長(zhǎng)鏈非編碼RNA LINC00662靶向微小RNA-103a-3p對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖和周期的影響

郭春輝，梁科峰，張小偉

皮膚黑色素瘤在皮膚惡性腫瘤中排行第三，大約占皮膚癌的10%，具有高侵襲、惡化程度高、預(yù)后差等特點(diǎn)［1-2］。據(jù)報(bào)道，在亞洲國(guó)家黑色素瘤的發(fā)病率遠(yuǎn)低于歐非國(guó)家，而現(xiàn)在中國(guó)黑色素瘤新發(fā)現(xiàn)的病例以每年約2萬(wàn)例的趨勢(shì)上升［3-5］。目前關(guān)于黑色素瘤的治療首選還是以臨床外科治療為主，以延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間［6］。雖然黑色素瘤在治療方面取得了較大的進(jìn)展，但是其發(fā)病率和死亡率依然居高不下［7］。因此，需要尋找與皮膚黑色素治療相關(guān)的新靶標(biāo)以及分子機(jī)制。

大多數(shù)研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNAs，LncRNAs）和miRNA（MicroRNAs）在人類(lèi)疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［8-9］，且長(zhǎng)鏈非編碼RNA可以通過(guò)調(diào)控miRNA的表達(dá)參與癌癥細(xì)胞的增殖、凋亡、周期和轉(zhuǎn)移等。研究表明，LINC00662在結(jié)腸癌［9］、宮頸癌［11］、肺癌［12］、胃癌［13］等腫瘤中有相關(guān)的報(bào)道，而在皮膚黑色素瘤中的表達(dá)和作用機(jī)制研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究通過(guò)生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)了LINC00662的3’UTR存在miR-103a-3p連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。有研究表明，miR-103a-3p在肺癌中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miR-103a-3p能夠抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移等［14］。楊雨澎等［15］研究表明，過(guò)表達(dá)miR-103a-3p抑制肝癌細(xì)胞的增殖、阻止細(xì)胞周期阻滯。關(guān)于LINC00662和miR-103a-3p在皮膚黑色素瘤中功能尚不清楚。因此，本研究于2018年10月至2020年2月，以黑色素瘤為研究對(duì)象，觀察沉默LINC00662、抑制miR-103-a-3p對(duì)黑色素瘤細(xì)胞增殖、周期的影響，為黑色素瘤的治療提供新的作用靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料皮膚黑色素瘤組織及正常組織的樣本均從平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院于2018年10月至2020年2月確診的26例皮膚黑色素瘤病人中獲得，切除后立即存放到液氮中，-80℃保存，直至實(shí)驗(yàn)使用。所有病人或其近親屬知情同意，且本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 試劑與細(xì)胞人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP均購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)細(xì)胞庫(kù)；10%胎牛血清、青霉素、鏈霉素購(gòu)自美國(guó)Gibco公 司 ；小 干 擾RNA陰 性 對(duì) 照（si-NC）、LINC00662小干擾RNA（si-LINC00662）、miRNA抑制劑陰性對(duì)照（anti-miR-NC）和miR-103a-3p抑制劑（anti-miR-103a-3p）購(gòu)于上海吉瑪公司；LipofectamineTM2000試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、CCK-8試劑盒、RIPA緩沖液均購(gòu)自上海碧云天生物科技有限公司；細(xì)胞周期蛋白1（Cyclin D1）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染將解凍后的人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375、A875、B16、SK-MEL-2和HEMa-LP分別接種于含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素于5%二氧化碳37℃條件下培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期A375細(xì)胞，接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，密度為2.5×105，待細(xì)胞密度融合至70%～80%時(shí)，按照LipofectamineTM2000試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，分別將si-NC、si-LINC00662、anti-miR-NC和anti-miR-103a-3p轉(zhuǎn)染至A375細(xì)胞。然后隨機(jī)分四組：si-NC組、si-LINC00662組、si-LINC00662+antimiR-NC組 和si-LINC00662+anti-miR-103a-3p組。轉(zhuǎn)染48 h后，檢查轉(zhuǎn)染效率。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)LINC00662和-miR-103a-3p表達(dá)水平按照Trizol法提取各組A375細(xì)胞的總RNA，測(cè)定濃度和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟進(jìn)行合成cDNA，按照實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒步驟進(jìn)行操作。LINC00662正向引物為：5'-TGGACATCTGTCTGGAGG-3'，反向引物為：5'-GGCTGAGGCATAAGAATCG-3'；β-actin正 向 引 物 為 ：5'-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAG-3'；反向引物為：5'-TGTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3'；miR-103a-3p正向引物為：5′-ACACTCCAGCTGGGAGCAGCATTGTACAGGG-3′，反向引物為：5′-TGGTGTCGCGTGGAGTCG-3′；U6正 向 引 物 為 ：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 向 引 物 為 ：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。LINC00662和miR-103a-3p分別以β-actin和U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00662和miR-103a-3p表達(dá)水平。

1.5 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖收集A375細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，加入到96孔板中，5×103個(gè)/孔，并設(shè)置6個(gè)重復(fù)。分別在培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時(shí)，每孔加入10 μL CCK-8溶液，孵育4 h。按照CCK-8試劑盒步驟進(jìn)行操作，使用酶標(biāo)儀在450 nm下檢測(cè)光密度（OD）值。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期收集轉(zhuǎn)染48 h后的A375細(xì)胞，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，PBS重懸細(xì)胞，4℃靜置24 h后，離心棄上清，PBS洗滌2次，1 000 μL PBS重懸，轉(zhuǎn)管，室溫下Annexin-V-FITC和PI進(jìn)行染色15 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期情況。

1.7 Western blotting檢測(cè)Cyclin D1、PCNA表達(dá)使用RIPA緩沖液試劑盒提取A375細(xì)胞的總蛋白，用BCA法檢查蛋白的濃度。經(jīng)10%SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉2 h，取膜，4℃標(biāo)記一抗過(guò)夜孵育，PBS清洗3次，1 h室溫下進(jìn)行二抗孵育，取膜。PBS清洗3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光液，顯色，曝光。計(jì)算分析Cyclin D1和PC-NA蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證靶向關(guān)系將構(gòu)建的LINC00662-WT（突變型）和LINC00662-MUT（野生型）載體，分別將miR-NC或miR-103a-3p轉(zhuǎn)染到A375細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，加入裂解液，離心收集上清，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢查系統(tǒng)檢測(cè)熒光速酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與作圖，數(shù)據(jù)表示均為3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的，兩組間比較通過(guò)t檢驗(yàn)，多組間比較通過(guò)單因素方差分析。通過(guò)Pearson分析兩組之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00662在皮膚黑色素瘤的組織和細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組織1.24±0.50相比，皮膚黑色素瘤組織的LINC00662表達(dá)4.17±1.27，顯著升高（t=10.95，P＜0.001），而人皮膚黑色素瘤 細(xì) 胞 株A375、A875、B16和SK-MEL-2中 的LINC00662的 表 達(dá)量（5.62±0.43、5.01±0.83、2.94±0.53、4.97±0.43）均 顯著高于HEMa-LP細(xì)胞1.00±0.07（F=40.91，P＜0.001）。

2.2 沉默LINC00662對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖和周期的影響結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00662組的LINC00662表達(dá)、細(xì)胞增殖水平顯著降低（表1）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，相較于si-NC組 ，si-LINC00662組G0/G1期 的 細(xì) 胞 比 例 增多、S期細(xì)胞比例減少。

表1 沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞增殖的影響/

表1 沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞增殖的影響/

組別si-NC si-LINC00662 t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 LINC00662 1.00±0.06 0.48±0.06 10.61＜0.001 OD值0 h 0.29±0.04 0.28±0.04 0.31 0.775 24 h 0.52±0.03 0.38±0.04 4.85 0.008 48 h 0.71±0.05 0.50±0.08 3.86 0.018 72 h 0.84±0.04 0.59±0.07 5.37 0.006

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-LINC00662組的Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)顯著降低，見(jiàn)表2，圖1。

圖1 各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

表2 沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

表2 沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的影響/

注：Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白1，PCNA為增殖細(xì)胞核抗原。

組別si-NC si-LINC00662 t值P值重復(fù)次數(shù)33 G0/G1 57.4±5.2 74.7±4.8 4.23 0.013 S 34.7±3.5 20.5±3.0 5.34＜0.001 G2/M 7.8±0.6 7.4±0.5 0.89 0.425 PCNA 0.99±0.05 0.53±0.06 10.20 0.001 Cyclin D1 1.00±0.01 0.56±0.06 12.53＜0.001

2.3 miR-103a-3p在黑色素瘤組織和細(xì)胞中的表達(dá)qRT-PCR檢測(cè)顯示，與正常組織1.17±0.32相比，黑色素瘤組織中的miR-103a-3p為0.64±0.21，明顯降低（t=7.06，P＜0.001）；而人皮膚黑色素瘤細(xì)胞株A375、A875、B16和SK-MEL-2的miR-103a-3p的表 達(dá) 水 平（0.32±0.04、0.38±0.03、0.59±0.10、0.40±0.06）均 顯 著 低 于HEMa-LP細(xì) 胞0.99±0.04（F=63.25，P＜0.001）。

2.4 LINC00662與miR-103a-3p靶向結(jié)合利用在線軟件Starbase預(yù)測(cè)LINC00662與miR-103a-3p靶向結(jié)合位點(diǎn)（圖2），雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證其靶向關(guān)系，結(jié)果顯示，miR-103a-3p顯著降低了LINC00662-WT的螢光素酶活性，但對(duì)LINC00662-MUT的熒光素酶活性無(wú)明顯影響（表3）。對(duì)LINC00662和miR-103a-3p進(jìn)行相關(guān)分析，顯示LINC00662和miR-103a-3p負(fù)相關(guān)。

圖2 Starbase軟件預(yù)測(cè)LINC00662與miR-103a-3p靶向結(jié)合位點(diǎn)

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC00662與miR-103a-3p靶向關(guān)系/

表3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證LINC00662與miR-103a-3p靶向關(guān)系/

組別miR-NC miR-103a-3p t值P值重復(fù)次數(shù)3 3 LINC00662-WT 1.01±0.02 0.46±0.05 17.69＜0.001 LINC00662-MUT 0.99±0.07 0.99±0.06 0.00＞0.999

2.5抑制miR-103a-3p部分回復(fù)了沉默LINC00662對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞增殖和周期的影響qRT-PCR結(jié)果顯示，si-LINC00662組的miR-103a-3p的表達(dá)明顯高于si-NC組（表4）。與si-LINC00662+anti-miR-NC相 比，si-LINC00662+antimiR-103a-3p組的miR-103a-3p表 達(dá) 降低、G0/G1期細(xì)胞比例減少，細(xì)胞增殖水平升高、S期細(xì)胞比例增加以及Cyclin D1、PCNA蛋白表達(dá)也明顯升高（圖3，表5）。

表4 抑制miR-103a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞的增殖作用/

表4 抑制miR-103a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞的增殖作用/

注：①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3 3 3 3 miR-103a-3p 1.00±0.06 1.83±0.20①1.86±0.07 1.33±0.07②38.75＜0.001 OD值0 h 0.33±0.02 0.31±0.05 0.28±0.04 0.31±0.04 0.84 0.511 24 h 0.54±0.06 0.40±0.05 0.42±0.05 0.47±0.05 4.21 0.046 48 h 0.74±0.03 0.52±0.03①0.55±0.05 0.68±0.05②19.34 0.001 72 h 0.93±0.03 0.58±0.06①0.64±0.05 0.78±0.05②30.77＜0.001

表5 抑制miR-103a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的作用/

表5 抑制miR-103a-3p逆轉(zhuǎn)了沉默LINC00662對(duì)細(xì)胞周期和增殖相關(guān)蛋白表達(dá)的作用/

注：PCNA為增殖細(xì)胞核抗原，Cyclin D1為細(xì)胞周期蛋白1。①與si-NC組比較，P＜0.05。②與si-LINC00662+anti-miR-NC組比較，P＜0.05。

組別si-NC si-LINC00662 si-LINC00662+anti-miR-NC si-LINC00662+anti-miR-103a-3p F值P值重復(fù)次數(shù)3333 G0/G1 55.8±2.4 70.1±3.2①71.1±4.1 59.2±1.8②19.74＜0.001 S 36.2±2.5 21.8±2.8①21.5±2.5 32.7±3.0②23.18＜0.001 G2/M 8.0±0.6 8.1±0.8 7.4±1.1 8.0±0.5 0.50 0.693 PCNA 1.00±0.05 0.51±0.05①0.48±0.06 0.69±0.08②45.60＜0.001 Cyclin D1 0.99±0.06 0.52±0.01①0.51±0.07 0.73±0.05②55.09＜0.001

圖3 各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

皮膚黑色素瘤是由黑色素細(xì)胞中的黑色素生成的，是一種常見(jiàn)的惡性皮膚腫瘤，處于晚期的皮膚黑色素病人，目前尚無(wú)有效的治療途徑［16］。lncRNA在惡性黑色素瘤的細(xì)胞功能研究中起著至關(guān)重要的作用。有研究表明，抑制lncRNA TUG1表達(dá)能以抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)［17］。袁春蓉、劉勇寧［18］研究表明，SNHG3通過(guò)調(diào)節(jié)miR-186-5p，抑制黑色素瘤的生長(zhǎng)。lncRNA-MEG3在黑色素瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，與不良的預(yù)后顯著相關(guān)，通過(guò)miR-499-5p的過(guò)表達(dá)抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖和細(xì)胞 周 期 阻 滯［9］，這 與 前 人 的 研 究 結(jié) 果［18］相 反 。LINC00662作為新發(fā)現(xiàn)LncRNA，有研究表明，通過(guò)Linc00662在前列腺細(xì)胞表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)細(xì)胞的增殖［20］。王君蓮等［11］研究表明，LINC00662通過(guò)miR-409-5p在宮頸癌中發(fā)揮著致癌作用。LINC00662在結(jié)腸癌中表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)LINC00662通過(guò)上調(diào)miR-340-5p的表達(dá)，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)［21］。以上研究表明LINC00662在癌癥中發(fā)揮著重要作用。

本研究結(jié)果表明，與正常組織和皮膚黑色素細(xì)胞，通過(guò)檢測(cè)LINC00662表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)皮膚黑色素瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)，表明LINC00662可能在皮膚黑色素瘤組織中發(fā)揮著一定的作用。進(jìn)一步研究表明，沉默LINC00662的表達(dá)，與si-NC組相比，LINC00662表達(dá)水平降低，細(xì)胞增殖受到抑制，細(xì)胞G0/G1期的細(xì)胞比例增多、S期細(xì)胞比例減少，與增殖、周期相關(guān)蛋白Cyclin D1、PCNA表達(dá)水平降低。lncRNA可以海綿吸附下游的miRNA，調(diào)控miRNA的表達(dá)進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展［22］。有研究表明，AGAP2-AS1通過(guò)調(diào)節(jié)下游miR-16-5p，促進(jìn)肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)［23］。為了進(jìn)一步探究LINC00662在皮膚黑色素瘤中調(diào)控的下游靶基因，本研究通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件和雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了LINC00662與miR-103a-3p可以靶向結(jié)合，且呈負(fù)相關(guān)。有研究表明 ，LINC00662靶 向 調(diào) 控miR-497-5p表 達(dá) ，抑 制LINC00662的表達(dá)可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞生長(zhǎng)，阻滯細(xì)胞周期［24］。在骨肉瘤的研究中，LINC00662表達(dá)上調(diào)，通過(guò)干擾LINC00662調(diào)控miR-15a-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞的增殖、遷移等［25］。miR-103a-3p，也可稱為miR-103，可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞分子機(jī)制，如增殖、凋亡、周期等［26-27］。有研究表明，過(guò)表達(dá)miR-103a-3p可以抑制甲狀腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［14，28］。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組織和皮膚黑色素細(xì)胞，miR-103a-3p在皮膚黑色素瘤組織和細(xì)胞株中的表達(dá)下調(diào)，這與多人的研究結(jié)果一致，在此證實(shí)了miR-103a-3p在癌癥中的抑癌作用。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，抑制miR-103a-3p可以逆轉(zhuǎn)沉默LINC00662對(duì)皮膚黑色素瘤細(xì)胞的增殖、周期的影響，說(shuō)明LINC00662可以通過(guò)調(diào)控miR-103a-3p的表達(dá)進(jìn)而影響皮膚黑色素瘤中的作用。

綜上所述，沉默lncRNA LINC00662的表達(dá)可以抑制皮膚黑色素瘤的增殖，以及細(xì)胞周期阻滯，其機(jī)制可能與miR-103a-3p有關(guān)，為皮膚黑色素的靶向治療提供合理依據(jù)。