過表達微小RNA-877-5p通過靶向叉頭框轉錄因子M1調(diào)控胃癌細胞活力和凋亡

張榮，姚春和

胃癌的診斷和治療當前有了很大改善，但手術切除后腫瘤轉移頻繁和腫瘤復發(fā)率仍然較高，晚期胃癌病人的預后較差［1-2］。因此，闡明胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，尋找新的生物標志物，開發(fā)靶向治療手段勢在必行。微小RNA（microRNA，miRNA，miR）是內(nèi)源性非編碼RNA（長度約為22 nt），通過降解靶mRNA或阻斷其翻譯，轉錄后調(diào)節(jié)基因表達，并作為癌基因或抑癌基因發(fā)揮作用［3］。越來越多的證據(jù)表明，miRNA參與腫瘤包括胃癌的發(fā)生發(fā)展過程［4］。研究表明，miR-877-5p在膠質瘤和肝癌組織、細胞中低表達［5］，且過表達miR-877-5p可抑制肝癌細胞的增殖、遷移和侵襲［6］。但miR-877-5p在胃癌細胞中的表達，以及對胃癌細胞增殖和凋亡的影響和機制，目前還尚未可知。因此，本研究自2020年1—7月通過評估m(xù)iR-877-5p在胃癌細胞生長和凋亡中的作用，旨在闡明其潛在機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料胃癌細胞株HGC-27、SUN-1、AGS和正常胃黏膜上皮細胞株GES-1購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）。RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自美國Gibco公司；miR-877-5p模擬物/抑制物、模擬物陰性對照（miR-NC）/抑制物陰性對照（anti-miRNC）、FOXM1小干擾RNA（si-FOXM1）、小干擾RNA陰性對照si-NC、FOXM1過表達載體（pcDNAFOXM1）、陰性對照pcDNA購自武漢淼靈生物科技有限公司；實時定量基因擴增熒光檢測（qPCR）試劑盒購自美國ThermoFisher公司；胰酶、MTT、RIPA裂解液購自美國Sigma公司；抗FOXM1、細胞周期蛋白D1（cyclinD1）、細胞周期依賴性激酶抑制因子p21與p27、B細胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/lewkmia-2，Bcl-2）、Bcl-2相關X蛋白（bcl-2 associated X protein，Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved-caspase 3）蛋白抗體購自美國Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL發(fā)光檢測試劑盒、雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術研究所。酶標儀購自德國Eppendorf公司，BD FACSCalibur流式細胞儀購自美國Beckman公司。本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與脂質體轉染HGC-27、SUN-1、AGS和GES-1細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱中（37℃、5%二氧化碳）培養(yǎng)。觀察細胞達到80%融合度的生長狀態(tài)時，加入胰酶，消化并接種傳代。

胃癌HGC-27細胞轉染時，將生長狀態(tài)良好的HGC-27細胞接種于6孔板，細胞密度為1×105個/毫升。利用Lipofectamine 2000試劑，在融合度大于70%的HGC-27細胞中轉染miR-877-5p模擬物、miR-NC，si-FOXM1、si-NC，共轉染miR-877-5p模擬物和pcDNA-FOXM1、共轉染miR-877-5p和FOXM1過表達載體陰性對照（pcDNA），分別記為miR-877-5p組、miR-NC組、si-FOXM1組、si-NC組、miR-877-5p+pcDNA-FOXM1組和miR-877-5p+pcDNA組。培養(yǎng)48 h，收集細胞用于后續(xù)指標檢測。

1.2.2 qPCR檢 測miR-877-5p和FOXM1 mRNA表達TRIzol試劑提取HGC-27、SUN-1、AGS和GES-1細胞總的RNA，并逆轉錄為互補核糖核酸（cDNA），以cDNA為模板，U6為參照，進行qPCR反應。miR-877-5p的正向引物序列為5'-GGGGACACGGGCAAAGACT-3'，反向引物序列為5'-GAGGACACACGTCTGAGGGTC-3'；FOXM1的 正向 引 物序列 為5'-GGAGGAAATGCCACACTTAGCG-3'，反 向引物序列為5'-TAGGACTTCTTGGGTCTTGGGGTG-3'。收集反應結束后得到的Ct值，根據(jù)2-ΔΔCt方法計算miRNA和mRNA的表達。

1.2.3 蛋白質印跡法檢測蛋白的表達HGC-27細胞總蛋白的提取通過RIPA裂解液進行，吸取蛋白樣品進行10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，之后用5%脫脂奶粉常溫封閉PVDF膜1 h，加入1∶1 000稀釋的抗FOXM1、CyclinD1、p21、p27、Bcl-2、Bax、cleaved-caspase3Ⅰ抗，同時加入抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）Ⅰ抗作內(nèi)參，并于4℃孵育12 h。PVDF膜用1∶5 000稀釋的Ⅱ抗孵育，1 h后加入ELC化學發(fā)光液顯色、顯影，分析蛋白條帶灰度值。

1.2.4 MTT法檢測細胞活力 收集HGC-27細胞5×104個/毫升，接種于96孔板，分別連續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，將100 μL MTT溶液（濃度為5 mg/mL）加至每孔中，37℃孵育，4 h后去上清，將200 μL二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）加至每孔中，置37℃搖床振蕩充分溶解結晶，10 min后置酶標儀讀取各孔細胞吸光度值（OD值），檢測波長λ=490 nm。

1.2.5 流式細胞術檢測細胞凋亡 細胞凋亡的檢測參照annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒步驟進行。調(diào)整HGC-27細胞密度為1×106個/毫升，在195 μL annexin V-FITC結合液中重懸，將其轉移至EP管，之后依次加入5 μL annexin V-FITC和10 μL PI染色液，分別輕輕混勻，在黑暗中靜置20 min，上流式細胞儀進行HGC-27細胞凋亡情況評估。

1.2.6 雙熒光素酶活性檢測 利用TargetScan（http：//www.targetscan.org/）在 線 工 具 預 測 發(fā) 現(xiàn)FOXM1的3’非編碼 區(qū)（3’untranslated region，3’UTR）中含有miR-877-5p假定的結合位點，推測FOXM1可能是miR-877-5p的靶基因。使用位點突變技術構建突變的FOXM1 3’UTR，利用PCR技術擴增野生型FOXM1 3’UTR和突變型FOXM1 3’UTR序列，將擴增序列與含有螢火蟲熒光素酶基因的質粒重組，鑒定出正確的質粒命名為野生型FOXM1（WT-FOXM1）和 突 變 型FOXM1（MUTFOXM1），將其與miR-877-5p模擬物或miR-NC共轉染入HGC-27細胞，48 h后遵循雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒的步驟，測定雙熒光素酶活性。

1.3 統(tǒng)計學方法每個獨立實驗均重復6次。采用SPSS 22.0軟件進行數(shù)據(jù)的整理與分析，并表示為。兩組間數(shù)據(jù)比較用t檢驗，多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗，當P＜0.05時，差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-877-5p和FOXM1在胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中的表達qPCR檢測miR-877-5p表達，結果顯示，與正常胃黏膜上皮細胞GES-1比較，miR-877-5p表達量在胃癌細胞HGC-27、SUN-1、AGS中明顯減少（P＜0.05），選擇差異最顯著的HGC-27細胞進行后續(xù)實驗。qPCR和Western blotting分別檢測FOXM1 mRNA和FOXM1的蛋白表達，發(fā)現(xiàn)與GES-1組比較，F(xiàn)OXM1 mRNA和FOXM1的蛋白表達量在HGC-27、SUN-1、AGS細胞中顯著增加（P＜0.05）。見表1，圖1。

表1 miR-877-5p和FOXM1在胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中的表達/

表1 miR-877-5p和FOXM1在胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中的表達/

注：①與GES-1組比較，P＜0.05。

組別GES-1 HGC-27 SUN-1 AGS F值P值重復次數(shù)6 6 66 miR-877-5p 1.00±0.08 0.34±0.03①0.51±0.05①0.44±0.04①181.25＜0.001 FOXM1 mRNA 1.00±0.09 2.41±0.23①2.58±0.24①2.26±0.23①72.61＜0.001 FOXM1蛋白表達量0.22±0.03 0.49±0.05①0.43±0.06①0.53±0.05①48.06＜0.001

圖1 miR-877-5p和FOXM1在胃癌細胞和正常胃黏膜上皮細胞中的表達

2.2 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力的影響在HGC-27細胞轉染miR-877-5p模擬物，發(fā)現(xiàn)miR-877-5p表達量遠遠高于miR-NC組（P＜0.05）。MTT檢測結果顯示，miR-877-5p過表達明顯降低48 h（P＜0.05）、72 h（P＜0.05）的細胞活力，對24 h的細胞活力無顯著影響。Western blotting檢測結果表明，相比于miR-NC組，miR-877-5p過表達顯著減少cyclinD1的表達量，提高p21、p27的蛋白水平（P＜0.05）。見表2，圖2。

圖2 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力的影響

表2 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力的影響/

表2 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力的影響/

注：OD為吸光度，cyclinD1為細胞周期蛋白D1，p21、p27均為細胞周期依賴性激酶抑制因子。

組別miR-NC miR-877-5p t值P值重復次數(shù)66 miR-877-5p 1.00±0.09 2.14±0.21 12.22＜0.001 OD值24 h 0.36±0.03 0.33±0.03 1.73 0.114 48 h 0.64±0.06 0.42±0.04 7.47＜0.001 72 h 1.02±0.09 0.56±0.05 10.94＜0.001 cyclinD1 0.69±0.06 0.31±0.03 13.88＜0.001 p21 0.24±0.03 0.59±0.05 14.70＜0.001 p27 0.34±0.03 0.73±0.07 15.54 0.000

2.3 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡的影響與miR-NC組比較，miR-877-5p過表達明顯增加HGC-27細胞凋亡率（P＜0.05），降低Bcl-2蛋白水平，而提高Bax、cleaved-caspase 3的蛋白水平（P＜0.05）。見表3，圖3。

圖3 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡及凋亡相關蛋白表達的影響：A為細胞凋亡流式圖；B為miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡相關蛋白表達的影響

表3 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡的影響/

表3 miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡的影響/

注：Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，Bax為Bcl-2相關X蛋白，cleaved-caspase 3為活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3。

組別miR-NC miR-877-5p t值P值重復次數(shù)6 6細胞凋亡率/%8.17±0.83 24.16±2.33 15.84＜0.001 Bcl-2 0.62±0.06 0.27±0.03 12.78＜0.001 Bax 0.31±0.03 0.75±0.07 14.15＜0.001 cleavedcaspase 3 0.25±0.03 0.68±0.06 15.70＜0.001

2.4 抑制FOXM1表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響將si-FOXM1轉染入HGC-27細胞，F(xiàn)OXM1蛋白表達量明顯減少（P＜0.05），證明成功構建敲減FOXM1表達的細胞。與si-NC組比較，敲減FOXM1的表達顯著降低48 h（P＜0.05）、72 h（P＜0.05）的細胞活力，對24 h的細胞活力無明顯影響，增加細胞凋亡率（P＜0.05），減少cyclinD1、Bcl-2蛋白表達量，提高p21、Bax蛋白水平（P＜0.05）。見表4，圖4。

表4 抑制FOXM1表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響/

表4 抑制FOXM1表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的影響/

注：cyclinD1為細胞周期蛋白D1，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，p21為細胞周期依賴性激酶抑制因子，Bax為Bcl-2相關X蛋白。

組別si-NC si-FOXM1 t值P值重復次數(shù)66 FOXM1蛋白表達量0.53±0.05 0.21±0.03 13.44＜0.001細胞活力24 h 0.37±0.03 0.35±0.03 1.16 0.275 48 h 0.66±0.06 0.49±0.04 5.78＜0.001 72 h 1.05±0.09 0.65±0.06 9.06＜0.001細胞凋亡率/%7.86±0.77 18.65±1.87 13.07＜0.001 cyclinD1 0.68±0.07 0.35±0.03 10.61＜0.001 Bcl-2 0.64±0.06 0.32±0.03 11.69＜0.001 p21 0.23±0.02 0.57±0.05 15.47＜0.001 Bax 0.29±0.03 0.71±0.07 13.51＜0.001

圖4 抑制FOXM1表達對胃癌HGC-27細胞活力和凋亡的影響：A為免疫印跡圖；B為敲減FOXM1的表達對胃癌HGC-27細胞凋亡的影響

2.5 miR-877-5p靶向調(diào)控FOXM1的表達生物信息學預測出miR-877-5p與FOXM1的3’UTR部分堿基可形成互補配對（圖5A）。雙熒光素酶報告實驗顯示，miR-877-5p明顯抑制WT-FOXM1熒光素酶活性（P＜0.05），而MUT-FOXM1熒光素酶活性無顯著差異。相較于miR-NC組，miR-877-5p明顯減少FOXM1蛋白表達量（P＜0.05）。相比于anti-miR-NC組，anti-miR-877-5p顯著提高FOXM1蛋白水平（P＜0.05）。見表5，圖5。

圖5 miR-877-5p靶向調(diào)控FOXM1表達：A為FOXM1的序列中含有與miR-877-5p互補的核苷酸序列；B為miR-877-5p調(diào)控FOXM1蛋白的表達

表5 miR-877-5p靶向調(diào)控FOXM1的表達/

表5 miR-877-5p靶向調(diào)控FOXM1的表達/

組別miR-NC miR-877-5p t值P值重復次數(shù)6 6 WT-FOXM1酶活性1.01±0.09 0.36±0.04 16.17＜0.001 MUT-FOXM1酶活性0.98±0.08 1.02±0.09 0.81 0.435 FOXM1蛋白表達量0.52±0.05 0.23±0.03 12.18＜0.001

2.6 FOXM1過表達逆轉miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力和凋亡的作用與miR-NC組比較，miR-877-5p過表達明顯減少FOXM1蛋白表達量（P＜0.05），顯著影響48 h、72 h的細胞活力、細胞凋亡率、cyclinD1、p21（P＜0.05）、Bcl-2、Bax蛋白水平（P＜0.05）。與miR-877-5p+pcDNA組比較，miR-877-5p和pcDNA-FOXM1共轉染入HGC-27細胞，明顯升高FOXM1的蛋白水平（P＜0.05），提高48 h、72 h的細胞活力（P＜0.05），減少細胞凋亡率，以及增加cyclinD1（P＜0.05）、Bcl-2蛋白表達量并降低p21、Bax蛋白水平（P＜0.05）。見表6～8；圖6。

圖6 FOXM1過表達逆轉錄miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞活力和凋亡的作用：A為免疫印跡圖；B為FOXM1過表達逆轉錄miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞凋亡的作用

表6 FOXM1過表達逆轉miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用/

表6 FOXM1過表達逆轉miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用/

注：cyclinD1為細胞周期蛋白D1，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，p21為細胞周期依賴性激酶抑制因子，Bax為Bcl-2相關X蛋白。

組別miR-NC miR-877-5p t值P值重復次數(shù)6 6 cyclinD1 0.70±0.07 0.33±0.03 11.90＜0.001 p21 0.25±0.03 0.57±0.05 13.44＜0.001 Bcl-2 0.64±0.06 0.29±0.03 12.78＜0.001 Bax 0.32±0.03 0.76±0.07 14.15＜0.001

3 討論

miRNA是一類高度保守的非編碼小RNA，通過結合靶mRNA的3’UTR，導致其降解或翻譯抑制［7］。大量資料顯示，miRNA參與細胞增殖、細胞周期、凋亡、轉移等多種生物學過程，已成為癌癥發(fā)生和進展的關鍵調(diào)節(jié)因子［8-9］。最近，已經(jīng)確定了多種miRNA參與胃癌進展和轉移［10］，表明miRNA可作為有效地診斷和預后分子生物標記物，并且可以成為胃癌有效治療靶點［11-12］，因此，尋找參與胃癌發(fā)展的新miRNA有助于改善病人預后。在此項研究中，發(fā)現(xiàn)miR-877-5p在胃癌細胞HGC-27、SUN-1、AGS中的表達明顯低于正常胃黏膜上皮細胞GES-1，miR-877-5p過表達顯著抑制HGC-27細胞的活力，并促進其凋亡。這些結果表明miR-877-5p在抑制胃癌進展中起關鍵作用。既往研究表明，miR-877表達在非小細胞肺癌（NSCLC）組織和細胞系中表達下調(diào)，miR-877低表達與NSCLC病人TNM分期和遠處轉移顯著相關；功能實驗證明，miR-877表達的恢復限制了NSCLC細胞的增殖和侵襲［13］。miR-877-5p在肝細胞癌中表達上調(diào)［14］。本研究結果與這些報道相同，表明miR-877-5p可能是診斷和治療患有這些特定惡性腫瘤類型的病人的有效靶標。

FOXM1是一個叉頭盒（Fox）轉錄因子超家族一員，廣泛表達于增殖細胞和癌細胞中［15］。根據(jù)報道，F(xiàn)OXM1經(jīng)常在癌癥中過度表達，影響肝癌等腫瘤進展［16-17］。FOXM1在胃癌細胞中的表達高于胃黏膜上皮細胞，在胃癌的轉移過程中發(fā)揮了重要的促進作用［18］。FOXM1基因表達下調(diào)可顯著降低多株宮頸癌細胞侵襲和遷移能力［19］。FOXM1在膀胱癌組織中存在過度表達，干擾其表達可抑制膀胱癌細胞的增殖、遷移和侵襲，促進細胞凋亡［20］。下調(diào)FOXM1表達可使食管癌細胞周期阻滯，促進細胞凋亡，抑制細胞增殖［21］。本研究中，F(xiàn)OXM1的mRNA和蛋白在HGC-27、SUN-1、AGS細胞明顯上調(diào)，抑制其表達顯著抑制HGC-27細胞增殖并誘導凋亡，與前述研究相符。

表7 HGC-27細胞中FOXM1的表達及其細胞增殖和凋亡變化/

表7 HGC-27細胞中FOXM1的表達及其細胞增殖和凋亡變化/

組別miR-NC miR-877-5p t值P值重復次數(shù)66 FOXM1蛋白表達量0.56±0.05 0.24±0.03 13.44＜0.001細胞活力12 h 0.41±0.03 0.39±0.03 1.16 0.275 48 h 0.67±0.06 0.46±0.04 7.13＜0.001 72 h 1.08±0.09 0.59±0.05 11.66＜0.001細胞凋亡率/%8.23±0.81 22.46±2.58 12.89＜0.001

表8 FOXM1過表達逆轉miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用/

表8 FOXM1過表達逆轉miR-877-5p過表達對胃癌HGC-27細胞增殖和凋亡的作用/

注：cyclinD1為細胞周期蛋白D1，Bcl-2為B細胞淋巴瘤/白血病-2，p21為細胞周期依賴性激酶抑制因子，Bax為Bcl-2相關X蛋白。

組別miR-877-5p+pcDNA miR-877-5p+pcDNA-FOXM1 t值P值重復次數(shù)6 6 FOXM1蛋白表達量0.22±0.03 0.45±0.04 11.27＜0.001細胞活力24 h 0.40±0.03 0.41±0.04 0.49 0.635 48 h 0.42±0.04 0.56±0.05 5.36＜0.001 72 h 0.54±0.05 0.85±0.08 8.05＜0.001細胞凋亡率/%23.87±2.41 13.25±1.34 9.43＜0.001 cyclinD1 0.32±0.03 0.59±0.05 11.34＜0.001 Bcl-2 0.27±0.03 0.54±0.05 11.34＜0.001 p21 0.60±0.06 0.36±0.03 8.76＜0.001 Bax 0.77±0.06 0.43±0.04 11.55＜0.001

miRNA通過直接調(diào)節(jié)其靶基因的表達參與幾乎所有關鍵細胞過程的調(diào)節(jié)。本研究探索了miR-877-5p在胃癌進展中發(fā)揮抑制作用的機制。生物信息學分析用于鑒定miR-877-5p的可能靶標，并且在miR-877-5p和FOXM1的3’UTR之間觀察到互補位點。熒光素酶報告基因實驗和Western blotting分析顯示miR-877-5p可以直接靶向FOXM1的3’UTR，上調(diào)或下調(diào)miR-877-5p明顯調(diào)控FOXM1表達。此外，F(xiàn)OXM1在胃癌細胞中表達上調(diào)，與miR-877-5p表達相反。最后，miR-877-5p和pcDNAFOXM1共轉染，發(fā)現(xiàn)FOXM1過表達逆轉了miR-877-5p過表達在胃癌細胞中的腫瘤抑制作用。這些結果為FOXM1是胃癌細胞中miR-877-5p的直接靶基因提供了證據(jù)。因此，使用基于miR-877-5p的靶向治療來敲減FOXM1的表達可能是胃癌病人中一種有價值的治療方法。

總之，miR-877-5p在胃癌細胞中表達下調(diào)，miR-877通過抑制FOXMl表達，抑制胃癌細胞活力并誘導其凋亡，表現(xiàn)出抗腫瘤特性。這些發(fā)現(xiàn)為胃癌發(fā)生和發(fā)展的機制提供了新的見解和潛在治療靶點。