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    生長抑素聯(lián)合人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1通過磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B通路調(diào)控胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的機制研究

    2022-09-22 08:24:28王書芬倪猛薛萌
    安徽醫(yī)藥 2022年10期
    關(guān)鍵詞:生長抑素數(shù)目結(jié)果顯示

    王書芬,倪猛,薛萌

    胰腺癌作為消化道常見的惡性腫瘤,在我國,胰腺癌病人的發(fā)病率和死亡率在惡性腫瘤中分別排第10位和第6位,而早期胰腺癌病人的確診率不高,大多數(shù)病人在確診時已經(jīng)是晚期,已經(jīng)錯過最佳的治療時期,導(dǎo)致5年的預(yù)后生存率僅為2%~9%[1-2]。生長抑素是一種多肽類激素,在腦、胃腸和胰腺組織中含量較高,通過抑制胰酶和胰液的分泌,保護胰腺細胞[3]。劉力等[4]研究結(jié)果顯示,生長抑素通過聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。人轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1(FOXD1)在多種癌癥中異常表達,如FOXD1在胰腺癌組織和細胞中表達上調(diào),敲減FOXD1可以明顯抑制胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲[5]。PI3K/AKT通路與胰腺癌中發(fā)揮著重要的作用,在胰腺癌中常常被激活[6],有研究結(jié)果顯示,胰腺癌缺失位點4(DPC4)基因通過抑制磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/帕霉素靶蛋白(PI3K/AKT/mTOR)通路抑制胰腺癌細胞的增殖、侵襲和上皮間只轉(zhuǎn)化[7]。但是關(guān)于生長抑素能否通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路是在胰腺癌細胞中的研究尚不明確,因此,本研究于2018年12月至2019年12月通過探討生長抑素聯(lián)合FOXD1通過PI3K/AKT通路調(diào)控胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,為胰腺癌的研究提供合理的數(shù)據(jù)支撐。

    1 材料與方法

    1.1 細胞與主要試劑胰腺癌細胞PANC-1購買于美國ATCC研究中心;胎牛血清(10025632C)購買于賽默飛生物、DMEM培養(yǎng)基(PAC0036)購買于武漢博士德生物公司;注射用生長抑素購買于揚子江集團藥業(yè)公司,批號H20066708,批次20180530,規(guī)格 :3 mg;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn) 染 試 劑 盒(10523005)購買于美國Thermo Fisher公司;pcDNA、FOXD1和引物購買于上海吉瑪公司;PI3K抑制劑LY294002(HY-10123)購買于美國Med Chem Express公司;MTT試劑盒(P0102S)購買于碧云天生物公司;Transwell小室(258730236120)、Matrigel基質(zhì)膠(334002)購買于美國BD公司;增殖細胞核抗原(PCNA)抗體(ab12165)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)抗體(ab204523)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-9)抗體(ab140352)、FOXD1抗體(ab128311)、磷酸化磷脂肌醇3激酶(p-PI3K)抗體(ab31075)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)抗體(ab8201)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)抗體(ab120245)、蛋白激酶B(AKT)抗體(ab32451)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體(ab7221)購買于購自美國Abcam公司;辣根過氧化物酶標記免疫球蛋白G(IgG)(ym-a0137G-HRP)購買于上海恒斐生物公司;Trizol試劑盒(9078)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR024A)、SYBR Green Premix試劑盒(RB732A)購買于大連寶生物工程有限公司。

    1.2 細胞培養(yǎng)和分組胰腺癌細胞PANC-1采用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi),置于5%二氧化碳、37℃條件下的恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)進行孵育培養(yǎng),2~3 d后進行傳代培養(yǎng)。收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞接種24孔細胞板內(nèi)(5×104個/孔),采用生長抑素濃度為0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L處理細胞,記為各生長抑素各劑量組,其中生長抑素濃度為0 mg/L和400 mg/L,記為Control組和SST組;參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將pcDNA和FOXD1轉(zhuǎn)染至PANC-1細胞,經(jīng)過400 mg/L的生長抑素及20 mol/L的PI3K抑制劑LY294002處 理 細 胞 ,記 為SST+pcDNA組 、SST+FOXD1組和SST+FOXD1+LY294002組。

    1.3 MTT檢測細胞增殖收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞接種至96孔板中(2×103個/孔),在恒溫培養(yǎng)箱固定培養(yǎng)48 h后,在每孔加入20 μL的MTT溶液,繼續(xù)培養(yǎng)孵育4 h,出去上清液,繼續(xù)加入150 μL的二甲基亞砜(DMSO),輕輕震蕩混勻,在酶標儀490 nm檢測細胞的光密度(OD)值,并計算半抑制濃度(IC50)值。

    1.4 Transwell檢測細胞遷移和侵襲細胞遷移實驗:收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞在不含胎牛血清培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h,消化培養(yǎng)后調(diào)整密度至105個/毫升。在Transwell上室加入200 μL細胞懸液,下室內(nèi)加入500 μL含胎牛血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用棉簽擦去未成功遷移的細胞,采用4%甲醛固定15 min后,結(jié)晶紫染色,30 min倒置在顯微鏡下觀察遷移細胞數(shù)目。

    細胞侵襲實驗:將Matrigel基質(zhì)膠在不含血清培養(yǎng)基稀釋,稀釋比例為1∶3,取200 μL稀釋的Matrigel基質(zhì)膠鋪板于Transwell上室內(nèi),風(fēng)干5 h,后續(xù)實驗同上述遷移實驗。

    1.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測PCNA、MMP-2、MMP-9、FOXD1和PI3K/AKT蛋白的表達收集生長狀態(tài)良好的PANC-1細胞,按照BCA試劑盒測定蛋白濃度。加入45 μg上樣蛋白經(jīng)過12% SDS-PAGE處理轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,然后在5%脫脂牛奶封閉培養(yǎng)2 h,加入PCNA(1∶500)、MMP-2(1∶500)、MMP-9(1∶500)、FOXD1(1∶500)、p-PI3K(1∶500)、p-AKT(1∶500)、PI3K(1∶800)、AKT(1∶800)和GAPDH(1∶1 000)抗體,4℃過夜培養(yǎng),次日加入辣根過氧化物酶標記二抗,室溫下培養(yǎng)2 h,加入ECL試劑顯影,曝光。采用Quantity One軟件掃描各組蛋白條帶的灰度值,然后以GAPDH為內(nèi)參計算蛋白的表達。

    1.6 qRT-PCR檢測FOXD1 mRNA的表達收集各組PANC-1細胞采用Trizol試劑提取細胞的總RNA,紫外分光光度計檢測濃度和純度。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,然后采用SYBR Green Premix試劑盒說明書進行PCR擴增 。 通 過2-ΔΔCt法 計 算FOXD1 mRNA的 表 達 。FOXD1正向引物5'-AAGAACCCGCTGGTGAAG-3',反向引物5'-GTCCAGTAGTTGCCCTTGC-3';GAPDH正向引物5'-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3',反向引物5'-GCC ATCACGCCACAGTTTC-3'。

    1.7 統(tǒng)計學(xué)方法通過采用SPSS 20.0分析處理實驗數(shù)據(jù),計量資料采用表示,兩組間比較采用t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用LSD-t方法。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 不同濃度的生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響隨著不同濃度(0 mg/L、100 mg/L、200 mg/L、400 mg/L)的生長抑素處理胰腺癌細胞后,結(jié)果顯示,隨著不同濃度生長抑素的增加,細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達逐漸降低(P<0.05)。其中生長抑素為400 mg/L達到半數(shù)抑制(IC50),因此選擇400 mg/L的生長抑素進行后續(xù)實驗。見圖1,表1。

    圖1 各組胰腺癌細胞增殖和遷移、侵襲蛋白表達

    表1 不同濃度生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    表1 不同濃度生長抑素對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    注:SST為生長抑素,OD為光密度,PCNA為增殖細胞核抗原,MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。①與0 mg/L組相比,P<0.05。

    SST濃度0 mg/L 100 mg/L 200 mg/L 400 mg/L F值P值重復(fù)次數(shù)9 9 99 OD值(490 nm)1.19±0.09 0.93±0.07①0.71±0.06①0.48±0.05①173.70<0.001遷移細胞數(shù)目/個132.72±12.28 115.78±11.70①89.32±8.47①63.42±6.71①82.23<0.001侵襲細胞數(shù)目/個125.56±10.37 106.11±9.52①83.51±7.78①60.23±5.26①100.28<0.001 PCNA 1.03±0.08 0.84±0.07①0.70±0.06①0.49±0.05①107.38<0.001 MMP-2 1.02±0.08 0.81±0.07①0.68±0.06①0.45±0.04①124.36<0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.79±0.06①0.64±0.05①0.42±0.04①165.52<0.001

    2.2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1的表達的影響選擇400 mg/L的生長抑素處理細胞,通過qRTPCR和Western blotting結(jié)果顯示,與Control組相比,SST組的FOXD1 mRNA和蛋白表達明顯降低(P<0.05);與SST+pcDNA組 相 比 ,SST+FOXD1組 的FOXD1 mRNA和蛋白表達明顯增加(P<0.05)。見圖2,表2。

    圖2 各組胰腺癌細胞FOXD1蛋白表達

    表2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1表達的影響/

    表2 生長抑素對胰腺癌細胞FOXD1表達的影響/

    注:Control為對照組,SST為生長抑素組,SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組,SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組,F(xiàn)OXD1為轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1。①與Control組相比,P<0.05。②與SST+pcDNA組相比,P<0.05

    組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9999 FOXD1 mRNA 1.02±0.06 0.47±0.03①0.49±0.04 0.67±0.05②271.64<0.001 FOXD1蛋白0.99±0.07 0.42±0.04①0.39±0.03 0.64±0.06②250.69<0.001

    2.3 生長抑素聯(lián)合FOXD1對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響與Control組相比,SST組的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低(P<0.05);與SST+pcDNA組相比,SST+FOXD1組的OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖3,表3。

    表3 FOXD1過表達對生長抑素處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    表3 FOXD1過表達對生長抑素處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    注:Control為對照組,SST為生長抑素組,SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組,SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組,OD為光密度,PCNA為增殖細胞核抗原,MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。①與Control組相比,P<0.05。②與SST+pcDNA組相比,P<0.05。

    組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9999 OD值(490 nm)1.15±0.11 0.52±0.05①0.49±0.04 0.71±0.07②158.03<0.001遷移細胞數(shù)目/個129.32±11.44 66.79±7.22①62.73±6.82 86.88±8.46②111.09<0.001侵襲細胞數(shù)目/個123.57±11.63 63.72±6.51①65.78±5.59 81.52±7.30②105.95<0.001 PCNA 1.01±0.08 0.47±0.05①0.45±0.04 0.66±0.06②171.98<0.001 MMP-2 0.99±0.07 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.06②241.09<0.001 MMP-9 0.97±0.07 0.44±0.05①0.43±0.04 0.67±0.05②201.68<0.001

    圖3 各組胰腺癌細胞增殖及遷移、侵襲蛋白表達

    2.4 生長抑素聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT信號通路的表達與Control組相比,SST組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯降低(P<0.05);與SST+pcDNA組相比,SST+FOXD1組p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯升高(P<0.05)。見圖4,表4。

    表4 過表達FOXD1對生長抑素處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響/

    表4 過表達FOXD1對生長抑素處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響/

    注:Control為對照組,SST為生長抑素組,SST+pcDNA為pcDNA轉(zhuǎn)染組,SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組,PI3K為磷脂酰肌醇3激酶,p-PI3K為磷酸化磷脂肌醇3激酶,AKT為蛋白激酶B,p-AKT為磷酸化蛋白激酶B。①與Control組相比,P<0.05。②與SST+pcDNA組相比,P<0.05。

    組別Control SST SST+pcDNA SST+FOXD1 F值P值重復(fù)次數(shù)9 999 p-PI3K/PI3K 1.03±0.08 0.43±0.04①0.40±0.03 0.62±0.05②265.99<0.001 p-AKT/AKT 0.99±0.07 0.39±0.03①0.42±0.04 0.65±0.06②251.43<0.001

    圖4 各組胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

    2.5 加入LY294002抑制劑對PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響與SST+FOXD1組相比,SST+FOXD1+LY294002組的p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖5,表5。

    表5 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達的影響

    圖5 各組胰腺癌細胞PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達

    2.6 生長抑素聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路對胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響與SST+FOXD1組 相 比 ,SST+FOXD1+LY294002組 的FOXD1 mRNA及蛋白表達、OD值、遷移細胞數(shù)目、侵襲細胞數(shù)目、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖6,表6。

    表6 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    表6 LY294002對生長抑素與FOXD1聯(lián)合處理的胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響/

    注:SST+FOXD1為FOXD1轉(zhuǎn)染組,SST+FOXD1+LY294002為生長抑素及PI3K抑制劑LY294002處理組,F(xiàn)OXD1為轉(zhuǎn)錄因子叉頭框蛋白D1,OD為光密度,PCNA為增殖細胞核抗原,MMP為基質(zhì)金屬蛋白酶。

    組別SST+FOXD1 SST+FOXD1+LY294002 t值P值重復(fù)次數(shù)99 FOXD1 mRNA 0.72±0.06 0.37±0.04 14.56<0.001 FOXD1蛋白0.93±0.05 0.35±0.03 29.84<0.001 OD值(450 nm)0.69±0.06 0.53±0.05 6.15<0.001遷移細胞數(shù)目/個83.72±7.20 67.19±6.46 5.13<0.001侵襲細胞數(shù)目/個78.57±7.52 62.52±5.16 5.28<0.001 PCNA 1.01±0.07 0.41±0.05 20.93<0.001 MMP-2 0.97±0.07 0.39±0.04 21.58<0.001 MMP-9 0.99±0.07 0.44±0.04 20.47<0.001

    圖6 各組胰腺癌細胞FOXD1蛋白及增殖和遷移、侵襲蛋白表達

    3 討論

    胰腺癌多發(fā)于糖尿病病人和慢性胰腺炎病人,臨床癥狀表現(xiàn)為腹痛、腹部飽脹不適和消瘦無力等現(xiàn)象,受吸煙、高脂肪、飲酒、飲用咖啡和環(huán)境等因素影響[8-9]。生長抑素作為臨床治療腫瘤和癌癥常見的藥物,在抗癌方面具有一定的作用效果,最早是由Krulich于1968年在大鼠下丘腦生長激素釋放因子,是一種抑制生長激素的物質(zhì),經(jīng)過Brazeau分離提純[10-11]。生長抑素不僅能減少胰腺、胃小腸和膽囊等分泌,還能夠減少酶活性,對腫瘤細胞具有保護作用,可以作為抗腫瘤的一種藥物[12]。有研究發(fā)現(xiàn),生長抑素聯(lián)合吉西他濱抑制胰腺癌細胞增殖[13]。朱威等[14]研究結(jié)果顯示,生長抑素藥物通過下調(diào)環(huán)氧化酶2(Cox-2)抑制胃癌細胞增殖和誘導(dǎo)細胞的凋亡。丁瑞賢[15]研究結(jié)果顯示,生長抑素通過調(diào)控Wnt/β-連環(huán)蛋白通路抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示,結(jié)果不同濃度的生長抑素抑制胰腺癌細胞,結(jié)果顯示,細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目明顯降低,PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達下調(diào),說明生長抑素可以明顯抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,具有抗腫瘤的作用。

    FOXD1是FOXD家族成員之一,位于染色體5q12區(qū)域,廣泛存在于真核組織和細胞中[16],有研究發(fā)現(xiàn),F(xiàn)OXD1在結(jié)直腸癌組中表達上調(diào),與腫瘤分化程度、分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和不良預(yù)后顯著相關(guān),沉默F(xiàn)OXD1可以抑制結(jié)直腸癌細胞增殖、遷移和侵襲,并促進其凋亡[17]。Pan等[18]研究結(jié)果顯示,F(xiàn)OXD1在大腸癌組織中表達上調(diào),異常表達與一些臨床表現(xiàn)(腫瘤大小、分化、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等)有關(guān),敲低FOXD1減弱了大腸癌細胞增殖、遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示,生長抑素可以下調(diào)FOXD1 mRNA和蛋白表達,過表達FOXD1可以逆轉(zhuǎn)生長抑素對胰腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲的作用,說明生長抑素通過上調(diào)FOXD1發(fā)揮在胰腺癌細胞中的作用。PI3K家族可以參與多種通路(PI3K、PTEN、AKT)調(diào)控腫瘤細胞的生長、轉(zhuǎn)移等[19],Zhang等[20]研究結(jié)果顯示鳶尾素可以通過下調(diào)PI3K/AKT通路抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,并誘導(dǎo)細胞凋亡。經(jīng)過生長抑素處理細胞后,p-PI3K、p-AKT蛋白表達下調(diào),過表達FOXD1則上調(diào)p-PI3K、p-AKT蛋白表達,說明生長抑素通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通 路 的 表 達 。 加 入PI3K抑 制 劑LY294002處理后,p-PI3K、p-AKT蛋白表達下調(diào),細胞的OD值、遷移細胞數(shù)目和侵襲細胞數(shù)目明顯降低,F(xiàn)OXD1 mRNA表達下調(diào),F(xiàn)OXD1、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表達下調(diào),這說明生長抑素通過聯(lián)合FOXD1調(diào)控PI3K/AKT通路影響胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

    綜上所述,生長抑素通過上調(diào)FOXD1的表達抑制PI3K/AKT通路抑制胰腺癌細胞增殖、遷移和侵襲。

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