前列腺癌組織中泛素偶聯(lián)酶E2C、蛋白激酶B表達(dá)及其與預(yù)后相關(guān)性

鄧蘭，廖堃，付琴，徐苓傈，何其英

前列腺癌是男性泌尿生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)惡性腫瘤之一，隨著我國(guó)人口老齡化趨勢(shì)日漸加劇，前列腺癌發(fā)病率逐年上升，對(duì)男性健康及生命安全造成嚴(yán)重威脅［1-2］，尋找有效的前列腺癌藥物治療靶點(diǎn)對(duì)于提高病人預(yù)后具有重要臨床意義。泛素偶聯(lián)酶E2C（ubiquitin-conjugating enzyme E2C，UBE2C）又名泛素結(jié)合酶10，是泛素偶聯(lián)酶（ubiquitin-conjugating enzyme，E2）家族中第十個(gè)被識(shí)別的成員，其基因定位于染色體20q12.13，該染色體區(qū)與多種癌基因的擴(kuò)增有關(guān)［3-4］。UBE2C主要功能是通過(guò)與泛素激活酶（ubiquitin-activating enzyme，E1）、泛素連接酶（ubiquitin ligases，E3）協(xié)同作用，促進(jìn)靶蛋白泛素化，同時(shí)還具有調(diào)節(jié)細(xì)胞周期中關(guān)鍵蛋白的降解，調(diào)控有絲分裂紡錘體檢查點(diǎn)的作用［5］。蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）是一種蛋白激酶，有AKT1、AKT2、AKT3三個(gè)成員，AKT1定位于人染色體14q32區(qū)域，在多種惡性腫瘤中異?；钴S，可對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖產(chǎn)生促進(jìn)作用，已成為抗腫瘤藥物的重要研究靶點(diǎn)。已有研究表明UBE2C、AKT1與前列腺癌有關(guān)［6-7］，本研究旨在通過(guò)分析UBE2C、AKT1在前列腺癌組織中的表達(dá)及與預(yù)后的相關(guān)性，以期為前列腺癌的病情及預(yù)后評(píng)估提供臨床參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2014年1月至2016年12月四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科研究所收集的92例前列腺癌組織（前列腺癌組）、70例良性前列腺增生組織（良性前列腺增生組）進(jìn)行研究。前列腺癌組根據(jù)Gleason評(píng) 分 可 分 為：Gleason評(píng) 分＜7分 者21例，Gleason評(píng)分≥7分者71例；根據(jù)TNM分期可分為：Ⅰ、Ⅱ期36例，Ⅲ、Ⅳ期56例；根據(jù)有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例，伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移75例；根據(jù)術(shù)前前列腺特異抗原（prostate specificantigen，PSA）水平可分為：PSA≤10 μg/L者37例，PSA＞10 μg/L者55例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)檢查確診；（2）行前列腺癌根治術(shù)；（3）術(shù)前未接受放療、化療等其他治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他惡性腫瘤者；（2）合并心、肝等臟器嚴(yán)重疾病者；（3）復(fù)發(fā)性前列腺癌者；（4）臨床資料不完整。依據(jù)隨訪結(jié)果將前列腺癌組分為兩組，預(yù)后良好組（68例）、預(yù)后不良組（24例）。三組年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）相比，均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。所有研究對(duì)象或其直系親屬簽署知情同意書(shū)，本研究所用方法符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 Gleason評(píng)分 采用Gleason分級(jí)系統(tǒng)對(duì)前列腺癌進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)，將前列腺癌組織分為主要分級(jí)區(qū)及次要分級(jí)區(qū)，兩區(qū)相加即為Gleason評(píng)分。每區(qū)Gleason分級(jí)均為1～5級(jí)，1級(jí)為分化最好，臨床少見(jiàn)，腫瘤結(jié)節(jié)界限清楚，呈致密排列，無(wú)浸潤(rùn)；2級(jí)為分化較好，腺體排列較為疏松，存在微小浸潤(rùn)；3級(jí)為分化中等，臨床最為常見(jiàn)，腺體大小不均，形態(tài)各異，存在較多浸潤(rùn)；4級(jí)為分化較差，腺體融合、呈篩狀，或無(wú)腺體結(jié)構(gòu)；5級(jí)為未分化，無(wú)腺體結(jié)構(gòu)，癌細(xì)胞為實(shí)體片狀或條索狀，鄰近組織存在廣泛浸潤(rùn)［8］。

1.2.2 組織中UBE2C、AKT1表達(dá)檢測(cè) 組織標(biāo)本均為石蠟包埋，4 μm厚度連續(xù)切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)不同組織中UBE2C、AKT1表達(dá)，試劑盒均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司。由兩位有經(jīng)驗(yàn)的病理科醫(yī)生采用雙盲法進(jìn)行閱片，UBE2C、AKT1主要定位于胞質(zhì)中，鏡下出現(xiàn)黃色或棕色顆粒的細(xì)胞即為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片于高倍視野下隨機(jī)選取10個(gè)視野，每個(gè)視野內(nèi)計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞陽(yáng)性率及染色程度的乘積計(jì)分。細(xì)胞陽(yáng)性率計(jì)分準(zhǔn)則：陽(yáng)性率＜5%計(jì)為0分，5%≤陽(yáng)性率＜25%計(jì)為1分，25%≤陽(yáng)性率＜50%計(jì)為2分，50%≤陽(yáng)性率＜75%計(jì)為3分，陽(yáng)性率≥75%計(jì)為4分。細(xì)胞染色程度計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)：未染色計(jì)為0分，淡黃色計(jì)為1分，黃色計(jì)為2分，棕褐色計(jì)為3分?？偡郑?分為陰性，總分≥3分為陽(yáng)性，其中3分≤總分＜6分為低表達(dá)，總分≥6分為高表達(dá)。

1.2.3 隨訪 以術(shù)后第1天開(kāi)始計(jì)算隨訪日期，采用電話、門診或住院方式進(jìn)行，為期36個(gè)月，術(shù)后第1年每3個(gè)月隨訪1次，之后每6個(gè)月1次，以前列腺癌病人出現(xiàn)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)或死亡為終點(diǎn)事件，未出現(xiàn)終點(diǎn)事件者為預(yù)后良好，出現(xiàn)終點(diǎn)事件者為預(yù)后不良。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法；采用Cox回歸模型分析前列腺癌病人預(yù)后影響因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織UBE2C、AKT1陽(yáng)性表達(dá)率比較與良性前列腺增生組相比，前列腺癌組UBE2C、AKT1陽(yáng)性表達(dá)率均較高（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 前列腺癌92例與良性前列腺增生70例UBE2C、AKT1陽(yáng)性表達(dá)率比較/例（%）

2.2 前列腺癌組UBE2C、AKT1表達(dá)與病人臨床病理特征關(guān)系前列腺癌組UBE2C表達(dá)與年齡、TNM分期、術(shù)前PSA水平均無(wú)關(guān)（P＞0.05），與Gleason評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)（P＜0.05），AKT1表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)（P＞0.05），與Gleason評(píng)分、TNM分期、術(shù)前PSA水平均有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 前列腺癌92例UBE2C、AKT1表達(dá)與病人臨床病理特征關(guān)系/例（%）

2.3 UBE2C、AKT1表達(dá)與前列腺癌病人預(yù)后關(guān)系分析與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組UBE2C、AKT1陽(yáng)性表達(dá)率均較高（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 前列腺癌92例的UBE2C、AKT1表達(dá)與預(yù)后關(guān)系分析/例（%）

2.4 影響前列腺癌病人預(yù)后狀況的危險(xiǎn)因素分析將臨床認(rèn)為與前列腺癌病人預(yù)后狀況有關(guān)的因素及UBE2C、AKT1指標(biāo)納入COX回歸分析。以前列腺癌病人預(yù)后狀況作為因變量，以年齡、Gleason評(píng)分、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平、UBE2C表達(dá)、AKT1表達(dá)為自變量進(jìn)行COX回歸分析，將年齡≤50歲、Gleason評(píng)分＜7分、Ⅰ/Ⅱ期TNM分期、無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平≤10 μg/L、UBE2C低表達(dá)、AKT1低表達(dá)均賦值為0，相應(yīng)地將年齡＞50歲、Gleason評(píng)分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期TNM分期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平＞10 μg/L、UBE2C高表達(dá)、AKT1高表達(dá)均賦值為1。COX單因素分析結(jié)果顯示，年齡均差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），Gleason評(píng)分、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平、UBE2C、AKT1均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；COX多因素分析結(jié)果顯示，Gleason評(píng)分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期、伴淋巴 結(jié) 轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平＞10 μg/L、UBE2C高表達(dá)、AKT1高表達(dá)均是影響前列腺癌病人預(yù)后狀況的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（P＜0.05），見(jiàn)表4，5。

表4 影響前列腺癌92例預(yù)后狀況的單因素分析結(jié)果

3 討論

泛素化是細(xì)胞內(nèi)靶蛋白降解的重要機(jī)制，泛素-蛋白酶體通路包含E1、E2、E3，UBE2C是E2家族中研究廣泛的重要成員，與肺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤關(guān)系密切［9-10］。正常生理狀態(tài)下，UBE2C為低表達(dá)，在多數(shù)正常組織中幾乎難以檢測(cè)到，其過(guò)表達(dá)能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，抑制UBE2C表達(dá)，腫瘤細(xì)胞增殖明顯減緩，凋亡加快［11-12］。研究發(fā)現(xiàn)，UBE2C能夠促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移，可促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程，降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程。另有研究發(fā)現(xiàn)，沉默神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中UBE2C表達(dá)，可使PI3K-AKT-mTOR信號(hào)通路受到明顯抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，促使細(xì)胞生存能力降低，UBE2C可能成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤靶向治療的靶點(diǎn)［13-14］。UBE2C與前列腺癌的關(guān)系已引起研究者的關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)，敲減前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞中UBE2C的表達(dá)，能夠顯著抑制干細(xì)胞樣細(xì)胞中干性相關(guān)基因KLF4、SOX2、Oct4、Myc等表達(dá)，可能成為抑制前列腺癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的治療靶點(diǎn)。本研究發(fā)現(xiàn)，與良性前列腺增生組相比，前列腺癌組UBE2C陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示UBE2C與前列腺癌的發(fā)生有關(guān)。進(jìn)一步分析顯示，前列腺癌組UBE2C表達(dá)與年齡、TNM分期、術(shù)前PSA水平均無(wú)關(guān)，與Gleason評(píng)分、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有關(guān)，提示UBE2C可能由于評(píng)估前列腺癌病人病情嚴(yán)重程度。隨訪結(jié)果顯示，預(yù)后不良組與預(yù)后良好組相比，UBE2C陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示UBE2C與前列腺癌病人預(yù)后狀況密切相關(guān)。UBE2C參與前列腺癌發(fā)生及病情演變的原因可能是，前列腺癌中高表達(dá)的UBE2C可能通過(guò)調(diào)控泛素依賴蛋白代謝，破壞細(xì)胞有絲分裂周期蛋白，使細(xì)胞未能順利完成有絲分裂而迅速進(jìn)入下一周期，加快腫瘤細(xì)胞增殖速度，發(fā)揮促癌基因作用。

表5 影響前列腺癌92例預(yù)后狀況的多因素分析結(jié)果

PI3K/AKT信號(hào)通路是信號(hào)由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)傳遞的主要途徑之一，其異?；罨赡苁羌?xì)胞增殖加快促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展，已被證實(shí)與乳腺癌［15］、膠質(zhì)母細(xì)胞瘤［16］等多種腫瘤密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)前列腺細(xì)胞中miR-151a-3p的表達(dá)可降低PI3KAKT-mTOR信號(hào)通路蛋白表達(dá)，進(jìn)而使前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移受到抑制，可能為前列腺癌的靶向治療提供臨床參考依據(jù)［17］。新近研究發(fā)現(xiàn)，AKT1在乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞的增殖及遷移中可能發(fā)揮不同于其他腫瘤的作用，激活A(yù)KT1可促進(jìn)乳腺癌、前列腺癌細(xì)胞的增殖，但腫瘤遷移能力受到抑制，而抑制AKT1表達(dá)可使乳腺癌、前列腺癌的生長(zhǎng)減緩，但遷移能力顯著增強(qiáng)，這給臨床用藥帶來(lái)了問(wèn)題，廣譜的AKT抑制劑可能在抑制腫瘤細(xì)胞增殖的同時(shí)促進(jìn)其轉(zhuǎn)移［18-19］。本研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌組較良性前列腺增生組AKT1陽(yáng)性表達(dá)率高，提示AKT1可能參與前列腺癌的發(fā)生。前列腺癌病人AKT1表達(dá)與年齡、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與Gleason評(píng)分、TNM分期、術(shù)前PSA水平均有關(guān)，提示AKT1可能用于評(píng)估前列腺癌病人病情發(fā)展。隨訪結(jié)果顯示，與預(yù)后良好組相比，預(yù)后不良組AKT1陽(yáng)性表達(dá)率較高，提示AKT1可能與前列腺癌病人預(yù)后狀況有關(guān)。COX回歸模型分析結(jié)果顯示，Gleason評(píng)分≥7分、Ⅲ/Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)前PSA水平＞10 μg/L、UBE2C高表達(dá)、AKT1高表達(dá)均是影響前列腺癌病人預(yù)后狀況的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，提示可對(duì)合并危險(xiǎn)因素的前列腺癌病人進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注，并給予積極干預(yù)，以提高病人預(yù)后狀況。

綜上所述，UBE2C、AKT1與前列腺癌病人的病情發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，可能為評(píng)估病情及預(yù)后提供臨床參考依據(jù)，但本研究也存在不足之處，本研究樣本量小，且隨訪時(shí)間短，在以后的工作中將以此為重點(diǎn)進(jìn)行深入研究。