長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3、微小RNA-21表達(dá)與冠狀動(dòng)脈鈣化的相關(guān)性分析

汪化文，申侖，張紹義，郭淑娟

冠狀動(dòng)脈鈣化是鈣鹽在冠狀動(dòng)脈壁上沉積的病理改變［1］。研究表明，鈣化是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓等疾病的共同的標(biāo)志性病理表現(xiàn)［2-3］。鈣化在一定程度上可預(yù)示冠心病的發(fā)生和嚴(yán)重程度，也是病人發(fā)生心肌梗死等急性心血管事件的重要預(yù)測(cè)因素［4］。因此早期篩查冠狀動(dòng)脈鈣化對(duì)預(yù)防心血管疾病發(fā)生有重要意義。研究認(rèn)為，炎癥反應(yīng)增加是冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的重要影響因素。有研究表明，長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3（LncRNA MEG3）在動(dòng)脈粥樣硬化病人血漿中表達(dá)下調(diào)，與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）等炎性因子分泌增加有關(guān)，可能通過(guò)影響炎癥反應(yīng)參與疾病進(jìn)展調(diào)節(jié)［5］。心肌梗死模型小鼠心肌組織中微小RNA-21（miR-21）表達(dá)顯著升高，與單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的TNF-α、IL-1β等炎性因子表達(dá)水平升高密切相關(guān)，可調(diào)控小鼠心臟功能障礙［6］。由于LncRNA MEG3、miR-21在冠狀動(dòng)脈鈣化進(jìn)展中研究較少，且LncRNA MEG3與miR-21在其他疾病中已被證實(shí)有相互作用機(jī)制［7］，本研究擬通過(guò)檢測(cè)血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平，分析二者與冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生關(guān)系，并探究二者對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的評(píng)估價(jià)值，以期為臨床早期準(zhǔn)確評(píng)估冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生發(fā)展提供一定幫助。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2018年6月至2019年6月在邯鄲市中心醫(yī)院行冠狀動(dòng)脈造影及CT檢查確診為冠狀動(dòng)脈鈣化病人189例作為研究對(duì)象（鈣化組），其中男性104例，女性85例，年齡（61.58±8.13）歲，范圍51～73歲。另選取同期在該院行冠狀動(dòng)脈造影及CT檢查顯示無(wú)冠狀動(dòng)脈鈣化者183例作為未鈣化組，其中男性94例，女性89例，年齡（60.69±7.82）歲，范圍49～72歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①鈣化組Agatston積分＞0分［8］；②未鈣化組Agatston積分=0［8］；③臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并患有心肌梗死、嚴(yán)重心力衰竭者；②肝、腎功能?chē)?yán)重不足者；③合并患有感染性疾病、甲狀腺疾病、惡性腫瘤者。本研究獲邯鄲市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)20180425），病人或其近親屬對(duì)研究方案簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器和試劑實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRTPCR）儀（美國(guó)ABI公司，型號(hào)7500）、RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)RP2401）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Qiangen公司，貨號(hào)205311）、qRT-PCR試劑盒（美國(guó)Qiangen公司，貨號(hào)208152）、TNF-α酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（德國(guó)IBL公司，貨號(hào)JK-00018）、IL-1β ELISA試劑盒（德國(guó)IBL公司，貨號(hào)BE45111）。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集 所有受試者于入院檢查時(shí)清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，在4℃、3 000 r/min（離心半徑14.5 cm）條件下離心10 min，收集上清液（即血清）于無(wú)菌EP管中，在-80℃環(huán)境下保存。

1.3.2 一般資料收集 所有受試者于入院檢查時(shí)收集年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、血鈣、血磷、血肌酐（SCr）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、高敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）等一般資料。

1.3.3 血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR法檢測(cè)血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平。采用Trizol法提取總RNA后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用于qRTPCR。qRT-PCR 20 μL反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，SYBR?Primix Ex TaqTM10 μL，ROX 0.4 μL，DEPC水3.6 μL。反應(yīng)步驟如下：95℃、8 min，1個(gè)循環(huán)；95℃、15 s，62℃、38 s，73℃、15 s，40個(gè)循環(huán)，一個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。采用2-ΔΔCt法計(jì)算LncRNA MEG3、miR-21相對(duì)表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.4 血清TNF-α、IL-1β表達(dá)水平檢測(cè) 采用ELSIA法檢測(cè)血清TNF-α、IL-1β表達(dá)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法使用SPSS 19.0軟件對(duì)本文中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，用χ2檢驗(yàn)；采用Pearson法分析冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平及與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關(guān)性；采用logistic回歸模型分析冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的影響因素；采用受試者工作特征曲線(xiàn)（ROC）評(píng)估血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鈣化組與未鈣化組一般資料比較鈣化組與未鈣化組年齡、BMI、血鈣、血磷、SCr、TC、TG、HDL-C、LDL-C水平及性別、糖尿病、高血脂癥比例比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。鈣化組血清HbA1c、hs-CRP水平及冠心病、高血壓比例均明顯高于未鈣化組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.2 鈣化組與未鈣化組血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平鈣化組病人血清LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于未鈣化組，血清miR-21、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平明顯高于未鈣化組（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 冠狀動(dòng)脈鈣化189例與無(wú)冠狀動(dòng)脈鈣化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較/

表3 冠狀動(dòng)脈鈣化189例與無(wú)冠狀動(dòng)脈鈣化183例血清LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β表達(dá)水平比較/

注：LncRNA MEG3為長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3，miR-21為微小RNA-21，TNF-α為腫瘤壞死因子-α，IL-1β為白細(xì)胞介素-1β。

組別鈣化組未鈣化組t值P值例數(shù)189 183 LncRNA MEG3 0.62±0.17 1.01±0.31 15.11＜0.001 miR-21 2.87±0.93 1.02±0.29 25.73＜0.001 TNF-α/（ng/L）11.72±3.92 9.82±4.13 4.55＜0.001 IL-1β/（ng/L）4.96±0.95 2.32±0.74 29.84＜0.001

2.3 冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達(dá)水平相關(guān)性冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.32，P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清長(zhǎng)鏈非編碼RNA母系表達(dá)基因3（LncRNA MEG3）與微小RNA-21（miR-21）表達(dá)水平相關(guān)性

2.4 冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關(guān)性冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNAMEG3與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈負(fù)相關(guān)，血清miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相關(guān)（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平與HbA1c、hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平相關(guān)性

2.5 冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的影響因素分析以本研究資料為樣本，以是否發(fā)生冠狀動(dòng)脈鈣化為因變量（發(fā)生=1，未發(fā)生=0），以表2，表3中兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）的冠心病、高血壓及HbA1c、hs-CRP、LncRNA MEG3、miR-21、TNF-α、IL-1β水平等8個(gè)指標(biāo)為自變量建立logistic回歸模型，通過(guò)采用方差膨脹因子分析自變量之間的多重共線(xiàn)性分析顯示，本研究所納入的自變量方差膨脹因子均＜10，所以不存在多重共線(xiàn)性，可進(jìn)行l(wèi)ogistic回歸分析。經(jīng)二元logistic回歸分析顯示，冠心病、LncRNA MEG3水平、miR-21水平是影響冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的危險(xiǎn)因素（P＜0.05）。見(jiàn)表5。

表2 冠狀動(dòng)脈鈣化189例與無(wú)冠狀動(dòng)脈鈣化183例一般資料比較

表5 冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的影響因素的logistic回歸分析

2.6 血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值分析血清LncRNA MEG3預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化的曲線(xiàn)下面積為0.84［95%CI：（0.79，0.87）］，當(dāng)血清LncRNA MEG3取截?cái)嘀?.83時(shí)，其診斷靈敏度為78.19%，特異度為87.43%。血清miR-21預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化的曲線(xiàn)下面積為0.82［95%CI：（0.78，0.86）］，當(dāng)血清miR-21取截?cái)嘀?.81時(shí)，其診斷靈敏度為81.48%，特異度為73.77%。血清LncRNA MEG3、miR-21聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化的曲線(xiàn)下面積為0.88［95%CI：（0.84，0.91）］，靈敏度為84.13%，特異度為85.79%。見(jiàn)圖2。

圖2 血清LncRNA MEG3、miR-21表達(dá)水平對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化的預(yù)測(cè)價(jià)值的ROC曲線(xiàn)

3 討論

血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是血管鈣化發(fā)生的重要機(jī)制，在炎癥反應(yīng)刺激下，來(lái)源于間充質(zhì)干細(xì)胞的血管平滑肌細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為成骨細(xì)胞，通過(guò)產(chǎn)生骨基質(zhì)蛋白促進(jìn)礦化進(jìn)程并沉積于血管［9］。表明炎癥反應(yīng)增加和血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化是冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的重要影響因素。

LncRNA MEG3是一種長(zhǎng)度大于200 nt的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，已被證實(shí)可通過(guò)調(diào)控相關(guān)通路在腫瘤進(jìn)展中起抑制作用［10］。Bai等［11］研究發(fā)現(xiàn)，冠心病病人動(dòng)脈組織中LncRNA MEG3表達(dá)水平下調(diào)，過(guò)表達(dá)LncRNA MEG3可通過(guò)抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡參與動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展調(diào)控。本研究結(jié)果顯示，鈣化組病人血清LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯低于未鈣化組，提示LncRNA MEG3在冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生時(shí)呈低表達(dá)，可能與血管平滑肌細(xì)胞代謝異常有關(guān)。有研究報(bào)道，LncRNA MEG3在肺部細(xì)菌感染小鼠模型中下調(diào)，過(guò)表達(dá)時(shí)可靶向抑制IL-1β等炎性因子表達(dá)減緩小鼠的肺部炎癥反應(yīng)［12］。強(qiáng)直性脊柱炎病人血清中LncRNA MEG3低表達(dá)，可靶向TNF-α、IL-1β發(fā)揮抗炎作用［13］。本研究中，冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與hs-CRP、TNF-α、IL-1β 水平呈負(fù)相關(guān)，提示LncRNA MEG3可能通過(guò)調(diào)控hs-CRP、TNF-α、IL-1β等炎性因子表達(dá)促進(jìn)炎癥反應(yīng)進(jìn)展，進(jìn)而影響血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化等促進(jìn)冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生。

miR-21是一種短鏈非編碼RNA，在乳腺癌、高血壓腎損害等疾病中具有調(diào)控作用［14-15］。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-21可通過(guò)調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移影響血管內(nèi)皮功能［16］。Vahed等［17］研究報(bào)道，冠脈狹窄病人外周血單個(gè)核細(xì)胞中miR-21表達(dá)水平明顯升高，可能通過(guò)影響血管生成、白細(xì)胞黏附、炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程促進(jìn)冠脈疾病的發(fā)生和進(jìn)展。本研究結(jié)果顯示，與未鈣化組相比，鈣化組血清miR-21表達(dá)水平明顯升高，提示miR-21表達(dá)水平上調(diào)可能預(yù)示冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生。有研究表明，miR-21可通過(guò)調(diào)控骨橋蛋白等表達(dá)影響血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，參與動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展［18］。推測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生時(shí)miR-21高表達(dá)可能與血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有關(guān)。又有研究表明，miR-21定位于心臟組織中的炎性細(xì)胞，是急性心臟損傷大鼠心臟炎癥浸潤(rùn)的潛在生物標(biāo)志物［19］。膿毒癥病人外周血中miR-21表達(dá)水平升高，可能靶向激活NLRP3等炎性小體分泌TNF-α、IL-1β等炎性因子介導(dǎo)脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞焦亡過(guò)程［20-21］。本研究結(jié)果顯示，血清miR-21與hs-CRP、TNF-α、IL-1β水平呈正相關(guān)，提示miR-21在冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生進(jìn)展中可能通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)增加誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化等。

Zhu等［7］研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3在肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，正常或缺氧狀態(tài)下抑制MEG3均可通過(guò)靶向調(diào)控miR-21/PTEN表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3與miR-21表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，提示LncRNA MEG3在參與冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生時(shí)可能通過(guò)影響miR-21表達(dá)發(fā)揮作用，但具體機(jī)制尚需進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA MEG3、miR-21水平均是影響冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的危險(xiǎn)因素，血清LncRNA MEG3、miR-21聯(lián)合檢測(cè)預(yù)測(cè)冠狀動(dòng)脈鈣化的曲線(xiàn)下面積為0.88，靈敏度為84.13%，特異度為85.79%，提示二者對(duì)冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生的預(yù)測(cè)價(jià)值較高，臨床可關(guān)注二者變化，以提高冠狀動(dòng)脈鈣化的早期診出率。

綜上所述，冠狀動(dòng)脈鈣化病人血清LncRNA MEG3表達(dá)水平明顯降低，miR-21表達(dá)水平明顯升高，二者可能作為生物標(biāo)志物，共同預(yù)示冠狀動(dòng)脈鈣化發(fā)生。但由于本研究?jī)H從表達(dá)層面分析二者在冠狀動(dòng)脈鈣化中的作用，具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步進(jìn)行動(dòng)物、細(xì)胞等實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。