞比率比較Table 3 Comparison of the ratio of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle among various groups （±s，%）

表3 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax、Bcl-2陽性細胞比率比較Table 3 Comparison of the ratio of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle among various groups （±s，%）

①P＜0.05，與假手術(shù)組比較；②P＜0.05，與模型組比較；③P＜0.05，與扶他林組比較

組別假手術(shù)組模型組透骨血竭散組扶他林組F值P值鼠數(shù)/只11 11 11 11 Bax陽性細胞比率22.30±2.36 5.69±0.41①17.43±1.73①②③14.28±1.44①②198.700＜0.001 Bcl-2陽性細胞比率3.51±0.25 19.55±2.66①10.22±1.14①②③12.05±1.30①②188.900＜0.001

圖6 各組踝關(guān)節(jié)滑膜組織Bax、Bcl-2陽性細胞分布情況（免疫組織化學(xué)法，×200）Figure 6 Distribution of Bax and Bcl-2 positive cells in rat synovial tissue of ankle joint in various groups（by immunohistochemistry，×200）

3 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）歸屬于中醫(yī)學(xué)“骨痹”的范疇，《濟生方·痹》認為RA“皆因體虛，腠理空虛，感受風(fēng)寒濕氣而成痹也”。透骨血竭散具有祛風(fēng)、活血、舒筋通絡(luò)的功效，本研究結(jié)果表明，透骨血竭散外敷可減輕RA大鼠足爪腫脹、踝關(guān)節(jié)病理損傷及炎癥細胞浸潤。關(guān)節(jié)滑膜細胞增殖、大量粒細胞及巨噬細胞浸潤可加劇關(guān)節(jié)破壞、畸形，增加關(guān)節(jié)能力喪失的發(fā)生風(fēng)險[10-11]。提示透骨血竭散外敷可有效改善RA，與前期研究結(jié)果[2-4]一致。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎最具有特征性的病理改變是滑膜炎和血管翳的形成。滑膜細胞增殖是RA發(fā)生發(fā)展的病理基礎(chǔ)，滑膜細胞異常增殖可促進血管翳形成，血管翳對關(guān)節(jié)軟骨及骨質(zhì)有較強的破壞作用，是RA患者關(guān)節(jié)畸形及功能障礙的主要原因[12]。因此，抑制滑膜細胞增殖，誘導(dǎo)滑膜細胞凋亡成為治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的主要策略之一?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax是調(diào)控細胞凋亡的重要因子。本研究結(jié)果顯示，透骨血竭散外敷后RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞凋亡率升高，踝關(guān)節(jié)滑膜組織促凋亡蛋白Bax表達增強，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明透骨血竭散外敷可有效促進RA大鼠踝關(guān)節(jié)滑膜細胞凋亡。

滑膜炎癥是RA的主要病理基礎(chǔ)。Lck、Fyn均為T淋巴細胞抗原受體（TCR）下游分子，在T細胞免疫應(yīng)答中均發(fā)揮信號傳遞作用，激活后可促進T細胞過度活化[13]。在RA發(fā)病過程中，Lck、Fyn可受絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、核轉(zhuǎn)錄因子kappaB（NF-κB）及Janus激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子（JAK/STAT）炎癥信號通路調(diào)控而加快RA疾病炎性反應(yīng)[14]。Lck主要表達于T細胞中，在TCR交聯(lián)后，Lck可磷酸化CD3+T細胞內(nèi)的免疫受體酪氨酸活化基序（ITAM），使下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路異常激活，促進白細胞介素2（IL-2）的釋放，最終引起炎癥反應(yīng)[15]。研究證實，F(xiàn)yn過表達可增強TCR刺激T細胞反應(yīng)，使酪氨酸磷酸化升高，Ca2+濃度增強，IL-2分泌增加，促進T細胞增殖，加重RA的滑膜炎癥反應(yīng)[13]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠踝關(guān)節(jié)組織中Lck、Fyn表達較正常組增強，透骨血竭散外敷組Lck、Fyn蛋白表達較模型組減弱，表明透骨血竭散外敷可通過抑制踝關(guān)節(jié)組織Lck、Fyn表達，改善RA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹。

綜上所述，透骨血竭散外敷可改善RA大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹，其機制可能與抑制TCR信號通路Lck、Fyn蛋白表達，抑制炎癥細胞浸潤，促滑膜細胞凋亡有關(guān)。