血清外泌體miR-155、miR-222表達(dá)對乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值

郭檬檬，姚昶

乳腺癌是嚴(yán)重威脅女性身心健康的惡性腫瘤之一，近年來乳腺癌的發(fā)病率呈上升趨勢，并且病人趨于年輕化。早期診斷、及早治療是提高乳腺癌病人療效、改善預(yù)后的關(guān)鍵［1］。已有研究證實(shí)，微小RNA（microRNA，miRNA）在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起重要調(diào)節(jié)作用，但循環(huán)miRNA含量比組織內(nèi)少，并且易被RNA酶降解［2-3］。隨著研究的不斷深入，有學(xué)者認(rèn)為血清中的miRNAs可能通過外泌體的形式進(jìn)行運(yùn)輸，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞間的信息傳遞作用［4-5］。由外泌體包裹運(yùn)輸?shù)膍iRNA含量較為穩(wěn)定，可較為真實(shí)地反映母細(xì)胞的miRNA水平。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可直接靶向FOXO-3a的3’-端非翻譯區(qū)下調(diào)其轉(zhuǎn)錄及翻譯，從而調(diào)節(jié)乳腺癌細(xì)胞的藥物反應(yīng)［6］。另有研究稱，miR-222在乳腺癌病人外泌體中過表達(dá)，與乳腺癌病人阿霉素耐藥有關(guān)［7］。然而，關(guān)于外泌體miR-155、miR-222與乳腺癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究鮮見報(bào)道，因此本研究通過檢測血清外泌體miR-155、miR-222表達(dá)水平，并初步分析其與乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016年1月至2017年6月南通市中醫(yī)院收治的乳腺癌病人72例作為乳腺癌組，病人均為女性，年齡范圍27～71歲，年齡（50.46±7.24）歲，其中左側(cè)37例，右側(cè)45例；TNM分期Ⅰ期31例，Ⅱ～Ⅲ期41例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例；低、中分化34例，高分化38例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)病理組織切片證實(shí)為原發(fā)性病灶浸潤性乳腺癌；②均行乳腺癌改良根治術(shù)進(jìn)行治療；③術(shù)前行乳腺彩色超聲檢查；④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①非原發(fā)性乳腺癌；②合并惡性腫瘤；③合并血液系統(tǒng)疾病或傳染性疾病；④孕婦、哺乳期女性。同期選取在本院確診的乳腺纖維瘤病人40例為對照組，均為女性，年齡范圍25～67歲，年齡（48.62±8.17）歲。所有病人及其近親屬均知情同意并簽署知情同意書。本研究方案經(jīng)南通市中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施（批號20160211）。

1.2 方法

1.2.1 血樣采集及外泌體提取 所有病人于入院次日清晨取空腹靜脈血5 mL，對照組于檢查當(dāng)日取空腹靜脈血5 mL，3 000 r/min離心10 min后，取上層清液轉(zhuǎn)移至干凈EP管，做好編號后置于-80℃條件下保存。利用外泌體試劑盒提取血清中外泌體，置于透射電鏡下觀察形態(tài)進(jìn)行鑒定。外泌體試劑盒購自德國QIAGEN公司，提取步驟按照說明書嚴(yán)格執(zhí)行。

1.2.2 熒光定量PCR技術(shù)檢測外泌體miR-155、miR-222水平 利用Trizol試劑盒提取血清外泌體總RNA，富集miRNAs后按照microRNA Reverse Transcription Ki（t美國Thermo Fishier Scientific）說明書方法進(jìn)行血清外泌體miRNAs逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將得到的cDNA按照SYBR Green Supermix（美國Bio-Red）說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，反應(yīng)條件如下：95℃變性30 s；95℃、15 s；60℃延伸15 s，40個(gè)循環(huán)。miR-155、miR-222均以U6為內(nèi)參，引物序列為：miR-155正向引物5’-ACGCTCAGTTAATGCTAATCGTGATA-3’，miR-155反 向引 物5’-ATTCCATGTTGTCCAACTGTCTCTG-3’；miR-222正向引物5’-GCTGGCGACATTACGACATTCGCGC-3’，miR-222反 向 引 物5’-ACGCGCTAAGCCAAGTCTTAC-3’；U6正向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，U6反向引物5’-AACGCTTCCAGAATTTGCGT-3’。用2-ΔΔCt法計(jì)算各血清外泌體中miR-155、miR-222相對表達(dá)水平。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.2.3 觀察指標(biāo) 乳腺癌病人術(shù)后第一年每3個(gè)月隨訪一次，之后每6個(gè)月隨訪一次至術(shù)后3年。隨訪時(shí)病人行全身CT或MRI掃描，如發(fā)現(xiàn)影像學(xué)轉(zhuǎn)移，則進(jìn)一步行組織病理學(xué)檢查確診，根據(jù)病人是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移分為復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組27例和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組45例，比較兩組病人血清外泌體miR-155、miR-222水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用例（%）表示，行χ2檢驗(yàn)。采用受試者工作特征（ROC）曲線評價(jià)血清外泌體miR-155、miR-222水平對乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究組和對照組血清外泌體miR-155 、miR-222 水平比較研究組血清外泌體miR-155、miR-222水平均明顯高于對照組（均P＜0.05），見表1。

表1 乳腺纖維瘤病人40例與乳腺癌病人72例血清外泌體miR-155、miR-222水平比較/

組別對照組研究組t值P值例數(shù)40 72 miR-155 0.98±0.03 1.46±0.62 4.88＜0.001 miR-222 1.02±0.02 1.87±0.79 6.79＜0.001

2.2 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清外泌體miR-155 、miR-222 水平比較復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組病人血清外泌體miR-155、miR-222水平均明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組（均P＜0.05），見表2。

表2 乳腺癌病人72例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清外泌體miR-155、miR-222水平比較/

表2 乳腺癌病人72例復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組血清外泌體miR-155、miR-222水平比較/

組別復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組t值P值例數(shù)27 45 miR-155 1.68±0.47 1.33±0.24 4.18＜0.001 miR-222 2.13±0.53 1.71±0.26 4.50＜0.001

2.3 乳腺癌病人血清外泌體miR-155 、miR-222 水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系以血清外泌體miR-155、miR-222相對表達(dá)量的平均數(shù)將病人分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，經(jīng)病理分析結(jié)果顯示，乳腺癌病人血清外泌體miR-155、miR-222表達(dá)水平與年齡、腫瘤大小、分化程度無關(guān)（均P＞0.05），與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（均P＜0.05），見表3。

表3 乳腺癌病人72例血清外泌體miR-155、miR-222水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系/例（%）

2.4 血清外泌體miR-155 、miR-222 水平對乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的診斷價(jià)值ROC結(jié)果顯示，血清外泌體miR-155、miR-222預(yù)測乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的曲線下面積（AUC）分別為0.82［95%CI：（0.71，0.87）］、0.79［95%CI：（0.68，0.88）］，對應(yīng)的靈敏度分別為69.37%、59.26%，特異度分別為80.22%、86.33%；二者聯(lián)合預(yù)測乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.89［95%CI：（0.79，0.95）］，靈敏度為84.37%，特異度為93.16%。進(jìn)一步Z檢驗(yàn)結(jié)果顯示，血清外泌體miR-155、miR-222單獨(dú)預(yù)測乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC與聯(lián)合預(yù)測的AUC相比，均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.04，P=0.298；Z=1.29，P=0.196）。

3 討論

乳腺癌是一種高度異質(zhì)性腫瘤，臨床研究發(fā)現(xiàn)，約有30%～40%的早期乳腺癌病人即使接受了手術(shù)根治術(shù)，仍有復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，可能與其基因異質(zhì)性導(dǎo)致的生物學(xué)行為和臨床病理改變有關(guān)［8-9］。本研究納入的72例乳腺癌病人，有27例發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率為37.50%，與其他學(xué)者［10］報(bào)道的39.53%較為接近。目前臨床上診斷乳腺癌常用方法有影像學(xué)檢查、病理學(xué)診斷及血清腫瘤標(biāo)志物檢查等，但由于存在放射性損傷、有創(chuàng)性、靈敏度較差等缺陷，且對病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移預(yù)測價(jià)值有限，尋找新的有效標(biāo)志物以監(jiān)測乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移成為目前研究的熱點(diǎn)。

外泌體是內(nèi)泌體衍生的納米大小的小泡（50～150 nm），由多種類型細(xì)胞分泌，外泌體中含有細(xì)胞蛋白、脂質(zhì)和miRNAs，可通過轉(zhuǎn)運(yùn)mRNA或miRNA調(diào)控受體細(xì)胞基因表達(dá)，癌細(xì)胞分泌的外泌體從原發(fā)腫瘤轉(zhuǎn)移到循環(huán)系統(tǒng)已在多種模型中得到證實(shí)［11-13］。已有學(xué)者報(bào)道稱從乳腺癌病人和健康志愿者血清中分離出的外泌體中含有miR-155［14］，Kia等［15］研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在轉(zhuǎn)移性乳腺癌外泌體中富集，且通過靶向PTEN和DUSP14參與乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移作用。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，乳腺癌病人血清外泌體miR-155呈高表達(dá)，且復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人血清外泌體miR-155水平亦明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人。經(jīng)病理分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-155的表達(dá)水平與乳腺癌病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，表明外泌體miR-155可能通過獨(dú)特的信息傳遞作用參與乳腺癌細(xì)胞的增殖、遷移，影響疾病進(jìn)展。外泌體由于具有較高穩(wěn)定性，在細(xì)胞外環(huán)境中可防止RNA酶、蛋白酶的降解作用，同時(shí)發(fā)揮獨(dú)特的細(xì)胞間信息傳遞功能［16］，但關(guān)于外泌體miR-155在乳腺癌中的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

研究發(fā)現(xiàn)，miR-222是最早發(fā)現(xiàn)的一類外泌體miRNAs，可通過在腫瘤基質(zhì)、耐藥細(xì)胞及非耐藥細(xì)胞之間相互傳遞信息，從而改變腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性［17-18］。也有人認(rèn)為，外泌體可能通過囊泡將抗腫瘤藥物隔離，再通過胞吐作用將其排出細(xì)胞，以消除藥物對細(xì)胞的毒害作用，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)移［19］。Yu等［7］體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染miR-222模擬物的乳腺癌細(xì)胞MCF-7/S獲得阿霉素耐藥，而轉(zhuǎn)染miR-222抑制劑的MCF-7/S細(xì)胞失去耐藥性，證實(shí)miR-222可能是引起乳腺癌病人耐藥的機(jī)制之一。另有研究發(fā)現(xiàn)，外泌體miR-222在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步研究證實(shí)外泌體miR-222通過下調(diào)腫瘤抑制基因PDLIM2，從而激活NF-KB信號通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲作用［20］。本研究結(jié)果顯示，miR-222在乳腺癌病人血清外泌體中表達(dá)水平明顯高于對照組，與病人TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，與上述結(jié)果一致，提示乳腺癌病人血清外泌體miR-222可能通過在腫瘤局部微環(huán)境中傳遞信息，激活一條或多條信號通路，從而參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。本研究還發(fā)現(xiàn)，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移病人血清外泌體miR-222水平明顯高于未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，提示血清外泌體miR-222可能作為乳腺癌病人復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的生物標(biāo)志物。

ROC曲線可用于評價(jià)臨床診斷價(jià)值，AUC為ROC曲線與橫軸之間的面積，其大小可反映診斷價(jià)值大小，一般AUC值大于0.5，認(rèn)為具有診斷價(jià)值，AUC值越大則診斷價(jià)值越高。本研究結(jié)果顯示，外泌體miR-155、miR-222水平預(yù)測乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.82、0.79，預(yù)測敏感性較低，分別為69.37%、59.26%。為提高預(yù)測效果，進(jìn)一步探究二者聯(lián)合預(yù)測價(jià)值，結(jié)果顯示二者聯(lián)合預(yù)測乳腺癌病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC為0.885，均高于單獨(dú)預(yù)測AUC，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，聯(lián)合診斷的靈敏度為84.37%，特異度為93.16%，提示二者聯(lián)合診斷對乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測效能更優(yōu)，后續(xù)應(yīng)納入更大樣本量對本研究結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，乳腺癌病人血清外泌體miR-155、miR-222水平呈高表達(dá)，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，二者對病人術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移均有一定的預(yù)測價(jià)值，且二者聯(lián)合預(yù)測價(jià)值更高，提示血清外泌體miR-155、miR-222可能成為預(yù)測乳腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在生物標(biāo)記物，但具體作用機(jī)制有待更深入研究。