豆腐果苷對骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨和滑膜組織影響

郭南，賈元威，項婷，王萍，詹翠嬌，王昌茂，沈杰，，楊斌

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)退化或老化作為病理基礎(chǔ)，以關(guān)節(jié)腫脹、疼痛或功能障礙作為主要臨床表現(xiàn)的一類關(guān)節(jié)炎性疾病［1-3］，近年來骨關(guān)節(jié)炎發(fā)病也見于青少年［4］。目前臨床尚無滿意的治療方法，臨床治療為減輕炎性癥狀和改善功能狀態(tài)，常用藥物有止痛藥、非甾體抗炎藥、腎上腺皮質(zhì)激素［5］等，長期應用會導致胃腸道不良反應和代謝紊亂等副作用。青少年病人急需一種具有明確療效且副作用小的治療藥物。

豆腐果苷（圖1，helicid，對甲醛苯-O-β-D-阿咯吡喃糖苷）提取自山龍眼科山龍眼屬植物深綠山龍眼果實，是此種屬植物來源唯一已上市成功應用于臨床的酚苷類物質(zhì)［6］。毒理學研究表明，27 mg·kg-1·d-1、270 mg·kg-1·d-1、1 350 mg·kg-1·d-1劑量母體染毒對大鼠仔代的早期生理發(fā)育及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育沒有影響［7］。文獻報道，口服豆腐果苷在6.25～50.00 mg/kg范圍內(nèi)的鎮(zhèn)痛作用呈劑量依賴性。本課題組前期基于豆腐果苷抗骨關(guān)節(jié)炎模型（OA模型）大鼠疼痛的藥效學研究發(fā)現(xiàn)，給予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg劑量豆腐果苷21 d后，均可使骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠的機械痛閾值上升，藥效學行為呈現(xiàn)鐘形曲線，50 mg/kg劑量組升高機械痛值閾值作用最強［8］。因此本研究選擇50 mg/kg豆腐果苷作為給藥劑量。

圖1 豆腐果苷分子結(jié)構(gòu)式

采用膝關(guān)節(jié)注射一定濃度碘乙酸鈉可快速建立穩(wěn)定、高效的OA大鼠模型，且大鼠病理表現(xiàn)與關(guān)節(jié)炎患者臨床表現(xiàn)相似，包括關(guān)節(jié)疼痛、間歇性炎癥和關(guān)節(jié)神經(jīng)損傷。這種方法是研究骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典可靠模型［9-10］。

本研究旨在首次探討對骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠具有明確鎮(zhèn)痛作用的豆腐果苷50 mg/kg劑量給藥后，大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的病理變化。本研究分別采用HE染色與番紅固綠染色分別對大鼠軟骨和滑膜進行染色觀察，并分別進行相應的評分鑒定，以定量評價豆腐果苷對大鼠骨關(guān)節(jié)炎的影響。

1 材料與方法

1.1 材料健康雄性SD大鼠共24只［上海杰思捷實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（滬）2018-0004］，SPF級，體質(zhì)量（180±20）g。恒溫（22±2）℃，12 h光照/黑暗循環(huán)條件下自由飲水飲食適應性飼養(yǎng)1周后，開展動物實驗。本研究所有動物實驗操作均符合一般動物實驗倫理學原則。研究起止時間為2019年12月至2020年7月。

1.2 藥品與試劑豆腐果苷（TCI Japan公司，純度＞98%，批號QCCYK-GS）；碘乙酸鈉（Sigma-Aldrich，≥98%，批號SLBZ7569）；蘇木素染色液（無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司，批號200423）；番紅染色液和固綠染色液（Sigma公司）；伊紅染色液（無錫市江原實業(yè)技貿(mào)總公司，批號200609）。

1.3 主要儀器熒光倒置顯微鏡（T8 TOKYO，Nikon公司，JAPAN）；切片機（型號LEICA 2245，Germany）；精密電子天平（AL104-IC，METTLER TOLEDO）；數(shù)顯游標卡尺（杭州鋼拓工具有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 骨關(guān)節(jié)炎大鼠模型 結(jié)合相關(guān)研究提及的大鼠骨關(guān)節(jié)炎造模方法進行造模［11-12］。操作過程大致為，使用10%水合氯醛（3 mL/kg，ip）對大鼠進行麻醉；直至大鼠所有感覺反射停止，對左右膝關(guān)節(jié)進行剃毛，醫(yī)用碘伏消毒后用75%乙醇脫碘2次；膝關(guān)節(jié)屈曲45°，自髕骨下韌帶外側(cè)進行關(guān)節(jié)腔穿刺，進針到股骨髁后稍微回退，一次性膝關(guān)節(jié)腔注射50 μL碘乙酸鈉（0.9%滅菌生理鹽水配制，濃度為3 mg/50 μL）；將大鼠膝蓋伸展和彎曲30 s，使碘乙酸鈉溶液分散至整個膝關(guān)節(jié)處。同時，假手術(shù)組對大鼠膝關(guān)節(jié)注射等量生理鹽水。

1.4.2 分組和給藥 造模成功后，將假手術(shù)大鼠分為一組，骨關(guān)節(jié)炎模型大鼠隨機區(qū)組分組法分為模型組和50 mg/kg豆腐果苷治療組，每組8只。豆腐果苷給藥方法：大鼠禁食12 h，造模前1天開始于上午7：30～8：30以50 mg/kg劑量豆腐果苷溶液灌胃大鼠，模型組和假手術(shù)組分別給予等量生理鹽水灌胃。灌胃每天1次，持續(xù)21 d。

1.4.3 膝關(guān)節(jié)標本收集、制備、觀察 給藥21 d后，使用1%戊巴比妥鈉（35 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，并頸椎脫臼法處死大鼠。固定大鼠后，分離右側(cè)膝關(guān)節(jié)皮膚及皮下組織，剔除周圍的肌肉組織，保留股骨遠1/4和脛骨近端1/4截取整個大鼠膝關(guān)節(jié)，并于4%多聚甲醛溶液中固定24 h以上。固定后的大鼠膝關(guān)節(jié)用15%EDTA脫鈣4周后，進行石蠟包埋，切片，以及HE和番紅固綠染色分別觀察與評價軟骨和滑膜病理變化。本研究在2月齡青年期大鼠體內(nèi)開展，此月齡大鼠發(fā)育不完全，潮線尚不清晰［13-14］，所以在評價時采用改良的Mankin評分，潮線完整性和清晰度不計入評分。

1.4.3.1 HE染色評價 熒光倒置顯微鏡下觀察關(guān)節(jié)軟骨、滑膜形態(tài)，分別對假手術(shù)組、模型組及豆腐果苷給藥組滑膜組織病理學進行鑒定評分。（1）滑膜組織病理評分［15］。炎細胞：0分，無；1分，稀疏、散在；2分，較密集；3分，大量。（2）纖維組織增生：0分，無；1分，少量增生；2分，中等；3分，大量。（3）滑膜組織增生：0分，無；1分，單層；2分，2層；3分，3層。（4）巨噬細胞增生：0分，無；1分，稀疏；2分，較密集；3分，大量。

1.4.3.2 Mankin評分 熒光倒置顯微鏡下觀察大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨與軟骨下骨和骨組織間關(guān)系。并對軟骨病理變化進行Mankin評分［16］。評分標準［17］：（1）軟骨結(jié)構(gòu)：正常，0分；表面不規(guī)則，1分；血管翳，2分；血管翳和表面不規(guī)則，3分；到過渡帶的裂隙，4分；到放射帶的裂隙，5分；到鈣化帶的裂隙，6分。（2）軟骨細胞：正常，0分；細胞形態(tài)固縮及脂質(zhì)變性，1分；大量簇集樣細胞團，1分；數(shù)量明顯消失，3分。（3）番紅固綠染色：正常，0分；輕度減少，1分；中度減少，2分；重度減少，3分；未著色，4分。（4）潮線完整性：完整，0分；被血管破壞，1分；總分14分。

1.5 統(tǒng)計學方法SPSS 19.0軟件用于本實驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析，采用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 膝關(guān)節(jié)形態(tài)觀察圖2可見假手術(shù)組關(guān)節(jié)面色澤正常，關(guān)節(jié)表面光滑，未見關(guān)節(jié)腫脹及積液形成。模型組較之假手術(shù)組，關(guān)節(jié)軟骨表面不規(guī)則，有潰瘍形成，腔內(nèi)出現(xiàn)積液。豆腐果苷組關(guān)節(jié)表面與模型組相比，關(guān)節(jié)軟骨表面較完整，潰瘍有較大改善，腔內(nèi)未出現(xiàn)積液。我們通過對處死后大鼠，采用數(shù)顯游標卡尺測量各組大鼠膝關(guān)節(jié)直徑，研究各組大鼠膝關(guān)節(jié)的腫脹程度。如圖2所示，可以清晰觀察到豆腐果苷可顯著緩解模型組關(guān)節(jié)腫脹。上述結(jié)果共同表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉誘導的關(guān)節(jié)損傷。

2.2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果由圖3中大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨HE染色結(jié)果可知，假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑，且細胞排列規(guī)則，四層結(jié)構(gòu)清晰，軟骨基質(zhì)染色均勻，未見炎細胞浸潤。相對于假手術(shù)組，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表面粗糙且有絨毛狀，軟骨細胞排列紊亂，軟骨基質(zhì)染色不均，部分區(qū)域的細胞核固縮、壞死，有炎性細胞浸潤和血管生成。但是在給予豆腐果苷治療后，大鼠軟骨表面較完整，軟骨基質(zhì)染色較均勻，四層結(jié)構(gòu)較清晰，細胞排列較整齊。結(jié)果表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉導致的大鼠關(guān)節(jié)軟骨組織病變。

2.3 各組大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色結(jié)果圖4中大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組可見大量的脂肪細胞和滑膜細胞；模型組較假手術(shù)組表現(xiàn)出更多的炎性細胞浸潤，滑膜組織明顯增厚，有散在的炎性細胞如淋巴細胞出現(xiàn)。但豆腐果苷組炎性細胞明顯減少，部分可見脂肪細胞和增生的血管。結(jié)果表明豆腐果苷可以減輕碘乙酸鈉誘導的炎性細胞增加。

2.4 各組大鼠滑膜組織病理評分結(jié)果對各組大鼠的滑膜組織病理特征進行評分可得，模型組大鼠的評分相對于假手術(shù)組顯著增大［（6.88±0.83）比（0.50±0.53）］（P＜0.01），在灌胃50 mg/kg豆腐果苷21 d后，大鼠的滑膜病理評分顯著降低［（3.50±0.53）比（6.88±0.83）］（P＜0.01）。以上數(shù)據(jù)表明50 mg/kg的豆腐果苷可以顯著改善骨關(guān)節(jié)炎大鼠的滑膜病理損傷。

2.5 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨番紅固綠染色結(jié)果如圖5，由大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨的番紅固綠染色圖可觀察到，假手術(shù)組軟骨細胞的細胞核呈粉紅色，細胞質(zhì)呈藍綠色，其軟骨細胞形態(tài)結(jié)果與HE染色結(jié)果基本相同，且軟骨基質(zhì)完整，染色均勻，無蛋白多糖丟失。而模型組番紅顯色明顯降低，軟骨基質(zhì)分布不均勻，蛋白多糖丟失明顯。在給予豆腐果苷治療后，軟骨較模型組基質(zhì)分布均勻，蛋白多糖丟失有顯著改善，表明豆腐果苷可以改善大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷。

2.6 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分結(jié)果豆腐果苷以50 mg/kg劑量灌胃大鼠21 d后的膝關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分結(jié)果如表1所示。數(shù)據(jù)顯示，較假手術(shù)組，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)、軟骨細胞和番紅固綠染色Mankin評分值均顯著上升（P＜0.01），而在豆腐果苷干預后，各項指標評分值較模型組均有顯著下降，以上數(shù)據(jù)提示豆腐果苷50 mg/kg可以減輕碘乙酸鈉誘導的青年大鼠膝關(guān)節(jié)病變程度。

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分比較/（分，）

表1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)Mankin評分比較/（分，）

注：①與假手術(shù)組比較，P＜0.01。②與模型組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組豆腐果苷組F值P值關(guān)節(jié)數(shù)888 Mankin評分軟骨結(jié)構(gòu)0.50±0.53 3.88±0.83①1.63±0.52②64.67＜0.001軟骨細胞0.25±0.46 1.75±0.46①1.13±0.64②37.56＜0.001番紅固綠染色0.38±0.52 2.38±0.74①0.88±0.64②52.43＜0.001

3 討論

骨關(guān)節(jié)炎是較為常見的關(guān)節(jié)疾病，影響全球約2.4億人，伴有極高的發(fā)病率和死亡率，可導致殘疾，嚴重降低了病人的生活水平［18-19］，并存在一定數(shù)量的青少年病人。進行性、不可逆的軟骨退化是骨關(guān)節(jié)炎標志病理特征之一，并且與滑膜、軟骨下骨和半月板及其他關(guān)節(jié)組織的病理發(fā)展密切相關(guān)［20］。向大鼠膝關(guān)節(jié)定量注射碘乙酸鈉建立OA模型是藥理學當中研究骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典方法。本研究的重點是探討豆腐果苷對碘乙酸鈉誘導的大鼠OA模型軟骨和滑膜組織的影響。與模型組大鼠相比，豆腐果苷可明顯減輕膝關(guān)節(jié)腫脹程度，改善關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)，并且減少了軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的丟失，以及抑制了膝關(guān)節(jié)滑膜組織增厚和炎癥細胞的增加。其原因可能與豆腐果苷的抗炎、鎮(zhèn)痛機制有關(guān)，后續(xù)將開展系列研究，進一步探索豆腐果苷減輕滑膜炎癥、保護軟骨的作用機制。

在OA的治療藥物中目前最常見的為非甾體類抗炎藥、對乙酰氨基酚等［21］，但因其長期給藥有嚴重的不良反應，限制了其使用。目前，對OA治療方法的研究表明天然產(chǎn)物及其衍生物具有一定的潛力，如附子［22］等。豆腐果苷在止痛、鎮(zhèn)靜、抗抑郁、心腦血管系統(tǒng)疾病及各種衍生物的研究等方面都有一定的療效，且毒副作用低，可長期使用［23］?；蛟S可與非甾體抗炎藥聯(lián)合使用或交替使用，以加強療效降低毒副作用，但還有待實驗進一步證實。

此外有研究表明，豆腐果苷結(jié)構(gòu)類似物天麻素（gastrodin，對羥甲基苯-O-β-D-吡喃葡萄糖苷）可通過抑制OA大鼠軟骨退化而抑制OA進程。本研究結(jié)果也顯示豆腐果苷可抑制OA大鼠軟骨退化。我們猜想，其發(fā)揮作用的機制是否與天麻素相似，即通過抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB途徑，減少炎性因子，包括IL-6，TNF-α等的釋放來發(fā)揮抗炎作用［24］，這有待進一步研究。據(jù)報道，豆腐果苷及其代謝產(chǎn)物與天麻素有很多相似藥效學作用，對此類具有明確藥效作用且不良反應極少的天然產(chǎn)物的深入研究，是發(fā)現(xiàn)新的天然產(chǎn)物及新的作用靶標與通路的重要途徑。

綜上，豆腐果苷可顯著改善碘乙酸鈉誘導的骨關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)滑膜和軟骨的病理損傷。本研究為豆腐果苷應用于軟骨病變和滑膜炎的臨床防治提供了一定的理論基礎(chǔ)。此外，本課題組在研究結(jié)果的基礎(chǔ)上還將對豆腐果苷發(fā)揮骨關(guān)節(jié)炎治療作用的具體分子機制進一步研究。