超分辨熒光顯微成像染料結(jié)構(gòu)與生物應(yīng)用（特邀）

李林，張鐸騰，渠允薇

（廈門大學(xué) 柔性電子（未來(lái)技術(shù)）研究院，福建 廈門361005）

0 引言

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)病理學(xué)的研究更加精細(xì)。準(zhǔn)確解析細(xì)胞/亞細(xì)胞器水平生理變化，對(duì)理解疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。因此，細(xì)胞中的特定位點(diǎn)的檢測(cè)/監(jiān)測(cè)對(duì)于生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展具有重要意義［1］。

基于生物醫(yī)學(xué)成像的要求，研究者開發(fā)出了多種成像技術(shù)，如正電子發(fā)射型斷層掃描技術(shù)（Positron Emission Computed Tomography，PET）、磁共振成像技術(shù)（Magnetic Resonance Imaging，MRI）、透射電子顯微技術(shù)（Transmission Electron Microscopy，TEM）、熒光顯微成像技術(shù)（Fluorescence Microscopy，F(xiàn)M）等。其中熒光成像技術(shù)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)：通過(guò)采集光信號(hào)獲得圖像，對(duì)細(xì)胞的毒性較小，可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞的實(shí)時(shí)成像，通過(guò)不同熒光波段的染料染色，實(shí)現(xiàn)多色成像等［2］。這些優(yōu)勢(shì)使得熒光顯微鏡在生物學(xué)的研究中有著舉足輕重的地位［3］。

自從1853年STOKES G G 首次提出熒光的概念，熒光技術(shù)的發(fā)展突飛猛進(jìn)（圖1）。1911年，隨著第一臺(tái)熒光顯微鏡的問(wèn)世，熒光染料與熒光顯微鏡開始相互配合，成為研究細(xì)胞、活體生理活動(dòng)的強(qiáng)大工具。1981年，CREMER C 和CREMER T 開發(fā)出第一臺(tái)實(shí)用的共聚焦熒光顯微鏡，大幅度提高了光學(xué)顯微鏡的分辨率［4］。但是受到光學(xué)衍射極限的制約，其極限分辨率一直無(wú)法突破200 nm［5］，無(wú)法精確觀測(cè)更細(xì)微的生物學(xué)信息，使其應(yīng)用受到了限制。為解決這一問(wèn)題，HELL S W（STED）［6］、GUSTAFSSON M G L（SIM）［7］、BETZIG E 和MOERNER W（PALM）［8］、莊小威（STORM）［9］等科學(xué)家采用不同的原理和方法，突破光學(xué)衍射極限，開發(fā)出了超分辨熒光顯微鏡（Super-resolution Fluorescence Microscopy，SRFM），極大的拓展了熒光顯微鏡在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。成像設(shè)備和技術(shù)的進(jìn)步同時(shí)也對(duì)熒光染料的開發(fā)提出了新的要求，設(shè)計(jì)適用于超分辨熒光顯微成像的熒光染料成為亟待解決的問(wèn)題。本文在介紹主要的超分辨熒光顯微成像技術(shù)原理的基礎(chǔ)上，針對(duì)不同技術(shù)對(duì)有機(jī)小分子染料的要求，歸納總結(jié)了目前報(bào)道的適用于不同超分辨熒光顯微技術(shù)的有機(jī)小分子熒光染料結(jié)構(gòu)和光物理性質(zhì)特點(diǎn)，同時(shí)展望了該領(lǐng)域的未來(lái)發(fā)展，旨在為超分辨熒光染料的設(shè)計(jì)提供思路。

圖1 熒光成像技術(shù)的發(fā)展Fig.1 Development of fluorescence imaging technology

1 超分辨熒光顯微技術(shù)概述

一個(gè)理想的點(diǎn)光源經(jīng)過(guò)物鏡后，會(huì)被投影成具有一定大小的光斑，這就是點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)（Point Spread Function，PSF）。因此物體上距離接近的兩個(gè)點(diǎn)，在經(jīng)過(guò)物鏡后，其PSF 會(huì)重疊，當(dāng)其中一個(gè)點(diǎn)的波函數(shù)的一級(jí)極大值與接近點(diǎn)的一級(jí)極小值重疊時(shí)，將無(wú)法分辨出這兩個(gè)點(diǎn)。傳統(tǒng)的熒光顯微鏡受到衍射極限的約束，其極限分辨率大約在200 nm。而細(xì)胞中的亞細(xì)胞器如線粒體、溶酶體以及細(xì)胞骨架等的直徑均小于這一數(shù)值［10］。因此，傳統(tǒng)的顯微技術(shù)無(wú)法獲得這些亞細(xì)胞單位的精確結(jié)構(gòu)。

為了突破衍射極限，化學(xué)和物理學(xué)領(lǐng)域的科學(xué)家聯(lián)合，基于不同的原理搭建了超分辨熒光顯微鏡，目前，應(yīng)用最為廣泛的主要有以下三類技術(shù)：1）基于激發(fā)態(tài)熒光受激損耗的受激輻射損耗熒光顯微技術(shù)（Stimulated Emission Depletion Microscopy，STED）；2）基于熒光分子開關(guān)效應(yīng)的單分子定位成像技術(shù)（Single-molecule Localization Super-resolution Microscopy，SMLM），主要包括光活化定位顯微技術(shù)（Photoactivated Localization Microscopy，PALM）和隨機(jī)熒光重構(gòu)顯微技術(shù)（Stochastic Optical Reconstruction Microscopy，STORM）；3）基于余弦結(jié)構(gòu)光調(diào)制高頻信號(hào)的結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Structure Illumination Microscopy，SIM）為與飽和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)區(qū)分稱為“線性SIM”。

1.1 超分辨熒光成像技術(shù)原理簡(jiǎn)介

1994年，德國(guó)科學(xué)家HELL S W 提出了在激發(fā)光斑的外圍，引入一束中心光強(qiáng)為零的環(huán)形損耗光，該過(guò)程如圖2（a）所示，通過(guò)相位調(diào)制作用，使損耗光在樣品上所成的光斑為中空模式，該損耗光的中心與激發(fā)光光斑中心重合。通過(guò)受激輻射的原理，使激發(fā)光斑外圍的熒光基團(tuán)發(fā)出與損耗光相干涉的熒光，通過(guò)二向色鏡濾波，僅保留中心的短波長(zhǎng)的熒光，從而達(dá)到縮小點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的目的，提高成像分辨率，這就是著名的STED 技術(shù)［6］。STED 能夠?qū)崿F(xiàn)超分辨成像的關(guān)鍵在于損耗光激發(fā)下，受激發(fā)射和自發(fā)熒光之間相互競(jìng)爭(zhēng)的非線性效應(yīng)。損耗光激發(fā)熒光團(tuán)后，不可避免的會(huì)產(chǎn)生自發(fā)輻射，隨著損耗光功率的增強(qiáng)，自發(fā)輻射逐漸被受激輻射取代，當(dāng)功率達(dá)到某一強(qiáng)度，絕大部分電子將以受激輻射的形式返回基態(tài)［11］。因此，STED 的分辨率與損耗光的光強(qiáng)相關(guān)，損耗光功率越高，分辨率越高。

1995年，BETZIG E 提出了利用單分子定位的方式突破衍射極限的想法［12］：通過(guò)降低熒光分子“開啟”的比例，限制同一時(shí)間發(fā)射光子的熒光分子數(shù)量，計(jì)算對(duì)應(yīng)熒光分子PSF 的中心位置，通過(guò)大量的成像和計(jì)算，將所有熒光團(tuán)的中心位置擬合在一張圖上，最終獲得超分辨的熒光成像（圖2（b））。2006年，BETZIG E借助一種可激活的變種綠色熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了該設(shè)想并獲得了20～30 nm 分辨率的成像，即PALM 技術(shù)［8］。同年，莊小威課題組采用類似原理，利用光調(diào)控有機(jī)小分子熒光染料對(duì)（Cy3-Cy5），開發(fā)出了STORM 技術(shù)［9］。基于對(duì)PSF 的定位精度，單分子定位成像往往需要數(shù)千幀的圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行重構(gòu)，以犧牲時(shí)間的方式來(lái)?yè)Q取高空間分辨率，成像速度受到了一定的限制。因此，在對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行觀測(cè)時(shí)，為了平衡成像時(shí)間和空間分辨率，需要增加激發(fā)光功率，提高采樣頻率，獲得超分辨熒光圖像［13］。

圖2 不同超分辨熒光成像技術(shù)的原理Fig.2 Principle of different super-resolution fluorescence imaging techniques

在空間頻域中，光學(xué)傳遞函數(shù)（Optical Transfer Function，OTF）是PSF 的傅里葉變換結(jié)果。顯微鏡收集到的頻譜，等于被觀察物體的頻譜與OTF 的卷積。因此，提高OTF，可以提升成像的分辨率。GUSTAFSSON M G L 在2000年發(fā)明的線性SIM 技術(shù)通過(guò)在激發(fā)光前加入一個(gè)光柵，將勻場(chǎng)照明光替換為余弦結(jié)構(gòu)光，通過(guò)余弦調(diào)制相位，將高頻信號(hào)調(diào)制到低頻信號(hào)中，通過(guò)旋轉(zhuǎn)光柵，可以得到各個(gè)方向的高頻頻譜，最后，通過(guò)電腦解析，得到包含有高頻信號(hào)的圖像（圖2（c））。利用線性SIM 技術(shù)，可以使物體的分辨率提高一倍，達(dá)到100 nm 左右［7］。2005年GUSTAFSSON M G L 在線性SIM 的基礎(chǔ)上，通過(guò)引入非線性光學(xué)，開發(fā)出具有更高分辨率的飽和結(jié)構(gòu)光照明技術(shù)（Saturated Structured Illumination Microscopy，SSIM，也稱為非線性SIM）［14］。

1.2 超分辨熒光染料的設(shè)計(jì)要求

通過(guò)對(duì)有機(jī)小分子染料進(jìn)行針對(duì)性的結(jié)構(gòu)修飾，可以提高其性能，使有機(jī)小分子染料滿足使用場(chǎng)景的需求。染料進(jìn)入細(xì)胞的能力稱為透膜能力，提高染料的透膜能力有助于改善染料的染色效果，降低染料的用量，減少非特異性標(biāo)記，從而提高成像的信噪比。由超分辨熒光顯微成像技術(shù)的原理可知，相較于傳統(tǒng)的共聚焦熒光顯微成像，超分辨熒光顯微成像需要對(duì)成像樣品進(jìn)行更多次數(shù)的掃描以收集足夠數(shù)量的光子，從而獲得更高分辨率的成像［15］。這一特點(diǎn)要求熒光染料具有更加優(yōu)異的光穩(wěn)定性和亮度［16］。同時(shí)，超分辨熒光顯微成像需要高功率的激發(fā)光源，這就需要降低染料的光毒性，避免對(duì)細(xì)胞的過(guò)度損傷。

針對(duì)不同的超分辨熒光顯微成像技術(shù)，有機(jī)小分子染料結(jié)構(gòu)特點(diǎn)有所不同。SMLM 技術(shù)需要限制同一時(shí)間熒光開啟的分子數(shù)量，因此要求熒光分子具有閃爍能力（STORM）或光激活能力（PALM）。針對(duì)STORM 成像，需要調(diào)控染料分子處于熒光態(tài)的比例，使每幀圖像獲得稀疏的熒光分子信號(hào)，并提升染料的抗光漂白能力，增加成像幀數(shù)，提升成像分辨率。而PALM 成像中，需要使染料在成像前處于暗態(tài)，降低染料的自發(fā)激活熒光，使染料可控釋放熒光，因此通常使用籠化策略來(lái)調(diào)控染料分子暗態(tài)與亮態(tài)的轉(zhuǎn)換并獲得適合的光活化量子效率。而用于STED 成像的染料分子，由于損耗光功率極高，因此，STED 成像要求染料具有優(yōu)異的抗光漂白能力，同時(shí)，需要避免損耗光對(duì)染料的二次激發(fā)，因此對(duì)染料光譜的調(diào)控十分重要。線性SIM 成像對(duì)于熒光染料沒(méi)有特殊要求，是目前活細(xì)胞成像中應(yīng)用最多的超分辨成像技術(shù)，而非線性SIM 的設(shè)計(jì)是基于熒光分子激發(fā)態(tài)飽和效應(yīng)，對(duì)分子設(shè)計(jì)有一定的要求，但目前應(yīng)用尚未普及，因此本文中不再贅述。此外，超分辨熒光顯微成像要求染料在成像時(shí)空窗口內(nèi)盡量減少擴(kuò)散，這需要將染料分子與靶向基團(tuán)結(jié)合，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行熒光標(biāo)記成像。

2 適用于STED 的有機(jī)小分子染料

2.1 對(duì)染料光穩(wěn)定性的調(diào)控

傳統(tǒng)羅丹明染料，如羅丹明B、羅丹明6G 等，具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率（Φ= 0.5～1），在生物成像中可以獲得較高的信噪比［17］。然而，較差的水溶性、低透膜能力使其容易自聚集并產(chǎn)生非特異性結(jié)合。同時(shí)，由于STED 成像要求極高的損耗光功率，傳統(tǒng)羅丹明染料的光穩(wěn)定性限制了其在超分辨熒光顯微成像中的應(yīng)用。HELL S W 課題組在羅丹明染料的4、5 號(hào)位修飾磺酸基團(tuán)（圖3，1-1，1-2，1-3），在改善羅丹明染料的水溶性和透膜能力的同時(shí)有效抑制了染料與蛋白質(zhì)結(jié)合后的熒光淬滅［18］，顯著提高高功率激光照射下染料的穩(wěn)定性。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)氨基偶聯(lián)反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞中微管的超分辨熒光成像。除此之外，還可以在羅丹明骨架上修飾羥基，以改善其水溶性和透膜能力，降低染料在細(xì)胞中的自聚集。然而，在烯丙基位置連接羥基的染料（R580），容易在高功率激光照射下發(fā)生光氧化，導(dǎo)致染料變質(zhì)。因此，研究者在非烯丙基和非芐基的位點(diǎn)引入羥基獲得了2-1（530RH）和2-2（575RH）等一系列染料（圖3），在提高了染料的水溶性和透膜能力的同時(shí)，有效提升了染料的穩(wěn)定性［19］，使其適用于STED 成像。

圖3 適用于STED 的有機(jī)小分子染料Fig.3 Small molecular organic dyes for STED

以開環(huán)內(nèi)鹽形式存在的羅丹明，其透膜能力低于閉環(huán)螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的羅丹明。同時(shí)，由于正電荷的存在，染料容易富集到線粒體，影響對(duì)細(xì)胞其他特定位點(diǎn)的定位能力。在羅丹明染料的2、3 號(hào)位引入吸電子基團(tuán)，誘導(dǎo)染料向螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)化是優(yōu)化染料透膜能力的一種有效方式。但是，這種方式常導(dǎo)致染料量子產(chǎn)率的降低。為了解決透膜能力和熒光量子產(chǎn)率之間的矛盾，JOHNSSON K 等報(bào)道了一種在改善染料透膜能力的同時(shí)保持高信噪比的策略（3 系列，圖3）［20］：將羅丹明中的羧基轉(zhuǎn)化為缺電子的酰胺，這一調(diào)整在不影響羅丹明的光譜特性和熒光量子產(chǎn)率的前提下，可調(diào)控羅丹明開環(huán)-閉環(huán)結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)平衡。在透膜時(shí)，染料以閉環(huán)形式存在，當(dāng)染料與目標(biāo)蛋白結(jié)合后，會(huì)向開環(huán)形式轉(zhuǎn)移，熒光增加1 000 倍。此系列染料分子覆蓋了500～700 nm 的可見(jiàn)光區(qū)波段，可以用于多色超分辨熒光顯微成像。

LAVIS L D 課題組［21］和肖義課題組［22］分別報(bào)道了對(duì)四甲基羅丹明中的N，N-二甲基氨基位點(diǎn)的衍生化修飾，抑制扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移（Twisted Intramolecular Charge Transfer，TICT）效應(yīng)來(lái)獲得具有高亮度和穩(wěn)定性的染料；河北大學(xué)高保祥教授等通過(guò)在苯環(huán)6 號(hào)位引入甲氧基的策略提升硅基羅丹明的亮度，同時(shí)由于兩個(gè)甲氧基的存在對(duì)羅丹明母體結(jié)構(gòu)9 號(hào)位具有空間位阻保護(hù)作用，提高了染料的穩(wěn)定性［23］。HELL S W 等在2019年發(fā)現(xiàn)，在激光照射染料樣品時(shí)，會(huì)發(fā)生光氧化導(dǎo)致羅丹明上的氮脫烷基化，進(jìn)而導(dǎo)致染料光譜的藍(lán)移。尤其在STED 成像中，使用的激光器功率高，為了避免光氧化，HELL S W 等設(shè)計(jì)開發(fā)了一系列三芳基甲烷取代的羅丹明4（圖3），可以在光照下保持穩(wěn)定，防止光譜藍(lán)移，有效提高染料的光穩(wěn)定性［24］。此類設(shè)計(jì)具有普適性，可以拓展到羅丹明衍生物中以提升染料的光穩(wěn)定性。

2.2 對(duì)熒光光譜的調(diào)控

對(duì)染料熒光光譜的調(diào)控是優(yōu)化染料成像性能的重要策略。在STED 成像中，損耗光功率過(guò)大引起的光毒性是活細(xì)胞成像中迫切需要解決的問(wèn)題。近紅外熒光染料在降低光損傷的同時(shí)，可以有效避免生物自發(fā)熒光的干擾，提高對(duì)生物樣本的穿透能力，受到了研究人員的廣泛關(guān)注。引入久洛尼定環(huán)（Julolidine rings）是一種促進(jìn)羅丹明分子光譜紅移的常用策略。在此基礎(chǔ)上，HELL S W 課題組在羅丹明C3 苯環(huán)上修飾吸電子的F 原子，進(jìn)一步促進(jìn)了羅丹明染料的光譜紅移（5 系列，圖3）［25］。其中，5-1（STAR635）通過(guò)引入烯丙基醇結(jié)構(gòu)，在不增加額外電荷的前提下提高了染料的水溶性和透膜能力。同時(shí)，5-1 通過(guò)增長(zhǎng)染料與氨基反應(yīng)基團(tuán)之間碳鏈的長(zhǎng)度，改善了其與目標(biāo)蛋白質(zhì)結(jié)合的反應(yīng)效率，成功地應(yīng)用于STED 成像。

通過(guò)將IV 族元素（C，Si，Ge 等）引入到氧雜蒽結(jié)構(gòu)中，可以調(diào)控羅丹明的激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)紅移至600 nm 以上，這是由于與IV 族原子連接的甲基的s-p 軌道和熒光團(tuán)的p 軌道之間的共軛穩(wěn)定了最低未占分子軌道能級(jí)（Lowest Unoccupied Molecular Orbit，LUMO）。2008年，肖義教授課題組報(bào)道了首個(gè)硅基羅丹明染料［26］。該染料在具有近紅外激發(fā)和發(fā)射能力的同時(shí)，具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性，適用于STED 成像。然而，硅基羅丹明的開環(huán)比率較低，在常規(guī)的生理緩沖溶液中容易以閉環(huán)形式存在。因此，需要對(duì)其修飾以更好的適用于STED 成像。JOHNSSON K 課題組發(fā)現(xiàn)，硅基羅丹明與極性蛋白質(zhì)分子結(jié)合后主要以開環(huán)形式存在，據(jù)此將硅基羅丹明與多西紫杉醇（與微管蛋白特異性結(jié)合）和去溴去甲基-賈斯普拉基內(nèi)酯（與肌動(dòng)蛋白特異性結(jié)合）連接，獲得了一系列性能優(yōu)異的新型染料（圖3）。當(dāng)6-1（SiR-tubulin）在體外與微管蛋白結(jié)合時(shí)，其熒光強(qiáng)度增強(qiáng)了10 倍以上；而6-2（SiR-actin）與肌動(dòng)蛋白結(jié)合后則顯示出100 倍以上的熒光增強(qiáng)。利用6-1 和6-2，成功實(shí)現(xiàn)了活細(xì)胞中微管與肌動(dòng)蛋白的超分辨熒光成像［27］?；诖嗽恚芯空呤褂肧iRHoechst 實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞核中DNA 的染色并進(jìn)行了超分辨熒光成像［28］。

為了進(jìn)一步得到長(zhǎng)波長(zhǎng)的超分辨熒光染料，HELL S W 課題組在硅基羅丹明的基礎(chǔ)上，連接了氟化苯環(huán)，在不影響熒光量子產(chǎn)率的前提下獲得了發(fā)射波長(zhǎng)在680 nm 的染料7-1 和7-2（圖3）。通過(guò)連接蛋白質(zhì)標(biāo)簽，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞骨架的精確定位，并且這兩個(gè)染料可以選擇800 nm 的損耗光，有效減少了損耗光對(duì)細(xì)胞的損傷［29］。

羅丹明染料（包括硅基羅丹明染料）的斯托克斯位移（Stocks shift）一般在20～40 nm 范圍內(nèi)，容易被損耗光二次激發(fā)，導(dǎo)致信號(hào)干擾。KLAN P 課題組以及WU L 和BURGESS K 課題組在前期的工作中提出：羅丹明的9 號(hào)位引入9-氨基吡喃酮支架是促進(jìn)羅丹明斯托克斯位移增加的有效方法［30，31］。基于此，HELL S W 課題組設(shè)計(jì)了C、Si、Ge 取代O 原子的新型羅丹明染料（8 系列，圖3），并獲得了超過(guò)100 nm 的斯托克斯位移（圖3），有效避免了損耗光對(duì)樣品的二次激發(fā)［32］。

除了羅丹明染料外，香豆素染料的分子結(jié)構(gòu)小，亮度高等特點(diǎn)也受到了研究者的關(guān)注。HELL S W 課題組設(shè)計(jì)了一系列大斯托克斯位移的香豆素類染料（9 系列，圖3）［33］。其中9-4 具有超過(guò)200 nm 的斯托克斯位移，并具有優(yōu)異的熒光量子產(chǎn)率。通過(guò)引入三氟甲基結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步提高了染料的光穩(wěn)定性，使其適用于STED 成像?；诓煌阁w結(jié)構(gòu)的超分辨熒光染料的開發(fā)，也為設(shè)計(jì)新型超分辨熒光探針（Fluorescent probe）提供了更多的染料選擇。

2.3 協(xié)同策略調(diào)控?zé)晒馊玖闲阅?/h3>

染料多種性能的共同提升對(duì)于新型染料的設(shè)計(jì)開發(fā)具有重要意義。然而亮度、光譜、穩(wěn)定性等性能的共同提升對(duì)染料的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)以及合成提出了很高的要求，通常難以實(shí)現(xiàn)。近期，袁林教授和王璐課題組合作報(bào)告一種協(xié)同策略，同時(shí)改善常規(guī)熒光團(tuán)的光穩(wěn)定性、亮度以及斯托克斯位移。研究者將具有調(diào)控電子密度的四氫吡嗪基團(tuán)引入到傳統(tǒng)的羅丹明中，合成了具有振動(dòng)結(jié)構(gòu)的不對(duì)稱羅丹明（9，圖3）。該策略可以增加染料激發(fā)態(tài)的振動(dòng)弛豫，并抑制了扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移的形成，提高了亮度和光穩(wěn)定性，同時(shí)增加了斯托克斯位移［34］。這種結(jié)合了抑制扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移和不對(duì)稱合成的協(xié)同策略為構(gòu)建更優(yōu)異的STED 染料提供了新的思路。

3 適用于SMLM 的有機(jī)小分子染料

目前，常用的SMLM 主要包括PALM 和STORM。PALM 技術(shù)最初是通過(guò)光活化的熒光蛋白（Fluorescent protein）實(shí)現(xiàn)的，但依賴基因編碼的技術(shù)缺陷限制了其應(yīng)用場(chǎng)景，后來(lái)逐步發(fā)展到可以通過(guò)有機(jī)小分子染料完成成像；而STORM 技術(shù)的實(shí)現(xiàn)，得益于莊小威以及SAEUR M，TINNIFILED P 等在2005年報(bào)道的Cy5 染料在暗態(tài)與亮態(tài)之間切換的光閃爍現(xiàn)象［35，36］。盡管使用Cy3-Cy5 分子對(duì)可以對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行單分子定位成像［37］，但仍需要借助氧化還原緩沖溶液，這在某種程度上限制了STORM 技術(shù)對(duì)活細(xì)胞中生理過(guò)程的監(jiān)測(cè)。光活化/光閃爍的超分辨熒光染料的匱乏和缺陷，促使研究者們著力于開發(fā)新的結(jié)構(gòu)體系的同時(shí)，不斷優(yōu)化其光物理性能。

3.1 光活化超分辨染料

羅丹明染料在開環(huán)-閉環(huán)狀態(tài)下具有高信噪比，同時(shí)，其高量子產(chǎn)率的特性使得這類染料在受激后可以輻射較多光子，滿足SMLM 成像的要求。因此，在羅丹明結(jié)構(gòu)上修飾適當(dāng)?shù)幕\化基團(tuán)，活化光調(diào)節(jié)羅丹明“off”到“on”的過(guò)程，可以實(shí)現(xiàn)PALM 成像（圖4）。早在1977年，KNAUER K H 和GLEITER R 就報(bào)道了羅丹明酰胺的光致變色反應(yīng)［38］。2007年，HELL S W 等通過(guò)將4-氨基鄰苯二甲酰亞胺作為芳基取代基對(duì)羅丹明B 進(jìn)行修飾，得到在紫外區(qū)有明顯吸收的光活化羅丹明熒光染料11（圖4）［39］。該染料分子具有極低的自發(fā)激活熒光比例（小于0.01%），在50 W·cm-2的紫外光（375 nm）光活化后，染料熒光增強(qiáng)，單個(gè)染料分子平均可以收集到900 個(gè)光子。利用該分子成功對(duì)微管蛋白進(jìn)行了超分辨熒光成像，同時(shí)，實(shí)現(xiàn)了U373MG 細(xì)胞表面的3D 成像。然而該染料通過(guò)紫外光光活化，同時(shí)染料分子的水溶性不理想，限制了其對(duì)活細(xì)胞的超分辨成像。因此，2014年，MOERNER J課題組基于染料11的思路，對(duì)羅內(nèi)酰胺的取代基進(jìn)行修飾，通過(guò)增加內(nèi)酰胺上烷烴取代物的共軛結(jié)構(gòu)和正電荷獲得更大的吸收波長(zhǎng)紅移的染料，并獲得了活化光波長(zhǎng)大于400 nm 的染料12-1 和12-2（圖4）［40］，該染料具有0.89%的光活化量子產(chǎn)率，可以利用更低功率（18 W·cm-2）的活化光活化，有效減少了應(yīng)用過(guò)程中紫外光對(duì)細(xì)胞的損傷。

圖4 適用于PALM 的有機(jī)小分子染料Fig.4 Small molecular organic dyes for PALM

基于光化學(xué)反應(yīng)的基團(tuán)也可以作為籠化基團(tuán)。MOERNER W E 課題組在2008年，開發(fā)出了疊氮基-二氰基亞甲基二呋喃［41］。在443 nm 的光照射下，不穩(wěn)定的疊氮結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為氨基，光活化量子產(chǎn)率為0.59%，分子內(nèi)的推拉電子結(jié)構(gòu)促使染料的熒光增強(qiáng)。通過(guò)結(jié)合HaloTag 蛋白標(biāo)簽，構(gòu)建了染料13（圖4），可以對(duì)活細(xì)胞中蛋白進(jìn)行標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)PALM 成像［42］。LAVIS L D 課題組在羅丹明螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中引入重氮結(jié)構(gòu)作為籠化單元，構(gòu)建了無(wú)色羅丹明，設(shè)計(jì)了染料14（圖4）［43］。重氮結(jié)構(gòu)作為籠化基團(tuán)的引入縮小了籠化基團(tuán)的分子大小，提高了羅丹明的透膜能力，同時(shí)使該染料具有了優(yōu)異的熒光激活率（83.5 s）和極低的自發(fā)激活熒光比例（10-6）。光活化后，羅丹明結(jié)構(gòu)由閉環(huán)向開環(huán)結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，釋放熒光。然而，該籠化基團(tuán)在光活化后會(huì)形成部分非熒光物質(zhì)，丟失部分信號(hào)。

氟硼二吡咯（BODIPY）染料同樣具有量子產(chǎn)率高，穩(wěn)定性好，生物相容性優(yōu)良的特點(diǎn)，因此，通過(guò)對(duì)BODIPY 母體結(jié)構(gòu)修飾籠化單元可以得到適用于PALM 成像的染料。光活化硼烷基化的BODIPY 染料15（圖4）在光照下硼烷基裂解后可被溶劑加合物所取代，光活化量子產(chǎn)率為0.12%［44］。該染料的光活化和激發(fā)過(guò)程均使用低功率激光（488 nm，160 W cm-2）為光源，對(duì)細(xì)胞的刺激較小。通過(guò)將紫杉醇與15 共價(jià)偶聯(lián)，SMITH E A 等對(duì)活細(xì)胞中的微管結(jié)構(gòu)進(jìn)行了超分辨熒光成像，為開發(fā)光活化BODIPY 超分辨熒光染料提供了新思路。RAYMO F M 和其合作者將BODIPY 與光敏感的惡嗪雜環(huán)化合物連接獲得染料16（圖4），從而調(diào)控其熒光強(qiáng)度與熒光光譜［45］。不同于將熒光團(tuán)通過(guò)籠化基團(tuán)完全屏蔽的設(shè)計(jì)，該染料在光活化前仍具有熒光，惡嗪雜環(huán)在光活化后與BODIPY 結(jié)構(gòu)共軛，吸收與發(fā)射光譜紅移，（激發(fā)波長(zhǎng)從608 nm 紅移至656 nm，發(fā)射波長(zhǎng)從623 nm 紅移至669 nm），通過(guò)收集活化后響應(yīng)波段的熒光，從而獲得超分辨成像。該染料的光活化量子數(shù)為1%，在405 nm 的激發(fā)光下，單個(gè)分子平均可以收集到2 000 個(gè)光子，可以對(duì)活細(xì)胞溶酶體進(jìn)行超分辨熒光成像，并通過(guò)與溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合防止染料在細(xì)胞中擴(kuò)散，優(yōu)異的信噪比使其分辨率達(dá)到了15 nm。這一設(shè)計(jì)表明籠化單元不一定需要將熒光完全屏蔽，如果可以實(shí)現(xiàn)光譜的大斯托克斯位移調(diào)控，同樣可以用于PALM 成像。

通過(guò)簡(jiǎn)單的分子結(jié)構(gòu)調(diào)整獲得分子效能的提升是研究者追求的目標(biāo)，萊斯大學(xué)的XIAO H 課題組通過(guò)在傳統(tǒng)的熒光團(tuán)中進(jìn)行硫-氧原子替換，開發(fā)了一種簡(jiǎn)便且通用的PALM 成像熒光染料設(shè)計(jì)策略，在可見(jiàn)光譜范圍內(nèi)獲得了一系列可光活化的小分子熒光染料［46］（染料17 為例）?；诶碚撚?jì)算，熒光團(tuán)內(nèi)的硫代羰基取代通過(guò)光致電子轉(zhuǎn)移可誘導(dǎo)熒光團(tuán)熒光淬滅，而熒光團(tuán)處于有氧環(huán)境能由可見(jiàn)光（365～630 nm）活化，光活化量子效率為2.6%。在這一過(guò)程中，硫籠熒光團(tuán)可以有效地被氧化為其氧代衍生物，從而恢復(fù)熒光團(tuán)的熒光，活化后熒光亮度提升260 倍。這一設(shè)計(jì)策略在最小的結(jié)構(gòu)改變下獲得了優(yōu)異的熒光性能的調(diào)整，為PALM 超分辨染料的設(shè)計(jì)提供了新的思路。

傳統(tǒng)羅丹明結(jié)構(gòu)容易受到pH 和極性變化的干擾，在緩沖溶液或細(xì)胞中熒光開關(guān)狀態(tài)隨機(jī)切換，干擾了光活化超分辨熒光成像的精度。肖義課題組通過(guò)在螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)中直接引入羧基，構(gòu)建了甘氨酸羅丹明染料（18，圖4）。在光激活開環(huán)釋放熒光的同時(shí)，引入的羧基與氮負(fù)離子形成氫鍵，穩(wěn)定了羅丹明染料的開環(huán)結(jié)構(gòu)［47］。通過(guò)與傳統(tǒng)羅丹明對(duì)比，18 具有更高的穩(wěn)定性（熒光分子的開啟時(shí)間延長(zhǎng)到68.5 ms）和收集光子數(shù)（單個(gè)分子的平均收集光子數(shù)達(dá)到43 200），這些優(yōu)點(diǎn)顯著了提高染料的超分辨熒光顯微成像性能。而FUENTES P R 課題組則開發(fā)了一種結(jié)合光活化和流動(dòng)性特點(diǎn)，且獨(dú)立于分子介質(zhì)特性來(lái)控制開環(huán)熒光分子數(shù)量的方法（19，圖4）［48］。19 在光活化后，會(huì)存在一個(gè)閉環(huán)形式的反式結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)與開環(huán)的熒光分子間存在著熱平衡關(guān)系，因此發(fā)光的熒光分子比例有可調(diào)控性。85 mW·cm-2的光源光活化100 s 后，體系中的開環(huán)順式結(jié)構(gòu)占比為0.64%，而熒光分子占比為0.25%。通過(guò)將染料分子嵌入PVA 薄膜，測(cè)試得到分子開關(guān)次數(shù)達(dá)到221 次，每次分子開關(guān)可以收集到640 個(gè)光子。此外，即使光活化后的分子被光漂白，閉環(huán)形式的反式結(jié)構(gòu)將向開環(huán)形式轉(zhuǎn)化，從而保持開環(huán)熒光分子的數(shù)量。該策略能夠以極小的光毒性進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的熒光信號(hào)采集，利用19 追蹤細(xì)胞內(nèi)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)神經(jīng)元中突觸小泡運(yùn)輸過(guò)程的三維延時(shí)成像。

肖義課題組通過(guò)亞硝基籠化策略構(gòu)建新型羅丹明，能通過(guò)可見(jiàn)光激活（532 nm）熒光團(tuán)［49］，促進(jìn)N-NO鍵的斷裂實(shí)現(xiàn)高亮度熒光發(fā)射，該染料的光活化量子產(chǎn)率為16%（離去一個(gè)一氧化氮）和2.7%（離去第二個(gè)一氧化氮）。結(jié)合生物正交偶聯(lián)定位技術(shù)，20（圖4）可以實(shí)現(xiàn)活細(xì)胞中線粒體和微管的超分辨熒光成像。與傳統(tǒng)的鄰硝基芐基策略相比，研究者將籠化單元簡(jiǎn)化為一氧化氮，降低了籠化單元對(duì)羅丹明母體結(jié)構(gòu)光學(xué)性能的干擾。同時(shí)，通過(guò)可見(jiàn)光對(duì)籠化基團(tuán)進(jìn)行光活化，減少了光源對(duì)細(xì)胞的光毒性。

3.2 光閃爍超分辨染料

不同于2006年莊小威課題組對(duì)Cy3 和Cy5 在DNA 上進(jìn)行修飾構(gòu)成分子對(duì)的方法，MOERNER W E 等在2008年通過(guò)共價(jià)修飾連接Cy3 和Cy5，消除了Cy3 和Cy5 分子間距離的不確定性影響，實(shí)現(xiàn)了對(duì)新月形桿菌管狀莖結(jié)構(gòu)的超分辨熒光成像［37］。2013年，莊小威課題組報(bào)道了通過(guò)優(yōu)化緩沖溶液體系促進(jìn)花菁染料應(yīng)用于超分辨成像［50］，然而這些方法聚焦于改善緩沖溶液體系來(lái)促使染料從三線態(tài)回到基態(tài)，而非對(duì)染料結(jié)構(gòu)的調(diào)控，本綜述不作贅述。

羅丹明染料的開閉環(huán)結(jié)構(gòu)可以實(shí)現(xiàn)熒光的開啟或關(guān)閉。2013年JOHNSSON K 課題組設(shè)計(jì)了具有優(yōu)異過(guò)膜能力和光譜特性的硅基羅丹明染料（21，圖5）。當(dāng)使用1 kW·cm-2的激發(fā)光時(shí)，每幀圖片可以收集到630 個(gè)光子，因此適用于STORM 成像［51］。通過(guò)結(jié)合不同的蛋白標(biāo)簽“HaloTag，SNAPTag 和CLIPTag”，實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同蛋白的標(biāo)記和活細(xì)胞中的超分辨熒光成像。但是，此染料無(wú)法實(shí)現(xiàn)dSTORM，應(yīng)用存在一定的限制。

圖5 適用于STORM 的有機(jī)小分子染料Fig.5 Small molecular organic dyes for STORM

LAVIS L D 課題組將N，N-二甲基結(jié)構(gòu)替換為四元的氮雜環(huán)結(jié)構(gòu)，通過(guò)抑制扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)極大的提升了硅基羅丹明的量子產(chǎn)率和亮度，同時(shí)不影響硅基羅丹明開閉環(huán)結(jié)構(gòu)比例。在14 kW·cm-2，637 nm 的激發(fā)光激發(fā)下，10 000 幀照片可以定位到283 501 個(gè)分子。研究者將該染料與HaloTag 蛋白標(biāo)簽結(jié)合，開發(fā)出了染料22（圖5），實(shí)現(xiàn)了對(duì)活細(xì)胞的STORM 成像［21］。同樣為了獲得更高的熒光亮度，肖義課題組利用季銨基團(tuán)的吸電子效應(yīng)，抑制染料在激發(fā)態(tài)時(shí)電荷誘導(dǎo)效應(yīng)，降低分子扭曲導(dǎo)致的非輻射能量損耗，從而增強(qiáng)熒光發(fā)射［22］。這一策略提升了羅丹明染料的量子產(chǎn)率，并提升了熒光開啟時(shí)的壽命，進(jìn)而促進(jìn)單分子成像時(shí)可收集的總光子數(shù)增加。在PBS 緩沖溶液中單分子收集到的總光子數(shù)提升近四倍，達(dá)到40 600 個(gè)，有助于提高單分子成像的精度。研究者利用染料23 及其衍生物（圖5），用2 kW·cm-2，532 nm 的激光激發(fā)染料實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞膜和活細(xì)胞中溶酶體的超分辨熒光成像。這兩種策略雖然對(duì)染料的亮度進(jìn)行了提升，然而由于沒(méi)有對(duì)羅丹明染料的開閉環(huán)性能進(jìn)行進(jìn)一步調(diào)控，無(wú)法實(shí)現(xiàn)dSTORM，同時(shí)，所需的激發(fā)光功率較高，特別是染料22，達(dá)到了14 kW·cm-2，不利于對(duì)活細(xì)胞的成像。

正因如此，研究者希望通過(guò)調(diào)控處于亮態(tài)（開環(huán)狀態(tài)）羅丹明的比例，獲得適用于dSTORM 成像的染料。基于對(duì)羅丹明開閉環(huán)比例的調(diào)控，URANO Y 等設(shè)計(jì)了一種新型羅丹明染料（24，圖5）［52］，區(qū)別于傳統(tǒng)羅丹明的螺內(nèi)酯結(jié)構(gòu)，在此分子中，通過(guò)引入分子內(nèi)的親核反應(yīng)基團(tuán)，調(diào)節(jié)親核基團(tuán)（羥基）的親核性和親電基團(tuán)（羅丹明母體結(jié)構(gòu)）的親電性來(lái)調(diào)控分子的分子內(nèi)螺環(huán)化平衡常數(shù)（pKcycl）。該染料的pKcycl為5.8，開環(huán)形式的壽命約為100 ms，因此在pH 7.4 的生理?xiàng)l件下，該染料的開環(huán)比例極低，可以直接應(yīng)用于活細(xì)胞超分辨熒光成像。

雖然硅基羅丹明在生理環(huán)境下以閉環(huán)形式為主，但存在不穩(wěn)定性，易受到環(huán)境因素干擾，為了穩(wěn)定硅基羅丹明的開環(huán)比例，IWANAGA S 等提出通過(guò)對(duì)Si 原子上的取代基進(jìn)行修飾，引入硅烷結(jié)構(gòu)，將有利于提高呫噸環(huán)上的電子密度，促進(jìn)羅丹明染料的環(huán)化反應(yīng)，進(jìn)而降低羅丹明染料兩性離子的占比。研究者設(shè)計(jì)了一系列分子驗(yàn)證了這一假設(shè)，并篩選出具有合適開關(guān)比例的染料25-1（4%）和25-2（3%）［53］。在0.18 kW·cm-2的激發(fā)光激發(fā)下，25-1 單分子可收集到411 個(gè)光子，25-2 可收集到332 個(gè)光子。通過(guò)染料25（圖5），實(shí)現(xiàn)了對(duì)HeLa 細(xì)胞微管的超分辨熒光成像。

羅丹明的螺環(huán)化反應(yīng)平衡也可以通過(guò)對(duì)氧雜蒽上不同位點(diǎn)的修飾來(lái)進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)而獲得具有適宜開關(guān)比的染料用于STORM 超分辨熒光成像。徐兆超和劉小剛發(fā)現(xiàn)羅丹明的開環(huán)比例與吉布斯自由能差值（ΔG）之間存在良好的線性關(guān)系，因此，可以通過(guò)ΔGc-o來(lái)指導(dǎo)羅丹明染料的設(shè)計(jì)［54］?；讦c-o這一思路，研究者設(shè)計(jì)并合成了pKcycl為5.3 的染料26（圖5），其具有優(yōu)異的亮度和光穩(wěn)定性，在1.92 kW cm-2的激發(fā)光下可以單分子可以收集到800 個(gè)光子。通過(guò)對(duì)吉布斯自由能差值的計(jì)算，可以提前預(yù)測(cè)染料的pKcycl，以獲得適用于dSTORM 成像的染料。

羅丹明螺內(nèi)酰胺因其閉環(huán)反應(yīng)較慢，常作為光調(diào)控籠化基團(tuán)用于PALM 成像而非STORM 成像。徐兆超課題組提出通過(guò)引入氫鍵來(lái)穩(wěn)定螺內(nèi)酰胺（27，圖5）［55］，加速了其從熒光開環(huán)結(jié)構(gòu)到非熒光螺內(nèi)酰胺的閉環(huán)轉(zhuǎn)化，使其具有了優(yōu)異的光閃爍性能。通過(guò)在螺內(nèi)酰胺上進(jìn)一步取代6-苯基乙炔基萘酰亞胺，可以將活化光波長(zhǎng)紅移至405 nm，同時(shí)活化光功率降低至1.8 W·cm-2，降低光毒性對(duì)細(xì)胞的影響。該染料克服了傳統(tǒng)羅丹明染料對(duì)酸性環(huán)境敏感易開環(huán)的特點(diǎn)，拓展了羅丹明染料在酸性環(huán)境下的超分辨成像，并成功應(yīng)用于枯草芽孢桿菌細(xì)胞表面微結(jié)構(gòu)的超分辨熒光成像。

XU K 課題組報(bào)道了一種實(shí)現(xiàn)高性能STORM 成像染料設(shè)計(jì)的新思路［56］。利用1，3-雙取代咪唑鎓替代羅丹明類染料中的苯環(huán)，得到的新型熒光染料分子（28，圖5）。1，3-雙取代咪唑鎓帶有正電荷，可促進(jìn)染料分子捕獲電子而破壞母體的共軛結(jié)構(gòu)，并在560 nm 光源的照射下進(jìn)而進(jìn)入暗態(tài)。與傳統(tǒng)羅丹明相比，該類染料更容易進(jìn)入暗態(tài)，并且可以在405 nm 的紫外照射下恢復(fù)到熒光態(tài)，在收集100 000 幀照片后仍具有優(yōu)異的光閃爍性能，平均單個(gè)分子在光漂白前可收集到4 500 個(gè)光子。

二芳基乙烯（DAE）具有良好的穩(wěn)定性和光致變色特性，但這類物質(zhì)在生物成像中受到溶解度差的應(yīng)用限制。HELL S W 課題組通過(guò)水溶性基團(tuán)修飾，改善了DAE 結(jié)構(gòu)的水溶性，獲得了一系列新型染料（圖5）［57］。其中，染料29 可通過(guò)375 nm 的光源光活化（轉(zhuǎn)化率0.15%）并在480 nm 的激發(fā)下向開環(huán)形式轉(zhuǎn)換（轉(zhuǎn)化率0.018%），同時(shí)，單分子每次激發(fā)可釋放2 500 個(gè)光子使得高密度的目標(biāo)物標(biāo)記成為可能。該染料不需要額外的緩沖溶液輔助就可以實(shí)現(xiàn)光閃爍，避免了對(duì)活體樣本的干擾。這類染料的開發(fā)拓展了超分辨熒光染料的種類，但為了改善水溶性而增加了染料的分子量，不利于進(jìn)一步對(duì)分子的功能化修飾。

KAMIYA M 和URANO Y 等開發(fā)了一種在活細(xì)胞中自發(fā)閃爍的新方法［58］：利用細(xì)胞內(nèi)高含量的谷胱甘肽（GSH）對(duì)氧雜蒽熒光團(tuán)的9 號(hào)位進(jìn)行親核進(jìn)攻，得到了可用于STORM 成像的硅取代和碳取代兩類熒光染料。研究者通過(guò)染料對(duì)GSH 的解離常數(shù)（Kd，GSH）來(lái)衡量該類染料的熒光開啟率。其中30-1 的Kd，GSH為1 μM，30-2 的Kd，GSH為3.1 μM，兩個(gè)染料均表現(xiàn)出在熒光和無(wú)熒光狀態(tài)下GSH 加合物之間的平衡性以及優(yōu)異的自發(fā)閃爍能力，可結(jié)合STORM 成像活細(xì)胞中的微管或線粒體。此外，通過(guò)使用自發(fā)閃爍的近紅外染料30-1（SiP650，圖5）和綠色熒光團(tuán)30-2（CP550，圖5），在不需要介質(zhì)的條件下，實(shí)現(xiàn)了雙色活細(xì)胞單分子成像。這種方式避免了光活化對(duì)細(xì)胞的副作用。

4 適用于SIM 的有機(jī)小分子熒光染料

基于結(jié)構(gòu)光成像的原理，線性SIM 技術(shù)對(duì)熒光染料沒(méi)有特殊要求，并且根據(jù)奈科斯特定律，其需要收集的光子數(shù)也僅為共聚焦成像的4～8 倍，遠(yuǎn)低于STED 成像和SMLM 成像，因此絕大多數(shù)熒光染料都適用于線性SIM 成像。對(duì)于非線性SIM 技術(shù)，雖然對(duì)分子的飽和吸收有要求，但目前應(yīng)用尚未普及，在本文中不再贅述。據(jù)此，本綜述就不再對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類評(píng)述，僅通過(guò)兩個(gè)典型案列解析設(shè)計(jì)理念。與此同時(shí)，線性SIM 也是最具潛力的用于長(zhǎng)時(shí)間監(jiān)測(cè)細(xì)胞生理活動(dòng)的熒光成像技術(shù)。然而，即便在線性SIM 成像中使用了較低功率的激發(fā)光和更短的采樣時(shí)間，光毒性依然會(huì)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生影響，特別是在觀察一些對(duì)光毒性敏感的亞細(xì)胞器，如線粒體等。在長(zhǎng)時(shí)間照射時(shí)，線粒體的形態(tài)會(huì)發(fā)生變化，功能也可能會(huì)收到影響，這會(huì)對(duì)監(jiān)測(cè)與這些亞細(xì)胞器相關(guān)的生理和病理過(guò)程產(chǎn)生干擾，無(wú)法做到精準(zhǔn)檢測(cè)［59］。因此，研究者開發(fā)了自修復(fù)染料用于降低光毒性的影響［60，61］。2014年BLANCHARD S C 課題組報(bào)道了利用三線態(tài)淬滅劑中和光照產(chǎn)生的ROS 的策略設(shè)計(jì)新型染料（31，圖6）。這一策略可以極大的降低染料的光毒性并提高染料的穩(wěn)定性［62］。2020年，陳知行教授課題組基于這一策略，報(bào)道了新型線粒體示蹤劑32［63］，這一示蹤劑相較于傳統(tǒng)的MitoTracker 系列染料，具有更高的光穩(wěn)定性，同時(shí)，通過(guò)結(jié)構(gòu)光成像，研究者驗(yàn)證了這類新型染料不會(huì)對(duì)線粒體構(gòu)成明顯的光損傷，可實(shí)現(xiàn)無(wú)損監(jiān)測(cè)線粒體動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。

圖6 染料光毒性示意圖和自修復(fù)染料分子Fig.6 Schematic diagram of dye phototoxicity and self-healing dye molecules

5 總結(jié)與展望

綜上，熒光染料的發(fā)展促進(jìn)了成像技術(shù)的進(jìn)步，而成像技術(shù)也進(jìn)一步指導(dǎo)了染料結(jié)構(gòu)的優(yōu)化與完善。超分辨熒光顯微成像技術(shù)采用創(chuàng)造性的策略突破衍射極限，使研究者可以對(duì)亞細(xì)胞器、生物大分子以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)之間相互作用進(jìn)行研究，成為了研究生理學(xué)和病理學(xué)的有力工具。熒光顯微鏡的使用離不開熒光染料，相較于傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡，超分辨熒光顯微鏡所采用的光源功率更高，需要收集信號(hào)的時(shí)間更長(zhǎng)，對(duì)光譜的要求更為嚴(yán)苛，因而對(duì)染料的設(shè)計(jì)提出了更高的要求。其中，有機(jī)小分子熒光染料具有易于修飾以調(diào)控光物理性質(zhì)，便于使用，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，受到了超分辨熒光顯微技術(shù)研究者的廣泛青睞。為了改善有機(jī)小分子染料的水溶性和過(guò)膜率，研究者在染料上修飾水溶性基團(tuán)或改善熒光分子攜帶的電荷。除此之外，STED 技術(shù)使用高功率的激光作為損耗光，對(duì)染料的光穩(wěn)定性有嚴(yán)格要求，研究者通過(guò)對(duì)染料結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，改善其光穩(wěn)定性，降低染料的光漂白，從而獲得穩(wěn)定的熒光信號(hào)；通過(guò)抑制分子的扭轉(zhuǎn)分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移效應(yīng)，優(yōu)化電子排布來(lái)提高熒光量子產(chǎn)率進(jìn)而收集更多的熒光信號(hào)；通過(guò)調(diào)控染料激發(fā)發(fā)射光譜紅移，采用近紅外的損耗光激發(fā)，降低對(duì)細(xì)胞的光損傷；同時(shí)，通過(guò)增大斯托克斯位移，避免損耗光的二次激發(fā)，以獲得更高分辨率的成像。染料分子的光活化或閃爍能力在SMLM 中至關(guān)重要。研究者設(shè)計(jì)不同的籠化基團(tuán)和光敏基團(tuán)調(diào)控PALM 染料分子的穩(wěn)定性，優(yōu)化籠化基團(tuán)，設(shè)計(jì)分子量小、熒光屏蔽效果好的籠化基團(tuán)，改善染料分子的亮態(tài)與暗態(tài)對(duì)比度和光活化量子產(chǎn)率，獲得高質(zhì)量的PALM 成像。對(duì)羅丹明分子結(jié)構(gòu)的調(diào)控，優(yōu)化其開閉環(huán)的比率，從而獲得適合的開環(huán)熒光團(tuán)的占比，同時(shí)通過(guò)染料分子穩(wěn)定性和亮度的提升，降低激發(fā)波長(zhǎng)功率，從而降低對(duì)活細(xì)胞的光損傷，以獲得高質(zhì)量的活細(xì)胞STORM 成像。雖然線性SIM 成像對(duì)染料的光物理性質(zhì)并沒(méi)有特殊的要求，但研究者也通過(guò)進(jìn)一步減少分子受激發(fā)產(chǎn)生的超氧自由基對(duì)生物樣本損傷等策略，降低成像過(guò)程中染料的光毒性，以提高成像效果。

這些策略的共同目的都是力求精準(zhǔn)，減小染料分子對(duì)目標(biāo)物的影響，客觀地對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行觀測(cè)。目前，不同波段的高穩(wěn)定性熒光染料不斷涌現(xiàn)，豐富了超分辨熒光染料庫(kù)，促進(jìn)了多色超分辨熒光顯微成像的發(fā)展。然而要實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間無(wú)損監(jiān)測(cè)亞細(xì)胞器之間、生物大分子與亞細(xì)胞器、生物大分子之間的相互作用，以及復(fù)合時(shí)間尺度的“四維超分辨成像”，仍需進(jìn)一步優(yōu)化有機(jī)小分子熒光染料的結(jié)構(gòu)和性能。如何在盡量不增加染料分子體積/分子量的前提下，實(shí)現(xiàn)染料分子的高透膜性、優(yōu)異的精準(zhǔn)定位能力、高光穩(wěn)定性及低光毒性，是研究人員的不懈追求［64］。而隨著光物理性質(zhì)優(yōu)異的熒光團(tuán)的不斷開發(fā)，有機(jī)小分子熒光團(tuán)/探針，也將在精準(zhǔn)檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮越來(lái)越大的作用，成為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)研究中的重要工具之一。