食管癌組織白細(xì)胞介素-6/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)激活子3通路相關(guān)蛋白的表達(dá)及其與臨床分期、分化程度的關(guān)系研究

謝宇，鄧倩曦

作為常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，食管癌已成為全球關(guān)注的疾病。有調(diào)查顯示，在所有惡性腫瘤中，食管癌占比約為2%，其5年生存率僅為20%左右［1］。另有資料表明，全球范圍內(nèi)每年約有30萬(wàn)死于食管癌，其中我國(guó)死于食管癌的人群占比高達(dá)40%［2］，可知食管癌對(duì)我國(guó)居民的生命造成了極大的威脅。但是目前人們對(duì)食管癌的發(fā)病機(jī)制認(rèn)識(shí)尚淺，且臨床仍缺乏高效的抗腫瘤方案。有報(bào)道指出，影響食管癌預(yù)后的因素多，其中臨床分期、分化程度是主要的危險(xiǎn)因素［3-4］。但是影響食管癌臨床分期、分化程度的因素仍需要進(jìn)一步探討。白細(xì)胞介素-6（IL-6）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)激活子3（STAT3）通路是惡性腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡調(diào)控的重要途徑，與食管癌、胃癌、肝癌等均緊密相關(guān)［5-8］。實(shí)驗(yàn)顯示，對(duì)乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行基因干擾，可通過(guò)調(diào)控STAT3信號(hào)通路，下調(diào)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)激活子3（p-STAT3）水平增加細(xì)胞凋亡率、降低細(xì)胞存活率［9］。另有報(bào)道表明，對(duì)人食管癌細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)抑制IL-6/STAT3通路的活性，可通過(guò)下調(diào)二者的表達(dá)，降低p-STAT3水平，抑制B淋巴細(xì)胞瘤相關(guān)死亡啟動(dòng)子（Bcl-xl）、細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）的活性提高其增殖抑制率和細(xì)胞凋亡率［10］。據(jù)此推測(cè)，IL-6/STAT3信號(hào)通路及其下游Bcl-xl、CyclinD1的表達(dá)可能參與食管癌的發(fā)生和發(fā)展。但該通路相關(guān)蛋白表達(dá)與食管癌臨床分期、分化程度的關(guān)系尚未完全明確，仍需進(jìn)一步探討，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院（四川省精神衛(wèi)生中心）2018年10月至2020年7月收治的109例食管癌病人，男70例、女39例，年齡范圍35～78歲，年齡（59.15±10.17）歲，臨床分期：Ⅰ期12例、Ⅱ期39例、Ⅲ期44例、Ⅳ期14例，腫瘤長(zhǎng)徑范圍1.5～10.5 cm，腫瘤長(zhǎng)徑（5.52±1.05）cm，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例，病理類型：鱗癌98例（高分化18例、中分化59例、低分化21例）、腺癌8例（中分化3例、低分化5例）、小細(xì)胞癌3例（未分化3例）。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)病理學(xué)檢查證實(shí)罹患食管癌；②均實(shí)施手術(shù)或活檢，且均有癌組織、癌旁正常組織標(biāo)本存檔；③病人均對(duì)本研究知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①手術(shù)或活檢前1個(gè)月內(nèi)接受相關(guān)抗腫瘤治療者，如新輔助放化療等；②復(fù)發(fā)性食管癌或轉(zhuǎn)移性食管癌病人；③合并其他類型消化系統(tǒng)疾病者，如反流性食管炎等；④臨床分期或分化程度等臨床病理特征不明確者；⑤有意識(shí)障礙或精神障礙者。

1.3 方法IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化法檢測(cè)癌組織和癌旁正常組織上述蛋白表達(dá)。待檢測(cè)組織均有石蠟包埋，連續(xù)切片（層厚4 μm），脫蠟并利用梯度濃度酒精水化，然后采用壓力鍋進(jìn)行抗原熱修復(fù)。滴加鼠抗人IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1單克隆一抗工作液，需稀釋200倍，盡可能覆蓋組織，4℃孵育一抗過(guò)夜；滴加兔抗鼠IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1多克隆二抗工作液（以過(guò)氧化物酶標(biāo)記），室溫孵育二抗4 h。滴加顯色劑，靜置5～10 min后以蒸餾水終止反應(yīng)。吹干并采用中性樹(shù)膠封片，晾干后在高倍顯微鏡下閱片。染色程度：將無(wú)色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別記為0分、1分、2分、3分；陽(yáng)性細(xì)胞率：將＜5%、≥5%且＜25%、≥25%且＜50%、≥50%且＜75%、≥75%分別記為0分、1分、2分、3分、4分。計(jì)算染色程度與陽(yáng)性細(xì)胞率乘積，將結(jié)果為0、1～4、5～8、9～12者分別記為陰性、弱陽(yáng)性、中等陽(yáng)性、強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)［11］。

1.4 觀察指標(biāo)（1）對(duì)比癌組織和癌旁正常組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)；（2）對(duì)比不同臨床病理特征病人癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)；（3）分析IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度的關(guān)系。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法將SPSS 22.0軟件作為統(tǒng)計(jì)學(xué)工具，單一樣本計(jì)數(shù)資料例（%）對(duì)比采用配對(duì)資料χ2檢驗(yàn)，兩樣本計(jì)數(shù)資料例（%）對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)性采用Spearman分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 癌組織與癌旁正常組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。典型病例組織相關(guān)蛋白免疫組化檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。

表1 食管癌109例癌組織與癌旁正常組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)比/例（%）

2.2 不同臨床病理特征病人癌組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)對(duì)比不同性別、老年與否、不同病理類型病人癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率對(duì)比均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期、腫瘤長(zhǎng)徑≥5 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、未/低分化病人癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均分別高于Ⅰ～Ⅱ期、腫瘤長(zhǎng)徑＜5 cm、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、中/高分化病人（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 食管癌109例不同臨床病理特征病人癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)對(duì)比/例（%）

2.3 癌組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度的關(guān)系癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)與臨床分期均呈正 相 關(guān)（r=0.81、0.83、0.79、0.72、0.71，P=0.010、0.007、0.005、0.018、0.023），與分化程度均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.81、-0.79、-0.71、-0.70，P=0.011、0.019、0.023、0.038、0.040），“四格表”見(jiàn)表3。

表3 食管癌109例癌組織IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)與臨床分期、分化程度“四格表”/例

3 討論

食管癌的常見(jiàn)病因有遺傳易感性、化學(xué)致癌物質(zhì)接觸、微量元素缺乏、維生素缺乏、煙酒刺激、熱食熱飲、口腔不潔等［12-13］。在食管癌中，基因突變所致的細(xì)胞增殖與凋亡調(diào)控因子水平異常，可使得細(xì)胞增殖與凋亡被打破，引發(fā)疾病發(fā)生和預(yù)后不良［14-15］。

本研究中顯示癌組織IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，提示食管癌的發(fā)生可能與IL-6/STAT3信號(hào)通路激活，使得二者蛋白表達(dá)及其下游的p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白表達(dá)水平升高有關(guān)。IL-6屬于一種多功能因子，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中該因子有廣泛的生物學(xué)活性，如食管癌、肺癌、結(jié)直腸癌等。有研究顯示，IL-6可與其受體結(jié)合，其產(chǎn)物可激活胞質(zhì)細(xì)胞外信號(hào)激活因子，促進(jìn)STAT3表達(dá)并增加該蛋白的磷酸化水平［16］。STAT3屬于信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄因子蛋白家族成員，可以被不同的細(xì)胞因子受體激活。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中STAT3蛋白表達(dá)及p-STAT3水平均高于癌旁組織［17］，本研究與該報(bào)道相符，證實(shí)STAT3及其磷酸化水平很可能是食管癌發(fā)生的危險(xiǎn)因素。Bcl-xl和CyclinD1均位于IL-6/STAT3通路的下游，前者屬于凋亡抑制蛋白，可通過(guò)維持內(nèi)環(huán)境、抑制細(xì)胞壞死等途徑減少細(xì)胞凋亡，且該蛋白還被證實(shí)可參與多種蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用進(jìn)而抑制凋亡，如阻斷線粒體外膜破壞、干擾死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體的組裝、維持線粒體膜電位、控制活性氧自由基毒性發(fā)揮等［18］；后者是調(diào)控細(xì)胞周期G1期的特異性、關(guān)鍵性蛋白，而細(xì)胞周期是確保細(xì)胞進(jìn)行生命活性的基本過(guò)程，CyclinD1蛋白表達(dá)可維持細(xì)胞生長(zhǎng)和分裂，促進(jìn)細(xì)胞增殖，相關(guān)研究表明CyclinD1蛋白對(duì)細(xì)胞增殖兼具內(nèi)源性和外源性作用，也是促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵分子［19］。因此IL-6、STAT3、p-STAT3、Bclxl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)很可能均參與食管癌的發(fā)生。

本研究還發(fā)現(xiàn)，食管癌組織中IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)與臨床分期、腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度均有關(guān)，且相關(guān)性分析也證實(shí)上述蛋白表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)。IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白可通過(guò)多種途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞增殖與凋亡失衡，參與惡性腫瘤的發(fā)生。結(jié)合既往報(bào)道，推測(cè)IL-6/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)水平越高，促細(xì)胞增殖和抗細(xì)胞凋亡的作用越強(qiáng)烈，細(xì)胞的惡性潛能越高，因此可影響臨床分期和分化程度［20］。

綜上所述，食管癌組織中IL-6、STAT3、p-STAT3、Bcl-xl、CyclinD1蛋白陽(yáng)性表達(dá)率高，且上述蛋白表達(dá)與臨床分期呈正相關(guān)，與分化程度呈負(fù)相關(guān)，與腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移也均有關(guān)系。根據(jù)本研究結(jié)果與結(jié)論，推測(cè)可將抑制IL-6/STAT3通路的活性作為食管癌靶向治療的新思路，但如何開(kāi)發(fā)新藥物并應(yīng)用于臨床應(yīng)作為后期研究的重點(diǎn)。