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    早期腸內(nèi)營養(yǎng)對膽道閉鎖幼鼠的腸道黏膜結構及微生態(tài)保護作用的研究

    2022-09-22 01:26:10吳宙光左桃燕陳思琦付靜茹張文杰
    河北醫(yī)科大學學報 2022年8期
    關鍵詞:幼鼠膽管炎造模

    吳宙光,王 斌,左桃燕,陳思琦,付靜茹,張文杰

    (廣東省深圳市兒童醫(yī)院普外科,廣東 深圳 518026)

    膽道閉鎖(biliary astresia,BA)以肝內(nèi)外膽管進行性炎癥和膽汁淤積性黃疸為特點,可導致嬰幼兒出現(xiàn)進行性肝纖維化和肝硬化,甚至出現(xiàn)肝衰竭。肝門-空腸吻合術(kasai portoenterostomy, kasai)是治療BA的主要手術方式,研究表明,BA患兒kasai術后易出現(xiàn)肝功能損傷、膽管炎、持續(xù)性黃疸等并發(fā)癥,其中膽管炎是BA患兒kasai術后最為常見的并發(fā)癥,多于術后1年內(nèi)發(fā)生[1],術后膽管炎的發(fā)生多與術后食物反流、膽道梗阻、腸道微生物遷移、腸道黏膜功能紊亂和免疫功能、患兒營養(yǎng)狀態(tài)等因素密切相關[2]。因此,尋找減少kasai術后并發(fā)癥發(fā)生的有效治療方法顯得尤為重要。營養(yǎng)支持治療對BA患兒kasai術后具有重要作用,分為腸外營養(yǎng)(parenteral nutrition,PN)和腸內(nèi)營養(yǎng)(enteral nutrition,EN)。EN具有價格更為低廉、符合生理需求等優(yōu)勢,在保護腸道黏膜、調(diào)節(jié)免疫功能等方面更優(yōu)于PN,主要通過改善腸道黏膜穩(wěn)定性和調(diào)節(jié)腸道菌群等發(fā)揮重要作用[3-5]。目前尚無充分基礎實驗數(shù)據(jù)支持EN治療對BA改善患兒腸黏膜結構及微生態(tài)保護方面的作用。本研究擬探討EN治療對BA幼鼠腸道黏膜結構改善及微生態(tài)保護等方面的作用,為今后開展臨床營養(yǎng)治療BA患兒提供充分的理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1BA幼鼠模型構建 雄性Wistar大鼠(3~4周)80~100 g,術前禁食12 h,禁水4 h,氯胺酮20 mg/kg腹腔注射麻醉,取上腹正中切口,顯露肝十二指腸韌帶,于近肝門處游離并結扎膽總管。假手術組僅做游離但不結扎膽總管。模型制作成功標準:術后3 d采靜脈血檢查血總膽紅素和直接膽紅素,超出正常值5倍為造模成功。將幼鼠置于22~26 ℃,相對濕度40%~70%,通風、安靜的環(huán)境中分籠喂養(yǎng)。PN模型:幼鼠取右頸外側2 cm長切口,游離頸外靜脈,用20針頭于頸前切口作一通向肩胛區(qū)的隧道,將靜脈導管20號針頭自背部引至頸前部,1號線結扎頸外靜脈遠心端,近心端剪一V字形切口將導管向心臟方向插入1.0~1.5 cm,避免過深而進入右心房,抽吸回血后,結扎固定導管,縫合切口,把從肩胛區(qū)引出的靜脈導管順序穿過背扣、保護彈簧及旋轉(zhuǎn)裝置,與限速輸液泵連接。若造模和治療過程中,幼鼠出現(xiàn)死亡再次利用新的BA幼鼠模型補充,進行后續(xù)治療。

    本研究通過醫(yī)院動物倫理委員會批準。

    1.2分組及治療方案 將40只BA幼鼠采用隨機法分為假手術組、PN組、EN組、抗生素組,每組10只,所有幼鼠手術后12 h均予以常規(guī)自由水治療,假手術組和抗生素組用普通飼料打成勻漿后灌胃治療,抗生素組予以氨芐青霉素治療(1 g/L,溶于普通飼料中,美國sigma公司),PN組和EN組分別予以PN和EN治療。PN營養(yǎng)制劑(遼寧海思科制藥有限公司),100%由靜脈營養(yǎng)液提供熱、氮量,微量泵輸注,3.3 mL/h,EN組予以百普素(德國 Milupa GmbH公司)灌胃治療;所有組幼鼠均等熱、等氮治療,保證熱量610 kJ·kg-1·d-1,氮量1.0 g/d;所有組幼鼠于實驗第10天處死。

    1.3觀察指標 體重:于造模前、造模后1、5、10 d稱量3次,取平均值作為當日BA幼鼠的體重;營養(yǎng)指標:血清總蛋白(total protein, TP)、白蛋白(albumin, ALB)于造模后10 d測量,取幼鼠靜脈血,采用血生化儀測量;腸黏膜形態(tài):造模后飼養(yǎng)10 d處死幼鼠,分離組織取小腸組織進行蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin,HE)染色,顯微鏡下觀察小腸黏膜形態(tài)變化,采用顯微測量尺測定黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度;造模10 d后進行細菌培養(yǎng):取幼鼠腸系膜淋巴結組織,粉碎后與LB瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng),37 ℃培養(yǎng)48 h,觀察菌落并計數(shù)。

    1.4統(tǒng)計學方法 應用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗和重復測量的方差分析、LSD-q檢驗、Mann-WhitneyU檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結 果

    2.1BA幼鼠模型不同時間點體重 造模成功后,各組幼鼠的體重均先減輕后增長,與假手術組比較,抗生素組、EN組和PN組體重減輕后增長的較為緩慢,4組組間、時點間、組間與時點間交互作用差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表1。

    表1 不同組別BA幼鼠不同時間點體重比較

    2.2BA幼鼠模型營養(yǎng)狀態(tài) 治療10 d后,與假手術組比較,抗生素組和PN組TP、ALB水平下降,與PN組、抗生素組比較,EN組TP、ALB水平升高,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表2。

    表2 不同組別BA幼鼠營養(yǎng)狀況比較

    2.3BA幼鼠模型腸黏膜形態(tài) 治療10 d后,與假手術組比較,抗生素組和PN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度下降;與抗生素組比較,PN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度上升;與PN組、抗生素組比較,EN組黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度升高,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表3。

    表3 不同組別幼鼠腸道黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度比較

    2.4BA幼鼠模型腸道微生態(tài)分析 治療10 d后,與假手術組比較,抗生素組和PN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量升高,與抗生素組和PN組比較,EN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量下降,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見表4。

    表4 不同組別幼鼠腸道細菌培養(yǎng)比較

    3 討 論

    BA是新生兒梗阻性黃疸的主要原因之一,為小兒最常見的嚴重肝膽外科疾病,早期手術治療改善梗阻情況及手術方式的改良、術后常規(guī)給予抗生素、類固醇藥物等均是以延長BA患兒生存期、減少術后并發(fā)癥為目的[2,5]。膽管炎是BA患兒kasai術后最主要的并發(fā)癥。目前膽管炎的發(fā)生主要與膽汁淤積及排泄障礙、腸道微生物遷移及患兒免疫功能下降有關,可能機制是kasai術后膽汁排泄障礙,膽汁在肝內(nèi)外淤積,細菌通過血液和淋巴液循環(huán)到達吻合口及肝內(nèi)時,淤積的膽汁使得細菌更為順利地定植并繁殖,從而誘發(fā)膽管炎的發(fā)生[6-8]。引發(fā)膽管炎的致病菌多為腸道菌群,以大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等革蘭陰性桿菌為主。腸道黏膜功能受損易引起菌群失調(diào)及菌群的遷移,這些變化可觸發(fā)膽管炎的發(fā)生[9-11]。BA患兒常伴有營養(yǎng)不良、免疫力低下和發(fā)育遲滯,術后消化道功能異??蛇M一步加重營養(yǎng)吸收障礙、免疫功能低下,從而加重細菌遷移感染的易感性,這些因素都與術后不良預后相關。美國危重癥協(xié)會和美國腸外與腸內(nèi)營養(yǎng)學協(xié)會指南中建議胃腸道術后應早期(術后24~48 h)進行EN治療,對早期恢復術后消化道功能具有重要意義[5,11]。

    對于BA幼鼠,同樣常伴有營養(yǎng)不良、腸屏障功能障礙、免疫功能低下等狀況,這些狀況易引起腸道細菌移位,甚至發(fā)生腸源性感染。在大鼠膽總管結扎的BA模型中,腸道呈水腫和炎癥性病變,可形成腸上皮間隙,腸黏膜緊密連接降低,分泌性免疫蛋白下降,黏膜上細菌附著增加,營養(yǎng)吸收障礙,這些均可誘導腸道炎癥,進而誘發(fā)BA術后膽管炎發(fā)生[7]。既往動物實驗研究提示高脂EN可減輕腹膜空氣暴露后腸黏膜屏障損傷,其機制可能與其抗氧化作用有關[12]。亦有研究指出在大鼠腸缺血/再灌注損傷模型中,富含脂質(zhì)的腸內(nèi)營養(yǎng)可以控制腸道炎癥,改善腸道運動和黏膜屏障損傷[13]。但EN治療能否改善BA幼鼠模型伴發(fā)的腸道屏障功能障礙、營養(yǎng)不良等病變目前尚無動物實驗研究。本研究通過分析早期EN治療對BA幼鼠腸黏膜結構改善及微生態(tài)保護方面的作用,本研究顯示,BA造模成功后,與假手術組比較,BA幼鼠模型術后體重明顯下降,營養(yǎng)狀況更差,腸黏膜損害嚴重(黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度下降),腸道菌群感染增多,考慮BA易引起腸道黏膜結構稀疏,造成膜屏障的損害,可促進細菌移位及大量繁殖,這些變化與既往BA幼鼠模型較為一致[8]。既往研究提示,短期預防性靜脈注射抗生素可能導致早期膽管炎,這可能導致較高的膽管炎發(fā)生率[11]。在本研究中,與PN組比較,抗生素組腸道黏膜功能下降,腸道致病菌群稍升高,考慮長時間抗生素治療可引起腸道菌群紊亂,PN營養(yǎng)治療可能改善腸道黏膜屏障和調(diào)節(jié)腸道菌群有關。

    本研究結果顯示,與抗生素組和PN組比較,EN治療能夠明顯改善BA幼鼠TP、ALB等營養(yǎng)狀態(tài)指標,明顯增加幼鼠體重。在改善腸道黏膜結構方面,BA組動物腸黏膜厚度、腺隱窩深度、絨毛高度水平均有明顯升高,這些改變可能與早期EN治療刺激胃腸激素合成和釋放,有利于腸道營養(yǎng)吸收,促進腸蠕動和黏膜增生,維持黏膜完整性,利于營養(yǎng)物質(zhì)吸收有關[12-13]??梢?,腸內(nèi)營養(yǎng)制劑在改善BA幼鼠腸道黏膜結構、功能和營養(yǎng)狀況方面發(fā)揮著重要作用。

    微生態(tài)在BA幼鼠的腸道功能維持中亦發(fā)揮著中重要作用,細菌遷移可引起腸道菌群失調(diào),參與了BA幼鼠kasai術后并發(fā)癥的發(fā)生[14-15]。本研究分析顯示,與抗生素組和PN組比較,EN組大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌數(shù)量明顯下降,提示EN治療能夠有效抑制大腸埃希菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯桿菌等致病菌的繁殖,EN治療抑制致病菌繁殖的原因可能是由于EN治療改善了BA幼鼠的營養(yǎng)狀態(tài),通過有效地營養(yǎng)免疫調(diào)節(jié)作用穩(wěn)定了腸道微生態(tài),使腸道菌群維持平衡。有學者通過人群試驗研究結果顯示,早期EN支持可以有效降低腸道黏膜損傷程度,調(diào)節(jié)腸道菌群失衡,降低感染及死亡風險[16]。另有研究證明,EN治療的胰腺炎患者腸道中的乳酸桿菌、雙歧桿菌水平明顯高于對照組[17]。上述研究均表明EN治療在抑制致病菌、增加有益菌方面起到了重要作用。本研究尚未對幼鼠腸道營養(yǎng)治療后的炎性指標檢測,由于抗生素治療可能對其炎性指標的影響,尚未對組間的炎性指標進行分析,今后會進一步分析早期EN治療對BA幼鼠的炎性指標的影響,為指導BA的治療提供重要參考依據(jù)。目前只是初步評價早期腸內(nèi)營養(yǎng)治療對BA小鼠的腸道微生態(tài)研究,尚未對腸黏膜屏障分子的檢測,今后需進一步檢測腸道組織中GFAP、S100β、ZO-1、claudin-1等腸黏膜相關指標,更為精準判斷早期腸內(nèi)營養(yǎng)治療的療效。

    綜上所述,對于BA幼鼠,EN治療能夠有效改善胃腸道黏膜結構、功能,有效改善BA幼鼠營養(yǎng)狀況,穩(wěn)定腸道微生態(tài),為EN治療BA患兒提供了重要的參考依據(jù)。

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