受控堆肥條件下可降解材料最終需氧生物分解能力測定的不確定度評定研究

林健輝，盧嘉慧，吳欣穎，范雪瀅，鄧桂榮，高 亮，梅承芳，楊永剛

（廣東省科學(xué)院微生物研究所，廣東省微生物分析檢測中心，華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室，廣東省菌種保藏與應(yīng)用重點實驗室，廣州 510070）

0 前言

目前，全球范圍內(nèi)對可降解塑料的關(guān)注越來越廣泛，各國紛紛制定了有利于推廣降解塑料的政策[1]，以促進生物可降解塑料的研究開發(fā)。2021年9月，國家發(fā)展改革委和生態(tài)環(huán)境部印發(fā)“十四五”塑料污染治理行動方案的通知，其中要求科學(xué)穩(wěn)妥推廣塑料替代品，開展不同類型可降解塑料降解及影響研究，科學(xué)評估其環(huán)境安全性和可控性[2]。對于可降解塑料的降解性能測試，包括需氧生物分解試驗、厭氧生物分解試驗、崩解性能試驗等，目前已有完善的測試標準體系與評價體系。而對于可降解塑料的出口，國內(nèi)產(chǎn)品的降解性能在滿足國內(nèi)外標準要求的同時，還需要滿足國外相關(guān)產(chǎn)品認證的要求，如歐盟的“Seeding”認證和“OK compost”認證、美國的“BPI”認證、日本的“Greenpla”認證等。對于各國不同的認證體系，為保證測試結(jié)果具有等效性，以避免不必要的重復(fù)檢測，需要在提供測試結(jié)果的同時，附上測試結(jié)果的不確定度范圍。

不確定度用于描述測量結(jié)果時，其含義為定量表示測量結(jié)果的不確定程度。1993年，由國際標準化組織（ISO）出版發(fā)行了《測量不確定度表示指南》（Guide to the expression of uncertainty in measurement，簡稱GUM），并于1995年及2008年發(fā)布了GUM的修訂版。GUM的約定規(guī)則使不同國家、不同地區(qū)、不同學(xué)科和不同領(lǐng)域，在表示測量結(jié)果及其不確定度時具有一致的含義。通過規(guī)范和統(tǒng)一測量不確定度評定與表示方法，促進了各國測量結(jié)果的可比性及互認，使不同實驗室對同一樣品的測量結(jié)果能夠進行有意義的比較，從而讓世界各地的用戶可以方便地判斷結(jié)果的等效性，避免不必要的重復(fù)檢測。

對于可降解塑料降解性能的不確定度評定，區(qū)別于傳統(tǒng)物理、化學(xué)指標的測試過程，塑料降解性能的測試由于涉及到微生物作用，因此需要較長的試驗周期。以測定可降解塑料的最終需氧生物分解能力為例，其試驗周期短則需要45天，最長可至6個月，由此導(dǎo)致塑料降解性能測試的不確定度的評定過程，較常規(guī)的物理、化學(xué)指標測試更復(fù)雜，而目前國內(nèi)也尚未有相關(guān)的文獻可供參考。本研究以塑料最終需氧生物分解能力試驗為例，依據(jù)實驗室開展相關(guān)試驗的實際數(shù)據(jù)，開展測量不確定度評定，通過計算各不確定度分量的大小，并根據(jù)各分量的合成方法，對其進行歸一化及可視化處理，從而確定試驗過程中主要的不確定度分量，明確可降解塑料需氧生物分解能力測試過程的關(guān)鍵影響因素，并對如何簡化其標準不確定度的計算開展研究，同時也為試驗周期較長的塑料降解性能測試項目如何開展不確定度評估提供思路。

1 實驗部分

1.1 主要原料

微晶纖維素，薄層色譜用TLC，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

接種物，肥齡2～5個月，自制。

1.2 主要設(shè)備及儀器

電熱恒溫鼓風干燥箱，DHG-9076A，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

電子天平，MS205DU，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；

電子天平，YP50001，上海力辰邦西儀器科技有限公司；

數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-12，常州澳華儀器有限公司；

數(shù)顯滴定儀，Titrette，德國BRAND公司；

總有機碳分析儀，TOC-L，島津企業(yè)管理（中國）有限公司。

1.3 樣品制備

試驗材料經(jīng)液氮低溫研磨后，過0.25 mm篩備用。

1.4 性能測試與結(jié)構(gòu)表征

依據(jù)GB/T 19277.1—2011《受控堆肥條件下材料最終需氧生物分解能力的測定采用測定釋放的二氧化碳的方法第1部分：通用方法》[3]測定可降解塑料的最終需氧生物分解能力。

將接種物與制備好的試驗材料（或參比材料）以總干固體約6∶1的比例稱量至試驗容器中并混合均勻，置于（58±1）℃的水浴鍋中培養(yǎng)。在試驗容器中通入除二氧化碳（CO2）空氣，并用氫氧化鈉吸收液吸收試驗容器中產(chǎn)生的二氧化碳。試驗開始的前45 d，每天測定一次CO2產(chǎn)量，45 d后，每3 d測定一次CO2產(chǎn)量直至試驗結(jié)束。將試驗周期內(nèi)試驗材料組（或參比材料組）的累積CO2產(chǎn)量扣除空白對照的累積CO2產(chǎn)量，計算得到試驗材料（或參比材料）的需氧生物分解率。

2 不確定度的數(shù)學(xué)模型

試驗材料的Dt由式（1）計算得到：

式中Rc——每個含有試驗混合物的堆肥容器累計放出的CO2量，g

Rc-B——空白容器累計放出的CO2量，g

Rt——試驗材料產(chǎn)生的CO2理論釋放量，g

根據(jù)試驗材料的Dt計算公式，可知其主要的不確定度分量為Rt、Rc和Rc-B。對于試驗過程中其他影響因素，如通氣的氣體流速、培養(yǎng)溫度的變化及差異等，通過設(shè)置平行試驗，利用平行試驗的重復(fù)性計算其對不確定度產(chǎn)生的影響。

2.1 試驗材料產(chǎn)生的CO2理論釋放量Rt

Rt由式（2）計算得到：

式中MTOT——試驗開始時加入堆肥容器的試驗材料中的總干固體，MTOT=60 g

CTOT——試驗材料中總有機碳與總干固體的比，g/g

44——CO2的分子量（MCO2）

12——C的原子量（MC）

2.2 試驗材料組及空白試驗組的Rc和Rc-B

2.2.1 CO2產(chǎn)量（R）

為得到CO2的累計量Rc，首先需要測定一定時間內(nèi)的CO2產(chǎn)量（R），可由式（3）計算得到：

式中R——CO2產(chǎn)量，g

CHCl——鹽酸標準溶液的濃度，mol/L

V滴定——鹽酸標準溶液的滴定體積，mL

VNaOH-0——CO2吸收瓶中氫氧化鈉吸收液的體積，mL

VNaOH-1——滴定氫氧化鈉吸收液時，氫氧化鈉的取樣體積，mL

2.2.2 Rc和Rc-B

試驗材料組CO2的Rc和Rc-B可由式（4）計算得到：

式中Rc-i——試驗材料組第i次測得的CO2產(chǎn)生量，g

Rc-B-i——空白試驗組第i次測得的CO2產(chǎn)生量，g

n——試驗全程CO2測量的總次數(shù)

3 量化不確定度（u）來源

3.1 試驗材料產(chǎn)生的CO2理論釋放量（R）t的不確定度u（R）t

3.1.1 試驗材料干固體含量的不確定度u（Wdm）

試驗材料的干固體含量（Wdm，%）由式（6）計算得到：

式中m0——帶蓋容器的質(zhì)量，g

m1——帶蓋容器及試驗材料的總質(zhì)量，g

m2——帶蓋容器及烘干恒重后試驗材料的總質(zhì)量，g

m0、m1和m2均使用萬分之一分析天平稱量確定，其不確定度主要來自3個方面：（1）由天平稱量不準引入的不確定度，采用B類方法評定；（2）稱量重復(fù)性，采用A類方法評定；（3）天平的可讀性引入的不確定度，由于天平分辨力比天平最大允許誤差小一個數(shù)量級，可忽略不計。

（1）天平稱量引入的不確定度

分析天平的最大允許誤差為±0.5 mg，誤差區(qū)間半寬度a（m）=0.5 mg，按均勻分布，包含因子k(m)=，稱量時先在天平上鋪上稱量紙，調(diào)零后進行稱量，即每一次稱量過程包含兩次稱量，由此引起的標準不確定度為：

根據(jù)式（7～9），計算得到Wdm兩個平行雙樣測定結(jié)果的標準不確定度分別為u1=0.008 14%和u2=0.008 13%，則平行雙樣的平均值的標準不確定度為：

（2）稱量重復(fù)性引入的不確定度

稱量重復(fù)性引入的不確定度采用A類不確定度評定方法，通過極差法計算，Wdm平行雙樣測定結(jié)果的極差（R）為0.045 4%，fWdm重復(fù)性的標準不確定度u（fWdm重復(fù)性）為：

綜合天平稱量和稱量重復(fù)性引入的不確定度，試驗材料干固體含量Wdm的標準不確定度u（Wdm）及相對標準不確定度ure（lWdm）為：

3.1.2 試驗材料總干固體質(zhì)量的不確定度u（MTOT）

根據(jù)測得的干固體含量Wdm=99.5%，總干固體質(zhì)量MTOT=60 g，可計算得到需稱量的試驗材料的質(zhì)量M試驗材料為60.3 g。M試驗材料的稱量使用十分之一電子天平稱量確定，其不確定度來源同3.1.1小節(jié)。其中，十分之一電子天平的最大允許誤差為±0.5 g，區(qū)間半寬度a（M試驗材料）=0.5 g；而由于試驗材料采用準確稱量的方法，所以其標準偏差均為0.0 g，由此得到標準不確定度u（fM重復(fù)性）及相對標準不確定度ure（lfM重復(fù)性）均為零。

則總干固體MTOT的相對標準不確定度ure（lMTOT）及標準不確定度u（MTOT）為：

3.1.3 CTOT的不確定度u（CTOT）

試驗材料中總有機碳與總干固體的比（CTOT，g/g）由式（16）計算得到：

式中rTOC——試驗材料總有機碳含量，%

rTC——試驗材料中總碳含量，%

rTIC——試驗材料中總無機碳含量，%

試驗材料總有機碳含量的測定通過總有機碳分析儀測定，分別測定其總碳含量和總無機碳含量后，使用差減法計算得到，其標準不確定度u（rTOC）由u（rTC）和u（rTIC）合成得到?？偺技翱偀o機碳的不確定度分量主要包括標準曲線校準、樣品稱量及測量重復(fù)性所帶來的不確定度。綜上，u（CTOT）及各不確定度分量的計算詳見表1。

表1 試驗材料總有機碳含量測定各不確定度分量Tab.1 Uncertainty components of total organic carbon

3.1.4 CO2分子摩爾質(zhì)量(MCO2)與碳原子摩爾質(zhì)量（MC）的不確定度u（MCO）2和u（MC）

查2005年IPUCA發(fā)布的元素相對原子質(zhì)量表，碳（C）的相對原子質(zhì)量[Ar(C ) ]和標準不確定度值為12.017±0.008，氧（O）為15.999 4±0.000 3，u（1MCO）2與u（1MC）分別為：

根據(jù)Rt的計算式，MCO2與MC均修約至個位數(shù)，其數(shù)值修約間隔δ=1，則誤差區(qū)間半寬a=0.5；按均勻分布，由數(shù)值修約產(chǎn)生的標準不確定度為：

則MCO2的標準不確定度u(MCO2)及相對標準不確定度ure（lMCO2）為：

MC的標準不確定度u（MC）及相對標準不確定度ure（lMC）為：

3.1.5 試驗材料產(chǎn)生CO2理論釋放量的不確定度u（R）t

試驗材料的Rt=105.16 g，其相對合成標準不確定度ure（lRt）及標準不確定度u（R）t分別見式（24～25）。

3.2 CO2產(chǎn)量（試驗第1天-平行1）的測量不確定度u（R1-1）

3.2.1 鹽酸滴定體積的不確定度u（V滴定）

鹽酸滴定使用數(shù)顯滴定儀進行滴定，其不確定度主要來自3個方面：（1）由數(shù)顯滴定儀滴定不準引入的不確定度，采用B類方法評定；（2）溫度變化對液體體積的影響，采用B類方法評定；（3）滴定重復(fù)性如每次滴定時，對滴定終點的判斷造成的差異等，采用A類方法評定，包含在f試驗組重復(fù)性及f空白組重復(fù)性中，不再重復(fù)計算。

（1）數(shù)顯滴定儀引入的不確定度

數(shù)顯滴定儀的最大允許誤差依據(jù)儀器校準證書以及《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[4]，為±0.03 mL；按三角分布，其標準不確定度u（V滴定-s）為：

（2）滴定過程中溫度變化引入的不確定度

試驗第1天，3平行試驗中，平行1的V滴定-1=1.64 mL，實驗過程中溫度變化為±3℃，水體積膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃-1；按均勻分布，則溫度變化影響液體體積的不確定度u（V滴定-T）為：

綜合數(shù)顯滴定儀和滴定過程中溫度變化引入的不確定度，鹽酸標準溶液滴定體積V滴定的標準不確定度u（V滴定-1）及相對標準不確定度ure（lV滴定-1）分別為：

3.2.2 鹽酸標準溶液濃度的不確定度u（CHCl）

鹽酸標準溶液濃度的不確定度的計算參考《化學(xué)試劑 標準滴定溶液的制備》（GB/T 601—2002）附錄B[5]，主要的不確定度分量及標準不確定度u（CHC）l詳見表2。

表2 鹽酸標準溶液各不確定度分量Tab.2 Uncertainty components of hydrochloric acid standard solution

3.2.3 NaOH吸收液體積的不確定度u（VNaOH-0）

CO2吸收瓶中的NaOH吸收液用500 mL的量筒量取，每個CO2吸收瓶中含有VNaOH-0=400 mL NaOH吸收液。對于VNaOH-0的不確定度來源，可參考第3.2.1節(jié)計算，其中500 mL量出式量筒的容量允差依據(jù)《玻璃量具校準規(guī)程》（JJG 196—2006）[6]，為±5.0 mL。則NaOH吸收液體積VNaOH-0的標準不確定度u（VNaOH-0）及相對標準不確定度u（VNaOH-0）分別為：

3.2.4 NaOH吸收液取樣體積的不確定度u（VNaOH-1）

用10 mL移液槍從吸收瓶中移取氫氧化鈉吸收液VNaOH-1=5.00 mL。對于VNaOH-1的不確定度來源，可參考3.2.1小節(jié)，其中移液器的最大允許誤差依據(jù)儀器校準證書以及《移液器檢定規(guī)程》（JJG 646—2006）[4]，當移取體積為5.00 mL時，其最大允許誤差為±0.03 mL。則氫氧化鈉吸收液取樣體積VNaOH-1的標準不確定度u（VNaOH-1）及相對標準不確定度u（VNaOH-1）分別為：

3.2.5 CO2產(chǎn)量（試驗第1天-平行1）測量的不確定度u（R1-）1

試驗第1天，3平行試驗中，平行1的CO2產(chǎn)量R1-1=2.84 g/瓶，其相對合成標準不確定度ure（lR1-1）及標準不確定度u（R1-1）分別見式（34～35）。

3.3 CO2累計產(chǎn)量的不確定度u（Rc）及 u（Rc-B）

參考章節(jié)3.2，計算試驗過程1～90 d試驗材料組的標準不確定度及相對標準不確定度，則試驗材料組（平行1）CO2累積量的標準不確定度u（Rc-1）與相對標準不確定度urel（Rc-1）分別為：

同理可計算試驗材料組平行2及平行3的標準不確定度及相對標準不確定度，最后再計算得到CO2累積量平均值的標準不確定度及相對標準不確定度。

用同樣的方法，計算得到空白試驗組CO2累積量平均值的標準不確定度及相對標準不確定度。

根據(jù)試驗材料組及空白試驗組的平行結(jié)果，通過A類不確定度評定，分別計算f試驗組重復(fù)性及f空白組重復(fù)性的標準不確定度，由于平行測定的數(shù)據(jù)只有3組，即n=3＜10，實驗標準偏差有可能被嚴重低估，故引入安全因子h[7]，計算式為：

綜合考慮各不確定度分量，試驗材料組及空白試驗組的標準合成標準不確定度，詳見表3。

表3 CO2總產(chǎn)量的標準不確定度Tab.3 Uncertainty of the cumulative amount of CO2

3.4 合成標準不確定度uc（Dt）

試驗材料生物分解百分率的測定各分量的不確定度匯總?cè)绫?所示。其中，試驗材料的Dt、Dt的相對合成標準不確定度ucrel（Dt）及uc（Dt）分別為：

表4 試驗材料生物分解百分率的測定各分量的不確定度Tab.4 Uncertainty components of the percentage biodegradation

3.5 擴展不確定度及不確定度報告

擴展不確定度U（Dt）通過使用k=2計算得到：

根據(jù)GB/T 19277.1—2011規(guī)定的測量程序，試驗材料生物分解百分率Dt=（80.8±9.0）%（k=2）。

4 不確定度分量拆解的可視化及計算簡化

從不確定度的評定結(jié)果可見，影響生物分解百分率Dt的主要不確定度分量主要為試驗材料的CO2理論釋放量Rt，以及試驗材料和空白對照的CO2釋放量的差值Rc-Rc-B，其合成式為：

對于Rt，其不確定度分量又主要包括了試驗材料干固體含量MTOT、試驗材料的總有機碳與總干固體的比CTOT以及CO2分子量和碳原子的摩爾質(zhì)量；而Rc-Rc-B的不確定度分量則由Rc和Rc-B合成得到。因此，可根據(jù)文中各類不確定度分量的合成式通過數(shù)學(xué)運算帶入式（44）中，并進行歸一化處理，通過作圖即可清晰得到各不確定度分量在中的占比，如圖1所示。

圖1 Dt不確定度分量的拆解及其占比Fig.1 Proportion of uncertainty component of Dt

4.1 影響Dt的主要的不確定度分量

從圖1中可見，影響Dt的主要的不確定度分量來源于f試驗組重復(fù)性、f空白組重復(fù)性、C 原子量位數(shù)（MC）修約、fTC重復(fù)性和mTC，其中f試驗組重復(fù)性、f空白組重復(fù)性、fTC重復(fù)性均為A類不確定度評定，為試驗重復(fù)性的影響，要減少其帶來的不確定度，需從實驗室環(huán)境、人員，儀器等方面入手，通過減小平行樣間的精密度，來減小其對Dt的影響。

對于mTC，其來源于TOC測定時樣品的稱樣量，其不確定度由分析天平的最大允許誤差決定，同章節(jié)3.1.1，即：

由式（45）可見，除非更換更精密的分析天平，如十萬分之一天平，否則u（mTC）無法降低，但是對于mTC的相對標準不確定度，其計算式為：

則由上式可見，在u（mTC）不變的情況下，可以通過增加mTC，即樣品的稱樣量，來減小urel（mTC），從而最終減小Dt的不確定度。因此，應(yīng)在滿足標準曲線線性范圍的情況下，應(yīng)盡可能增加樣品的稱樣量。

對于MC位數(shù)修約的不確定度如章節(jié)3.1.4。因修約至整數(shù)位，即數(shù)值修約間隔δ為1，誤差區(qū)間的半寬a為0.5，其計算式為：

根據(jù)2005年IPUCA發(fā)布的元素相對原子質(zhì)量表可知，碳的相對原子質(zhì)量是12.017，則在計算Rt時，由原來的取值12改為取值12.017，則此時MC位數(shù)修約的不確定度u（2MC）=0，不再影響Dt的不確定度。

4.2 主要的不確定度分量的優(yōu)化

通過增加樣品稱樣量mTC（在滿足標準曲線線性范圍的情況下，將稱樣量由15.8 mg增加至40.0 mg），及修改Rt的計算式（取MC=12.017，MCO2=44.016），對測試過程進行優(yōu)化，重新計算Dt的標準不確定度，得到uc（Dt）從4.5%降低為3.5%，相對標準不確定度ucrel（Dt）從5.61×10-2降低至4.29×10-2，詳見表5。優(yōu)化后的Dt不確定度分量的拆解及占比詳見圖2。從圖2可見，通過實驗優(yōu)化，Dt的不確定度分量集中在f試驗組重復(fù)性、f空白組重復(fù)性和fTC重復(fù)性3項A類不確定度，其他的不確定度分量由于貢獻系數(shù)較小，如每天滴定CO2產(chǎn)量所產(chǎn)生的不確定度、鹽酸標準溶液的不確定度、干物質(zhì)含量的不確定度、實驗過程中所有天平稱量、液體量取等等步驟產(chǎn)生的不確定度等B類標準不確定度，均可忽略。

圖2 優(yōu)化后的Dt不確定度分量的拆解及其占比Fig.2 Proportion of uncertainty component of Dtafter optimization

表5 優(yōu)化前后的uc（Dt）與ucrel（Dt）Tab.5uc（Dt）and ucrel（Dt）before and after optimization

Dt簡化后的相對標準不確定度ucrel（Dt）的計算式為：

則其標準不確定度uc（Dt）為：

如表6所示，對比簡化前后的結(jié)果，簡化后的標準不確定度uc（Dt）為簡化前的91.4%，簡化后的相對標準不確定度ucrel（Dt）為簡化前的92.8%。由此可見，通過對Dt的標準不確定度分量進行拆解分析，并對部分較大的不確定度分量通過實驗程序優(yōu)化后，僅僅只需通過3項A類標準不確定度評定，就能快速計算出Dt的標準不確定度，簡化計算后得到的結(jié)果包含了90%以上的經(jīng)過完整計算的uc（Dt）。

表6 簡化前后的uc（Dt）、ucrel（Dt）與Uc（Dt）Tab.6uc（Dt），ucrel（Dt）and U（Dt）before and after simplification

5 結(jié)論

（1）根據(jù)GB/T 19277.1—2011規(guī)定的測量程序，測得試驗材料Dt為80.8%，通過開展測量不確定度評定，得到其標準不確定度uc（Dt）為4.5%；通過拆解影響Dt的不確定度分量，根據(jù)各分量的合成方法，對其進行歸一化及可視化處理，得到Dt的主要不確定度分量來源于f試驗組重復(fù)性、f空白組重復(fù)性、MC位數(shù)修約、fTC重復(fù)性和mTC；通過增加樣品稱樣量mTC及修改Rt的計算式，對測試過程進行優(yōu)化，優(yōu)化后的uc（Dt）從4.5%下降到3.5%；

（2）經(jīng)過優(yōu)化，Dt的不確定度分量主要集中在f試驗組重復(fù)性、f空白組重復(fù)性和fTC重復(fù)性3項A類不確定度，其不確定度評定公式可相應(yīng)的進行簡化，簡化后計算得到的結(jié)果uc（Dt）=3.2%，為簡化前結(jié)果的91.4%，在保證不確定度準確性的前提下，大大簡化了不確定度的計算過程。