褪黑素殼聚糖微粒防止褪黑素降解并有效提高其抗旱功能

周 彬，于小晶*，張 民*，田虹雨，董晶晶，郭 蕾，張?zhí)祢?/p>

[1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院/土肥高效利用國(guó)家工程研究中心, 山東泰安 271018；2 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)管理學(xué)院(商學(xué)院), 山東泰安 271018]

小麥 (TriticumaestivumL.)是我國(guó)第二大糧食作物，其產(chǎn)量的高低直接影響人民生活水平和國(guó)家糧食安全。華北地區(qū)作為我國(guó)冬小麥重要產(chǎn)區(qū)之一，該區(qū)域水資源量?jī)H占全國(guó)水資源總量的6%，人均水資源占有量大大低于全國(guó)平均水平[1–2]。干旱在冬小麥苗期出現(xiàn)頻繁，且易導(dǎo)致小麥植株生理傷害，導(dǎo)致產(chǎn)量減少45%以上，嚴(yán)重威脅糧食安全[3]。干旱通過(guò)降低植物體內(nèi)相對(duì)含水量、葉片水勢(shì)，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖，引起光合色素含量下降，造成細(xì)胞損傷，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植物死亡[4]。為了減輕干旱脅迫對(duì)作物造成的損傷，可通過(guò)適量添加生物刺激素來(lái)誘導(dǎo)植物的分子和生理防御機(jī)制，達(dá)到促生保收的效果，這也成為保障我國(guó)糧食安全的重要途徑之一[5]。

褪黑素又名N-乙酰-5-甲氧基色胺 (N-acetyl-5-methoxytryptamine)，是一種動(dòng)植物內(nèi)源性抗氧化劑和自由基清除劑[6]。有研究表明，外源施加褪黑素是提高植物抗逆性的有效手段[7–8]。Sharma等[9]研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素通過(guò)調(diào)控抗氧化防御的關(guān)鍵基因提高抗旱性。然而，由于褪黑素存在易氧化、光敏感等問(wèn)題，導(dǎo)致外源添加褪黑素時(shí)需要在黑暗條件下高頻次施用，這嚴(yán)重限制了褪黑素在農(nóng)業(yè)上的推廣應(yīng)用[10]。

通過(guò)合理的封裝技術(shù)控制褪黑素的釋放是防止褪黑素失效，且實(shí)現(xiàn)其在農(nóng)業(yè)中應(yīng)用的有效手段[11]。傳統(tǒng)農(nóng)藥封裝技術(shù)主要是微膠囊技術(shù)，基于水相和油相互不相容，從而使得壁材能夠在芯材表面凝聚形成微膠囊，保護(hù)芯材實(shí)現(xiàn)緩釋提高利用率[12]。由于褪黑素直接作用于植物，且溶于乙醇等與水互溶的溶劑，其通過(guò)水油體系封裝較為困難。殼聚糖(CS)是一種聚陽(yáng)離子電解質(zhì)多糖，具有生物相容性、可生物降解特性[13]。三聚磷酸鈉(TPP)是一類水溶性線狀聚磷酸鹽。當(dāng)CS與帶相反電荷的TPP作用時(shí)，通過(guò)CS的氨基和TPP的磷酸基團(tuán)之間的靜電吸引作用從而產(chǎn)生微粒負(fù)載藥品[14]。研究表明，殼聚糖/三聚磷酸鈉微粒負(fù)載氟樂靈能夠?qū)崿F(xiàn)其緩釋并減少環(huán)境毒性[14]。果膠是存在于植物細(xì)胞壁中的一種多糖，帶負(fù)電荷且易被植物吸收。有研究表明，殼聚糖/三聚磷酸鈉/果膠納米粒子負(fù)載百草枯可以有效提升百草枯的活性，降低其光降解速率和提高其利用效率[15]。本研究嘗試采用殼聚糖、果膠及三聚磷酸鈉，開發(fā)具有緩釋和抵御光降解能力的褪黑素殼聚糖微粒并進(jìn)行表征評(píng)價(jià)。本研究的目的在于：1)明確褪黑素殼聚糖微粒的制備原理及形態(tài)特征；2)褪黑素殼聚糖微粒抵抗光降解能力的評(píng)價(jià)；3)施用褪黑素殼聚糖微粒對(duì)小麥苗期抗旱性的影響。這項(xiàng)技術(shù)能為功能物質(zhì)提供一種低成本、高效的?；罹忈屖侄?，為功能物質(zhì)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大面積推廣應(yīng)用提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

殼聚糖(CS，脫乙酰度，90%～95%)、褪黑素(MT)、三聚磷酸鈉(TPP)、果膠(≥74.0%)、乙酸、甲醇購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；透析袋(3500 Da)購(gòu)自北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；0.45 μm濾膜購(gòu)自上海必泰生物科技有限公司；小麥(濟(jì)麥22)購(gòu)自山東登海種業(yè)股份有限公司。

供試基質(zhì)來(lái)源于丹麥品氏托普公司，主要以優(yōu)質(zhì)泥炭蘚為原料，基本理化性質(zhì)為有機(jī)質(zhì)434 g/kg、NO3–-N 296 mg/kg、NH4+-N 84.1 mg/kg、有效磷 99.2mg/kg、速效鉀1169 mg/kg、最大持水量為66.67%。育苗采用梯形方盒，上口邊長(zhǎng)10 cm、高8 cm、底面邊長(zhǎng) 7 cm。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 褪黑素殼聚糖微粒的制備 微粒的制備方法(圖1)在Rashidipour等[15]的離子凝膠化技術(shù)基礎(chǔ)上進(jìn)行了一些參數(shù)的優(yōu)化和調(diào)整：稱取0.1 g殼聚糖粉末，溶解在100 mL的0.2% (V/V)醋酸溶液中，磁力攪拌12 h至完全溶解。同時(shí)制備質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的三聚磷酸鈉水溶液和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.08%的果膠溶液。為了去除不溶性或聚集的物質(zhì)，三種溶液均通過(guò)0.45 μm的濾膜過(guò)濾。不含褪黑素殼聚糖微粒的制備：在磁力攪拌下緩慢的將5 mL TPP溶液和2 mL果膠溶液滴加到20 mL殼聚糖溶液中，60℃下攪拌30 min，在 4℃，10000 g 離心 20 min 后棄掉上清液，將沉淀冷凍干燥12 h，得到不含褪黑素的殼聚糖微粒(MP)。含褪黑素的殼聚糖微粒的制備：先將0.1、0.3、0.5、1.0 mL 的褪黑素甲醇溶液 (10 mg/mL)分別與20 mL殼聚糖溶液混合，再按照上述步驟添加5 mL TPP和2 mL果膠，制得褪黑素添加量為1、3、5、10 mg的褪黑素殼聚糖微粒。在4℃，10000 g離心20 min，后棄掉上清液，沉淀用蒸餾水洗滌3次，保證去除未負(fù)載的褪黑素。經(jīng)12 h冷凍干燥后獲得粉末樣品，密封避光下儲(chǔ)存。

圖1 褪黑素殼聚糖微粒制備原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation principle of melatonin chitosan microparticles

1.2.2 小麥干旱脅迫試驗(yàn) 供試品種為濟(jì)麥22，所用基質(zhì)以優(yōu)質(zhì)泥炭蘚為主要原料，所用MP-MT為褪黑素添加量為5 mg的褪黑素殼聚糖微粒。試驗(yàn)采用基質(zhì)培養(yǎng)方法，以基質(zhì)最大持水量的80%為正常供水對(duì)照(CK1)，40%為干旱脅迫對(duì)照(CK2)，在干旱條件下，設(shè)施用1.0 g/L普通褪黑素溶液(MT1.0)，殼聚糖微粒溶液(MP)，以及含褪黑素0.5、1.0、1.5 g/L(MP-MT0.5、MP-MT1.0、MP-MT1.5，即每 1 L 溶液中添加5、10、15 g褪黑素殼聚糖微粒溶液制成) 共7個(gè)處理，各處理重復(fù)4次。選取顆粒飽滿的小麥種子進(jìn)行消毒滅菌處理(經(jīng)75%乙醇浸泡30 s，20%的NaClO溶液浸泡15 min)，用蒸餾水清洗干凈，浸種催芽后選取萌發(fā)水平一致的種子，均勻點(diǎn)播于方盒中，每盆10粒，種子上部用0.5 cm厚蛭石覆蓋，蛭石表面噴灑20 mL蒸餾水，在25℃下，14 h光照/10 h黑暗，光強(qiáng)6000 lx進(jìn)行培養(yǎng)，稱重法每天補(bǔ)充水分，培養(yǎng)至兩葉一心后每盆保留5株健壯且生長(zhǎng)水平一致的小麥幼苗。進(jìn)行試驗(yàn)處理，每天使用稱重法補(bǔ)充水分，連續(xù)處理8 天。干旱脅迫后第1天和第5天，分別用20 mL相應(yīng)濃度的褪黑素殼聚糖水溶液進(jìn)行灌根，對(duì)照處理以等量蒸餾水澆灌，第8天收獲。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.3.1 包封率測(cè)試 將制備完成的微粒懸浮液放入50 mL 離心管中，以 10000 g，4℃ 離心 20 min。取上清液，測(cè)量未包覆的褪黑素。通過(guò)超高效液相色譜測(cè)量殘留在濾液中的褪黑素量間接計(jì)算包封率。將未負(fù)載褪黑素的殼聚糖微粒濾液作為空白對(duì)照。以含有已知濃度的褪黑素溶液做校準(zhǔn)曲線。

包封率 (%) =100×(1–殘留褪黑素量/褪黑素總量)[15]

1.3.2 形態(tài)觀察 為了觀察褪黑素殼聚糖微粒個(gè)體形貌，減少冷凍干燥對(duì)微觀形貌的影響，對(duì)褪黑素殼聚糖懸浮液滴進(jìn)行SEM掃描。將褪黑素殼聚糖微粒懸浮液滴加到硅片并在室溫下干燥，進(jìn)行噴金處理，然后使用掃描電子顯微鏡(SEM)進(jìn)行形態(tài)觀察。儀器采用日本日立公司的SU8020型掃描電子顯微鏡。

1.3.3 紅外光譜測(cè)試 將褪黑素殼聚糖微粒、褪黑素、殼聚糖、三聚磷酸鈉、果膠分別同溴化鉀粉末混合壓片，將制好的薄片置于傅里葉紅外光光譜儀中測(cè)定紅外光譜。儀器采用美國(guó)Nicolet公司的Nexus型紅外光譜儀，掃描次數(shù)為32，分辨率為2 cm–1，掃描范圍為 4000～400 cm–1。

1.3.4 緩釋性能測(cè)試和釋放動(dòng)力學(xué)分析 褪黑素殼聚糖微粒在不同pH條件下的釋放行為測(cè)試：將10 mg褪黑素殼聚糖微粒和空白殼聚糖微粒放置在3500 Da透析袋中，分別放置于pH 5.0和pH 7.0的100 mL磷酸緩沖溶液中。室溫下，以預(yù)定時(shí)間2、4、6、8、10、12、24、36 h 為時(shí)間點(diǎn)間隔取 1 mL 樣品。使用超高效液相色譜儀分析所收集樣品中褪黑素的量。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

Ritger-Peppas模型[16]現(xiàn)在常被用于描述骨架片的藥物釋放規(guī)律，數(shù)學(xué)表達(dá)式如下：

Mt/M∞=?ktn

式中：Mt為微粒釋放出來(lái)的褪黑素質(zhì)量，M∞為微粒中褪黑素的總質(zhì)量，Mt/M∞是藥物累積釋放率，k是釋藥速率常數(shù)，t為釋放時(shí)間，n是擴(kuò)散釋放指數(shù)。當(dāng)n≤0.43時(shí)，藥物以Fick擴(kuò)散(濃度梯度越大，擴(kuò)散通量越大)為主；當(dāng)0.43

1.3.5 光降解率測(cè)試 褪黑素殼聚糖微粒和褪黑素純物質(zhì)換算成10 mg/L的濃度添加到水溶液中。用4 W的LED燈管模擬可見光照射溶液，溶液與燈之間的距離為50 cm，分別在照射 1、2、3、4 h的時(shí)間間隔破壞性取樣。之后將10 mL溶液加入離心管中，并以10000 ×g的離心力，4℃下離心20 min。測(cè)定上清液中褪黑素濃度。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.3.6 小麥幼苗生理指標(biāo)測(cè)定 分別測(cè)定每個(gè)處理小麥幼苗株高、鮮重、干重、SPAD、根系長(zhǎng)度、根表面積、根體積、根直徑、抗氧化酶(超氧化物歧化酶、過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶)活性和丙二醛含量。植株葉片 SPAD 值采用日本Minolta公司生產(chǎn)的SPAD-502葉綠素儀測(cè)定；采用萬(wàn)深LA-S根系掃描儀進(jìn)行根系掃描，測(cè)量根系長(zhǎng)度、根表面積、根體積、根直徑。抗氧化酶活性的測(cè)定：取小麥幼苗葉片樣品加入磷酸緩沖液冰浴研磨，低溫離心后取上清液進(jìn)行酶活性測(cè)定；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑(nitro-blue tetrazolium, NBT)法；過(guò)氧化物酶(peroxidase,POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法；過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法[17]。丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[17]。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

ANOVA方差分析及 Duncan 差異顯著性檢驗(yàn)通過(guò)Excel 2016和IBM SPSS軟件完成；采用Excel 2016軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 褪黑素殼聚糖微粒的包封率

經(jīng)過(guò)前期試驗(yàn)研究，CS、果膠、TPP濃度分別為0.1%、0.08%和0.1%，添加量分別為20、2和5 mL的條件下制備的褪黑素殼聚微粒的包封率是最佳的。在最適配比條件下分別測(cè)定了投入質(zhì)量為1、3、5、10 mg褪黑素的包封率。褪黑素添加量在1、3和5 mg時(shí)包封率并無(wú)顯著差異，添加量為10 mg時(shí)包封率顯著降低。其中褪黑素添加量為1 mg時(shí)包封率不穩(wěn)定，在21.8%～67.4%波動(dòng)較大。投入褪黑素質(zhì)量為5 mg時(shí)制備的褪黑素殼聚糖微粒(MP-MT)包封率最高且較為穩(wěn)定(圖2)，平均包封率達(dá)52.14%，因此隨后試驗(yàn)所用微粒均采用該比例進(jìn)行制備。

圖2 不同褪黑素投入量下褪黑素殼聚糖微粒的包封率Fig.2 The encapsulation efficiency of composite particles with different melatonin amount

2.2 褪黑素殼聚糖微粒表面形貌

圖3為殼聚糖微粒(A、C)和褪黑素添加量為5 mg時(shí)制備的褪黑素殼聚糖微粒(B、D)在光學(xué)顯微鏡放大400倍(A、B)下的表觀形貌和掃描電鏡(C、D)下的微觀形貌。400倍顯微鏡下殼聚糖微粒顆粒粒徑較小，顆粒之間無(wú)團(tuán)聚和黏連現(xiàn)象(圖3A)；圖3B中形成的顆粒粒徑較大，呈分散分布。掃描電鏡顯微照片圖3C和D均能清楚觀察到有顆粒物存在，基底為殼聚糖。圖3C顯示均勻的顆粒堆積，粒徑較?。粓D3D顯示大量的粒徑較大顆粒，表面粗糙。這可能是由于添加褪黑素后褪黑素充斥于顆粒內(nèi)部，從而導(dǎo)致顆粒粒徑增大。

圖3 殼聚糖微粒掃描電鏡圖Fig.3 Electron scanning images of chitosan particle structure

2.3 褪黑素殼聚糖微?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)

對(duì)褪黑素殼聚糖微粒進(jìn)行了紅外光譜(FTIR)分析，同時(shí)與MT、MP、CS、TPP、果膠FTIR光譜進(jìn)行了比較(圖4)。殼聚糖(CS)在3458、1658、1076 cm–1處的特征吸收峰分別歸屬于N―H拉伸振動(dòng)峰、氧橋伸縮振動(dòng)峰、碳氧伸縮震動(dòng)吸收峰。TPP在1218 cm–1處有P―O拉伸振動(dòng)峰，果膠在1638 cm–1處有COO–對(duì)稱吸收峰。褪黑素(MT)的N―H拉伸振動(dòng)，N―H彎曲振動(dòng)和C―O―C拉伸振動(dòng)分別是3301、1626和1213 cm–1的吸收峰。在MPMT的光譜中，觀察到CS與TPP交聯(lián)后，CS中3524 cm–1處的峰移至較低波數(shù) 3454 cm–1，在 1537 cm–1處出現(xiàn)了一個(gè)新峰(酰胺II)，這可能是由于CS的–NH2基團(tuán)與TPP磷酸基團(tuán)之間存在靜電相互作用造成的。通過(guò)MT-MP與MP對(duì)比，發(fā)現(xiàn)MPMT中擁有與MT相關(guān)的N―H彎曲振動(dòng)和C―O―C拉伸振動(dòng)峰，這能表明MP-MT中含有MT相關(guān)組分。

圖4 褪黑素殼聚糖(MP-MT)、空載殼聚糖微粒(MP)、褪黑素(MT)、殼聚糖(CS)、三聚磷酸鈉(TPP)和果膠(Pectin)的紅外光譜Fig.4 Infrared spectra of melatonin chitosan (MP-MT),chitosan microparticles (MP), melatonin (MT), chitosan(CS), sodium tripolyphosphate (TPP), and pectin (Pectin)

2.4 褪黑素殼聚糖微粒的緩釋特性和動(dòng)力學(xué)擬合

從室溫下MP-MT在pH 5.0或pH 7.0的磷酸緩沖溶液中的釋放曲線(圖5)可以看出，MP-MT呈現(xiàn)雙相釋放模式，初始階段為快速釋放，褪黑素在4 h內(nèi)釋放率達(dá)到 44.83% (pH 5.0)和 27.6% (pH 7.0)，此后表現(xiàn)為緩慢釋放，最終在36 h內(nèi)釋放率達(dá)到65.43% (pH 5.0)和 50.13% (pH 7.0)。初始階段的爆發(fā)釋放是由于吸附在MT-MP表層的褪黑素釋放，而后期的緩釋是由于殼聚糖微粒內(nèi)部褪黑素緩慢釋放。與pH7.0下相比，pH5.0下累積釋放率升高。可見，褪黑素殼聚糖微?？梢杂行а娱L(zhǎng)褪黑素的釋放時(shí)間，且MP-MT在酸性條件下會(huì)加快褪黑素的釋放。

圖5 褪黑素殼聚糖微粒在磷酸緩沖溶液中的釋放速率Fig.5 Release rate of melatonin chitosan in phosphate buffer solution

使用Ritger-Peppas數(shù)學(xué)模型對(duì)釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，MP-MT在pH 5.0的磷酸緩沖溶液中的釋放指數(shù)和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.138和0.86，MPMT在pH 7.0的磷酸緩沖溶液中的釋放指數(shù)和線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.228和0.90 (圖6)。兩者的釋放指數(shù)都小于0.45，這表示褪黑素在微粒中的釋放行為主要以擴(kuò)散控制為主。

圖6 Ritger-Peppas數(shù)學(xué)模型擬合的褪黑素殼聚糖微粒中褪黑素隨時(shí)間的釋放率Fig.6 Melatonin release rate of melatonin chitosan with time fitted by Ritger-Peppas model

2.5 褪黑素殼聚糖微粒的光降解性能

由褪黑素(MT)和褪黑素殼聚糖微粒(MPMT)水溶液在光照射下褪黑素的降解率(圖7)可知，MT在1 h時(shí)的降解率為11.47%，4 h時(shí)的降解率為23.68%；MP-MT在1 h時(shí)褪黑素降解率為5.33%，在4 h時(shí)降解率僅為9.73%，相較于MT降解率降低了58.91%。這表明褪黑素負(fù)載在殼聚糖微粒后可有效降低褪黑素的降解，延長(zhǎng)其持效時(shí)間。

圖7 可見光下殼聚糖微粒負(fù)載褪黑素(MP-MT)和褪黑素(MT)隨時(shí)間的降解率Fig.7 Degradation rate of melatonin with (MP-MT) and without chitosan microparticles (MT) under visible light

2.6 干旱條件下褪黑素殼聚糖微粒對(duì)小麥幼苗的生長(zhǎng)狀況和生理指標(biāo)的影響

由表1可知，干旱對(duì)照(CK2)比正常對(duì)照(CK1)小麥幼苗株高、干重分別顯著降低了25.72%、28.58%。與CK2相比，MP對(duì)小麥株高、生物量及SPAD值均無(wú)顯著影響，MT和3個(gè)MP-MT處理有不同程度的增加，MT1.0處理和MP-MT0.5處理可以有效的提高小麥葉片的SPAD值14.47%和23.56%。與MT1.0相比，MP-MT1.0顯著增加了小麥株高，3個(gè)MP-MT處理的小麥幼苗干重增加4.50%～22.73%，3個(gè)MP-MT處理均提高了SPAD值。以上結(jié)果表明，MT-MP提高小麥幼苗抗旱性的效果好于MT。

表1 干旱脅迫下不同處理小麥株高、鮮重、干重和葉片SPAD值Table 1 Plant height, fresh weight, dry weight and leaf SPAD value of wheat with different treatments under drought stress

干旱脅迫顯著影響了小麥的根系發(fā)育情況(表2)。MP處理除根系體積外，其他指標(biāo)與CK2處理無(wú)顯著差異，而MT1.0、MP-MT0.5、MP-MT1.0和MPMT1.5處理的根長(zhǎng)和根表面積則分別較CK2處理增加18.71%、37.75%、57.40%、40.65%和22.94%、25.59%、38.61%和17.82% (表2)。與MT1.0處理相比，3個(gè)MP-MT處理根系長(zhǎng)度增加 15.92%～32.56%，增加幅度以MP-MT1.0最大。

表2 干旱脅迫下不同處理小麥根系生長(zhǎng)情況Table 2 Root growth of wheat with different treatments under drought stress

過(guò)氧化物酶是植物體內(nèi)活性氧清除系統(tǒng)的主要成分之一，能夠緩解植物因干旱引起的氧化損傷。干旱條件會(huì)導(dǎo)致小麥葉片的SOD、POD、CAT活性下降(表3)，而MT和MP-MT處理的小麥葉片SOD、POD、CAT活性均較CK2處理出現(xiàn)明顯上升。其中，與MT1.0處理相比，3個(gè)MP-MT處理的過(guò)氧化酶活性提高了19.56%～20.34%。丙二醛(MDA)含量可以在一定程度上反映植物遭受干旱脅迫傷害的程度。MP-MT0.5、MP-MT1.0和MPMT1.5處理比CK2處理小麥葉片的MDA含量分別顯著降低28.16%、27.80%和26.12%。與MT1.0處理相比，3個(gè)MP-MT處理的小麥幼苗MDA含量降低9.77%～12.30%。MP-MT0.5與MP-MT1.0、MPMT1.5處理之間POD、CAT活性和MDA含量無(wú)顯著性差異。綜合以上結(jié)果可知，干旱條件下，MT1.0處理能夠增強(qiáng)小麥抗旱能力，而MT-MP處理較MT1.0處理進(jìn)一步顯著提升小麥幼苗的抗旱能力，且MP-MT0.5處理所需褪黑素施加量更少。

表3 干旱脅迫下不同處理小麥抗氧化酶活性和丙二醛含量Table 3 Antioxidant activity and malondialdehyde content with different treatments under drought stress

3 討論

通過(guò)殼聚糖/三聚磷酸鈉/果膠與褪黑素的雜化成?？梢詫?shí)現(xiàn)褪黑素緩釋保活。超高效液相色譜法測(cè)定，裝載的MP-MT的封裝效率為52.23%，與殼聚糖/卵磷脂載藥體系相比包封率升高，這可能是體系中添加果膠的原因。果膠作為一種新的負(fù)電荷組分和易被吸收的植物分子，能夠增強(qiáng)殼聚糖與三聚磷酸鈉的交聯(lián)反應(yīng)，由此可能會(huì)獲得更優(yōu)的封裝效果和更高的利用效率[18]。與褪黑素多孔淀粉封裝系統(tǒng)相比，包封率雖無(wú)顯著差異，但是殼聚糖/三聚磷酸鈉/果膠的雜化包裹褪黑素會(huì)使其混合更為均勻，而且封裝材料相比多孔淀粉等更為廉價(jià)易得，更加適用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)[19]。相比殼聚糖/三聚磷酸鈉制備的納米顆粒，殼聚糖/三聚磷酸鈉/果膠裝載褪黑素的微粒粒徑具有明顯的增加，這可能與添加果膠有關(guān)，果膠是具有粘性的溶液會(huì)導(dǎo)致微粒的聚集變大。

褪黑素殼聚糖微粒是一種擴(kuò)散控制的緩慢釋放系統(tǒng)，表現(xiàn)為前期的爆發(fā)釋放和后期的緩慢釋放，這種延遲釋放可以有效的增加植物對(duì)褪黑素的利用效率。前期快速釋放使植物的脅迫狀況可以及時(shí)得到緩解，后期緩慢釋放使植物持續(xù)處于褪黑素分子的刺激作用下。在36 h時(shí)MP-MT的累計(jì)釋放率為65.43%，對(duì)比卵磷脂/殼聚糖/褪黑素納米顆粒4 h釋放70%，緩釋期明顯增加。這主要與微粒的粒徑相對(duì)較大有關(guān)，有研究表明微粒的粒徑增加會(huì)增強(qiáng)緩釋性能[20]。而且微粒成分中含有果膠，果膠與水接觸后會(huì)迅速形成粘性溶液和凝膠，通過(guò)滲透作用調(diào)節(jié)膨脹程度，增加交聯(lián)密度，調(diào)節(jié)釋放速率[21]。有研究表明植物在逆境脅迫條件下，會(huì)通過(guò)分泌質(zhì)子、有機(jī)酸等來(lái)抵抗逆境脅迫，從而導(dǎo)致局部根系pH的降低，MP-MT在酸性條件下加快釋放，有利于褪黑素釋放快速緩解植物的脅迫狀況[22]。酸性條件下MPMT釋放加速，主要與殼聚糖特性有關(guān)，弱酸條件下殼聚糖的氨基被質(zhì)子化，破壞了殼聚糖分子間氫鍵作用，二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，使得褪黑素的溶出增加，釋放加快[23]。本研究中發(fā)現(xiàn)殼聚糖封裝系統(tǒng)還能有效的降低褪黑素的光降解作用。褪黑素的光降解可能是由于在光照和氧氣存在的條件下，吲哚環(huán)生成過(guò)氧化物中間體，然后迅速成為穩(wěn)定的產(chǎn)物N1-乙?；?N2-甲酰-5-甲氧基犬尿氨酸(AFMK)所造成的。MP-MT光降解下降可能與殼聚糖外殼減少了褪黑素與光和氧的直接接觸有關(guān)[10, 24]。

在干旱脅迫條件下，相比CK2處理，MT1.0處理和MP-MT0.5處理可以有效提高小麥葉片的SPAD值14.47%和23.56%，這可能與褪黑素參與調(diào)節(jié)光合作用相關(guān)的蛋白質(zhì)有關(guān)。研究表明，褪黑素下調(diào)部分與葉綠素降解有關(guān)的蛋白或酶，如衰老脫水相關(guān)蛋白、α-淀粉酶，從而減少葉綠素的降解，維持葉綠體功能[25]。本試驗(yàn)中褪黑素殼聚糖微粒通過(guò)緩釋褪黑素來(lái)提高干旱脅迫下葉綠素相關(guān)酶的表達(dá)，減少葉綠素降解，從而保證光合作用的正常進(jìn)行。

促進(jìn)根系發(fā)育，是減少干旱脅迫造成的不良影響的重要手段。在許多植物中，褪黑素已被證明能促進(jìn)根的生長(zhǎng)。在甜櫻桃砧木的試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)低濃度的褪黑素對(duì)砧木的根數(shù)和根長(zhǎng)有自生反應(yīng)[26]；Zhou等[27]研究發(fā)現(xiàn)，mDREB1在轉(zhuǎn)基因植物中可以調(diào)節(jié)褪黑素的合成，增加褪黑素的含量，從而減輕干旱脅迫對(duì)根系發(fā)育的抑制作用。在本研究中，通過(guò)對(duì)植株根系形態(tài)的對(duì)比分析，結(jié)果表明，MT1.0、MP-MT0.5處理分別顯著促進(jìn)根長(zhǎng)和根表面積增長(zhǎng)18.71%、37.75%和22.94%、25.59%，使其擁有更豐富的根去獲取水分，從而抵御干旱脅迫，這與王華美等[28]的研究結(jié)果是一致的。褪黑素微粒在提高干重、SPAD值和根系發(fā)育方面的效用較MT更加明顯，原因可能在于褪黑素在殼聚糖封裝體系中降低光降解速率并緩慢釋放，使得植物能夠在干旱脅迫條件下，外源褪黑素濃度保持在有效范圍之內(nèi)，增強(qiáng)植物抗旱性。

干旱脅迫時(shí)，植物葉綠體和線粒體中積累大量自由基，破壞植物的正常代謝，導(dǎo)致作物減產(chǎn)[29]。Ali等[30]研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫累積大量活性氧(ROS)，導(dǎo)致植物細(xì)胞損傷產(chǎn)生MDA，抑制植物生長(zhǎng)發(fā)育。施加褪黑素可以誘導(dǎo)干旱脅迫下植株抗氧化能力的提高，增強(qiáng)對(duì)細(xì)胞膜的保護(hù)作用。本研究中MP-MT0.5處理顯著增強(qiáng)了干旱脅迫下小麥SOD、POD、CAT的活性，增強(qiáng)清除ROS的能力。這可能是因?yàn)橥庠赐屎谒乜梢哉T導(dǎo)內(nèi)源一氧化氮的產(chǎn)生，從而下調(diào)miR398表達(dá)以激活ROS清除酶活性，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)并最終清除細(xì)胞內(nèi)ROS[31]。且MT1.0和MP-MT0.5處理顯著降低了葉片MDA含量，其中MP-MT0.5降低效果更為明顯，顯著減少了28.16%。這可能與褪黑素提高了抗氧化酶活性和調(diào)節(jié)C-重復(fù)序列結(jié)合因子(CBFs)等逆境反應(yīng)基因的表達(dá)有關(guān)[32]。本研究MP-MT處理在提升小麥幼苗抗旱性上明顯優(yōu)于MT處理，這主要是因?yàn)闅ぞ厶?三聚磷酸鈉/果膠封裝體系提高了褪黑素的利用率。另外本試驗(yàn)在不限制黑暗條件下施用且減少施用頻次的情況下提高了小麥幼苗的抗旱能力，這可能與褪黑素殼聚糖微粒對(duì)褪黑素的緩慢持續(xù)釋放和光降解速率降低有關(guān)。

4 結(jié)論

殼聚糖/三聚磷酸鈉/果膠體系能夠有效包封褪黑素，在褪黑素加入量5 mg時(shí)，包封率達(dá)到52.14%；褪黑素殼聚糖微粒具有緩釋性能，符合Ritger-Peppas釋放機(jī)理Fick擴(kuò)散；光降解試驗(yàn)表明，褪黑素殼聚糖微粒可有效降低褪黑素的光降解速率；小麥干旱脅迫試驗(yàn)表明，褪黑素殼聚糖微粒在降低褪黑素的使用量情況下，提高小麥幼苗SPAD值，促進(jìn)根系發(fā)育，增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而緩解干旱損傷，提高小麥幼苗抗旱能力。