PLA2R-IgG間接熒光定量免疫層析分析的構(gòu)建與應(yīng)用*

張藝 周穎 周衍 馬騏 葉燕 殷皓 俞蕾 周彬 王春新*

（1）江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，國家衛(wèi)生健康委員會核醫(yī)學(xué)重點實驗室，江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點實驗室，無錫 214063；2）南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗科，無錫 214023；3）南京醫(yī)科大學(xué)原子醫(yī)學(xué)教學(xué)科研基地，南京 211166）

特發(fā)性膜性腎?。╥diopathic membranous nephropathy，IMN）發(fā)病率在中國呈逐年上升趨勢，其診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為腎臟活檢［1-2］。然而腎臟穿刺具有侵入性和復(fù)雜性，需要操作專業(yè)的醫(yī)護(hù)才能開展，而且需要患者入院進(jìn)行，這使得IMN的準(zhǔn)確診斷受到了局限。Beck等［3-4］發(fā)現(xiàn)70%以上的IMN患者體內(nèi)存在磷脂酶A2受體（phospholipase A2 receptor，PLA2R）的抗體IgG，隨著研究深入，腎臟病權(quán)威組織“改善全球腎臟病預(yù)后組織（Kidney Disease Improving Global Outcomes，KDIGO）”制定了IMN的臨床實踐指南，提出血清PLA2R-IgG作為首要診斷依據(jù)，根據(jù)測定結(jié)果再考慮是否活檢［5］，因此該指標(biāo)的檢測必要且關(guān)鍵。同時，PLA2R-IgG水平與IMN疾病進(jìn)程和緩解相關(guān)，能夠指導(dǎo)個性化用藥，低濃度水平意味著可持續(xù)使用保守療法［5-6］。因此，定量分析PLA2RIgG也是新方法必備的性能。目前臨床主要采用酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme-linked immune sorbent assay，ELISA）作為檢測手段［7］。ELISA檢測線性范圍寬，適合批量測試，但不適合門診患者隨到隨檢。因此，研制單人份、快速且定量的PLA2RIgG檢測方法十分必要。

本研究首次報道采用兩步法進(jìn)行PLA2R-IgG的間接免疫層析分析（immunochromatographic assay，ICA），令抗原抗體能在短小的試紙條上充分反應(yīng)，在保證快速性的前提下，提高檢測的特異性；使用鑭系元素銪（Eu）作為發(fā)光物質(zhì)，發(fā)揮該元素?zé)晒庑盘枏?qiáng)、背景低、抗干擾的特性，進(jìn)而實現(xiàn)PLA2R-IgG抗體的快速、靈敏、定量檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

HG-98免疫層析定量分析儀為上?；焦井a(chǎn)品，酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司生產(chǎn)，噴金劃膜儀和切條機(jī)由杭州賽凱生物公司制造。帶羧基的Eu熒光微球（Bangs Laboratories，美國），重組表達(dá)的PLA2R抗原（無錫傲銳東源），抗人IgG單抗（Hytest，芬蘭）；羊抗鼠IgG抗體、樣品墊、硝酸纖維素膜、吸水紙、6 cm底板和卡殼購自杰一生物（中國）。N-羥基丁二酰亞胺（NHS），2-［N-嗎啉］乙磺酸（MES），1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）和牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma-Aldrich（美國）。其他試劑均為國藥滬試生產(chǎn)，純度為分析純。PLA2R-IgG抗體標(biāo)準(zhǔn)品和ELISA檢測試劑盒為德國歐蒙醫(yī)學(xué)實驗診斷股份公司產(chǎn)品。

1.2 抗體偶聯(lián)熒光微球的制備

將1 mg羧基微球溶解在500 μl的制備液（0.1 mol/L的MES溶液）中，先用超聲儀分散，再離心15 000×g，時長20 min，將上清液小心地吸去，重復(fù)兩次；之后，向微球中加入100 μl含有1 mg NHS和1 mg EDC的水溶液，用制備液補(bǔ)齊體積至500 μl，避光振蕩反應(yīng)0.5 h后，用該溶液洗滌微球3次；再將一定量的抗人IgG單抗加入至已活化的微球中，避光振蕩2 h；然后，向反應(yīng)液中加入10 μl含10% BSA的Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH7.2），避光振蕩0.5 h；用蒸餾水洗滌去除多余抗體，方法同前；最后，將偶聯(lián)了抗人IgG單抗的微球復(fù)溶于含1%BSA和0.1%Tween-20的Tris-HCl緩沖液（0.05 mol/L，pH7.2）中，使其濃度為2.5 g/L。

1.3 試紙條的制備

PLA2R-IgG-ICA試紙條由樣品墊、硝酸纖維素膜（NC膜）、吸水紙和6 cm底板構(gòu)成，制備時，先把硝酸纖維素膜貼在背板中央，再把PLA2R抗原或羊抗鼠二抗分別噴涂在硝酸纖維素膜上，構(gòu)成間隔5 mm的檢測線（test line，T line）和質(zhì)控線（control line，C line）。30℃烘干膜條2 h，以固定上述蛋白質(zhì)。然后，將樣品墊和吸水紙分別粘貼于上述硝酸纖維素膜兩端，形成2 mm的重疊。最后，將切割成4 mm寬的免疫層析試紙條帶裝入單人份的塑料卡殼中，再放入鋁膜袋長期保存。

1.4 檢測步驟

將血清樣本用稀釋液（含有0.5%BSA的pH7.8 0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液）按適當(dāng)比例稀釋，滴加入速測卡加樣孔內(nèi)，37℃孵育。再加入由稀釋液配制的抗人IgG單抗標(biāo)記的Eu微球，37℃孵育適當(dāng)時間。隨后將速測卡插入HG-98免疫層析定量分析儀檢測，儀器自動顯示檢測結(jié)果。反應(yīng)過程示意見圖1。

Fig.1 Reaction principle diagram of PLA2R-IgG-ICA

1.5 性能考核

參照現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)［8］，對構(gòu)建的PLA2R-IgGICA進(jìn)行方法學(xué)考核。a.線性：檢測PLA2R-IgG標(biāo)準(zhǔn)品0、10、20、100、500、1 500 RU/ml，各3次，對結(jié)果進(jìn)行線性擬合并計算相關(guān)系數(shù)R；b.準(zhǔn)確性：通過向兩個低值樣本等體積添加PLA2RIgG標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個添加樣重復(fù)測定2次，實測值與理論值的比值為回收率；c.精密度：對濃度為19.8 RU/ml和102.7 RU/ml兩個血樣各重復(fù)測定10次，通過計算均值（Mean）和標(biāo)準(zhǔn)差（SD），獲得變異系數(shù)（CV）；d.靈敏度：平行測定20次標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，計算所測濃度的Mean+2×SD的值，此值即為靈敏度；e.特異性：檢測高純度的350 IU/ml抗過氧化物酶抗體和3 250 IU/ml抗甲狀腺球蛋白抗體，若交叉反應(yīng)率低于1%則認(rèn)為特異性較好；f.加速穩(wěn)定性：將37℃放置10 d與2～8℃保存的試劑同步檢測標(biāo)準(zhǔn)品，計算各濃度點漂移率，若平均偏差小于15%，認(rèn)為試劑穩(wěn)定。

1.6 臨床應(yīng)用

IMN患者的血清樣本采集由南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院提供，經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：2020LLSL-ⅡYZ-08-01，收集時間是2020年10月～2021年4月。血樣使用分離膠血清管采集，離心分離后分裝保存于-40℃冰箱，檢測前恢復(fù)至室溫使用。方法比對的相關(guān)性用Passing-Bablok分析，相關(guān)系數(shù)R＞0.9且P＜0.05認(rèn)為相關(guān)性好；陰陽一致性和其他參數(shù)的比較通過Pearson卡方檢驗統(tǒng)計分析，P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 PLA2R-IgG免疫層析法的反應(yīng)模式

本研究采用間接法檢測，首先對反應(yīng)步驟進(jìn)行考察。傳統(tǒng)的免疫層析法采用一步法檢測，將樣品與微球一起加在樣品墊上，經(jīng)毛細(xì)管層析作用與T線和C線的抗原、抗體反應(yīng)。從圖2a的1和2條帶熒光照片可知，一步法熒光微球與樣品在樣品墊和NC膜交疊處產(chǎn)生蓄積，形成非特異條帶。此外，從圖2b的劑量曲線可知，一步法測量低濃度和高濃度標(biāo)準(zhǔn)品時曲線彎曲，影響線性范圍。為解決此現(xiàn)象，本研究采用兩步加樣：先加入PLA2R-IgG標(biāo)準(zhǔn)品或稀釋樣品，令抗體與T線的PLA2R抗原反應(yīng)，同時未反應(yīng)的干擾物可被吸水紙吸附；再加入微球標(biāo)記的抗人IgG抗體，經(jīng)層析作用，于T線形成PLA2R抗原-人PLA2R IgG-微球抗人IgG抗體的復(fù)合物，過量的微球可被C線的羊抗鼠IgG捕獲，未反應(yīng)的試劑被吸水紙吸收。從圖2可知，兩步法比一步法降低了微球的非特異結(jié)合，且檢測的線性范圍更寬。

Fig.2 Comparison of PLA2R-IgG-ICA between one-step and two-step methods

2.2 檢測方法的優(yōu)化

為優(yōu)化微球標(biāo)記效率，本研究對微球制備液的pH和Eu微球-抗體反應(yīng)比率進(jìn)行選擇，按照二步法反應(yīng)，用標(biāo)記的微球分別檢測空白和高值標(biāo)準(zhǔn)品（1 500 RU/ml的PLA2R-IgG），每個濃度水平測量2次。用pH4.5、5.0和5.5的制備液標(biāo)記的微球分別檢測標(biāo)準(zhǔn)品（圖3）。當(dāng)制備液pH為5.0時，空白標(biāo)準(zhǔn)品的T/C（T線與C線熒光信號的比值）低，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品T/C最高，所以采用pH5.0為制備液的最佳反應(yīng)pH體系。

Fig.3 The effect of pH of MES buffer

為提高微球-抗體熒光信號，降低非特異吸附，對Eu微球和抗人IgG單抗的反應(yīng)質(zhì)量比按10∶1、25∶1、50∶1和100∶1進(jìn)行篩選（圖4）。當(dāng)按照25∶1反應(yīng)時，反應(yīng)的高值標(biāo)準(zhǔn)品T/C高、空白標(biāo)準(zhǔn)品T/C較低，效果最佳，因此選擇該條件制備微球。

Fig.4 The effect of the reactive ratio of Eu-microspheres vs anti-human IgG

為方便操作，令每步反應(yīng)時間一致，然后考察了5、10和15 min/步對結(jié)果的影響（圖5）。綜合空白和高值標(biāo)準(zhǔn)品熒光計數(shù)的差異與時效，選擇10 min/步為最適反應(yīng)時間，即總孵育時間為20 min。

Fig.5 The effect of different reaction time

2.3 檢測方法的性能指標(biāo)

采用優(yōu)化方案構(gòu)建的PLA2R-IgG ICA靈敏度為0.7 RU/ml，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.771x-1.437，相關(guān)系數(shù)R=0.995，線性測量范圍為0.7～1 500 RU/ml（圖6）。向健康體檢者血清樣本中添加系列標(biāo)準(zhǔn)品，計算方法的添加回收率。由表1可知本方法回收率為86.27%～98.98%，在80%～120%范圍內(nèi)，判為方法準(zhǔn)確。平行測定2例PLA2R-IgG濃度值分別為（18.91±1.94）RU/ml和（111.50±6.70）RU/ml的血樣，平均批內(nèi)CV為8.13%，小于15%，認(rèn)為方法重復(fù)性好。用本方法分別檢測350 IU/ml抗過氧化物酶抗體和3 250 IU/ml抗甲狀腺球蛋白抗體，結(jié)果分別為0.6 RU/ml和0.3 RU/ml，交叉反應(yīng)率均小于0.1%，認(rèn)為新方法具有特異性。為考核按此方法制備試劑的穩(wěn)定性，將已稀釋微球溶液和試紙條置于37℃烘箱10 d，再檢測標(biāo)準(zhǔn)品，與2～8℃保存的試劑相比，各濃度點偏移程度分別為：4.7%、14.7%、13.1%、0.4%和4.2%，平均值為7.4%，因此可知試劑存于37℃10 d穩(wěn)定。

Fig.6 The standard curve of PLA2R-IgG ICA

Table 1 The recoveries of PLA2R-IgG ICA

2.4 臨床應(yīng)用

采用本方法與市售的ELISA試劑盒同步檢測52例IMN患者的血清樣本（圖7），得到的相關(guān)性回歸方程y=0.805x+0.373，R=0.953。R＞0.9且P＜0.01認(rèn)為兩種檢測相關(guān)。本方法與ELISA試劑盒的正常參考值均為20 RU/ml，＜20 RU/ml判為陰性，否則為陽性。表2顯示了兩個方法的一致性比較和臨床樣本的一般信息，結(jié)果表明：IMN患者的性別與PLA2R-IgG水平有顯著相關(guān)（P＜0.05），而是否老年患者、腎小球濾過率（eGFR，按CKD-EPI公式計算）異常程度與PLA2R-IgG水平無顯著關(guān)系（P＞0.05），與市售ELISA試劑盒陰陽性判斷一致（P＜0.05）。本方法對IMN的檢出率為76.9%（40/52），與現(xiàn)有報導(dǎo)相符［3］。

Fig.7 The correlation of PLA2R-IgG-ICA and ELISA for detection IMN samples

Table 2 The results of PLA2R-IgG in serum samples of IMN patients with clinical parameters

3 討 論

本研究構(gòu)建了一種采用鑭系元素為熒光劑的PLA2R-IgG-ICA，反 應(yīng) 時 間20 min，靈 敏 度0.7 RU/ml，線性范圍跨3個數(shù)量級，測量上限至1 500 RU/ml，且方程回歸系數(shù)R＞0.990，對IMN的臨床檢出率達(dá)到76.9%，與國內(nèi)外報道相符。而同類的ELISA試劑盒靈敏度0.6 RU/ml，線性范圍6～1 500 RU/ml，回歸系數(shù)R＞0.975，且需要1.25 h反應(yīng)。綜上，PLA2R-IgG-ICA性能指標(biāo)與ELISA近似，能準(zhǔn)確定量，且反應(yīng)時間大幅減短。而ICA具有單人份特性，因此本檢測方法在小樣本量和隨到隨檢方面具有優(yōu)勢。

由于人血清中抗體混雜，若同時加入熒光劑標(biāo)記的二抗，容易在層析試紙條上產(chǎn)生非特異結(jié)合，并造成勾狀效應(yīng)，縮短測量范圍，造成結(jié)果判讀不準(zhǔn)［9］，這些現(xiàn)象在本研究采用一步法檢測PLA2RIgG時也存在。為解決上述問題，本方法采用兩步法加液，將樣本與示蹤微球先后加入樣品墊，令待測物與NC膜中的靶抗原充分反應(yīng)，使得再加入的微球二抗能更精準(zhǔn)的捕獲T線上的一抗，進(jìn)而形成目標(biāo)免疫復(fù)合物。本研究首次通過二步法反應(yīng)，提高了試紙條免疫反應(yīng)的充分性，提升了標(biāo)記抗體的靶向性，增加了反應(yīng)靈敏度和測量范圍。本方法總孵育時間20 min，較常規(guī)ICA的15 min［10］適當(dāng)延長，但與ELISA相比仍具有時間優(yōu)勢。

床旁檢測價格低廉、操作便捷、即時高效，不使用復(fù)雜的儀器，也不需要專業(yè)的檢驗人員，因此特別適合于迅速指導(dǎo)臨床治療，在單人次臨床檢測中發(fā)揮越來越大的作用［11-13］。ICA為床旁檢測的最常見形式，廣泛用于醫(yī)學(xué)檢測、治療監(jiān)測、食品安全等領(lǐng)域［13-16］。ICA常采用膠體金示蹤，根據(jù)顏色的深淺判斷結(jié)果，只能定性和半定量檢測。而通過前期研究可知：鑭系元素的激發(fā)光波長范圍較寬，發(fā)射峰范圍窄，本底熒光強(qiáng)度低，有助于提高檢測靈敏度［17-19］，將鑭系元素與ICA融合將大幅度地提高檢測的靈敏度和特異性，實現(xiàn)ICA的全定量檢測［20-21］。本研究使用含Eu的微球作為示蹤物，用微球?qū)u包裹其中，使后者與水相隔離，避免了熒光猝滅，也無需使用增強(qiáng)液等信號放大試劑，從而進(jìn)一步提高了反應(yīng)效率和便捷度，并且在已構(gòu)建的夾心法的基礎(chǔ)上［20］，拓展了鑭系元素ICA的反應(yīng)類型，再次證明間接法在該檢測體系上的可行性。

然而ICA受層析介質(zhì)的影響，不同廠家的硝酸纖維素膜、吸水紙都可能產(chǎn)生不同的層析效果，而且試紙條長短也會影響免疫反應(yīng)［22］。本方法僅針對杰一公司提供的試紙條原材料，在6 cm試紙條上進(jìn)行了PLA2R-IgG檢測研究，其他長度和廠家的試紙條是否適用于本指標(biāo)檢測有待進(jìn)一步考量。

4 結(jié) 論

本文基于首創(chuàng)的兩步法反應(yīng)和Eu熒光微球示蹤的免疫層析技術(shù)，實現(xiàn)了即時、定量、靈敏、準(zhǔn)確檢測人血清中PLA2R-IgG。與市售ELISA試劑相比，本方法具有單人份和隨到隨測的優(yōu)勢，具有普及推廣前景。