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    穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)突變型p53野生型功能的作用及機(jī)制研究*

    2022-09-22 02:42:18王嘉健蘇永南王玉玲張繼虹
    關(guān)鍵詞:構(gòu)象穿心蓮培養(yǎng)箱

    宋 斌 王嘉健 蘇永南 王玉玲 楊 帆 張繼虹*

    (昆明理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,昆明 650500)

    p53蛋白是由393個(gè)氨基酸組成的轉(zhuǎn)錄因子,在缺氧、DNA損傷等壓力刺激時(shí)受到激活,并通過調(diào)節(jié)p21(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A)、BAX(B-cell lymphoma-2-associated X)、PUMA(BCL2 binding component 3)、PTEN(phosphatase and tensin homolog)、NOXA(PMA induced protein 1)等下游靶基因,引起細(xì)胞周期阻滯、使DNA損傷得以修復(fù)、導(dǎo)致細(xì)胞凋亡與衰老、抑制血管生成,從而抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展[1]。p53主要由N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域、C端寡聚結(jié)合區(qū)域、DNA核心結(jié)合區(qū)域[2]3個(gè)功能區(qū)域組成。但在腫瘤中,p53基因的突變率較高,約有50%以上的腫瘤發(fā)生了p53基因的突變,其中,晚期前列腺癌和高級別漿液性卵巢癌患者TP53基因的突變頻率分別高達(dá)75%和96%[3]。75%的TP53突變?yōu)殄e(cuò)義突變,且這一突變頻繁發(fā)生于DNA核心結(jié)合區(qū)域。p53蛋白核心區(qū)(core domain)由2個(gè)四股和五股反平行β片層形成一個(gè)三明治樣的片層骨架結(jié)構(gòu)、1個(gè)環(huán)-片-螺旋結(jié)構(gòu)域(loop-sheet-helix motif、LSH)和2個(gè)大的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(L2/L3)組成。2個(gè)大的環(huán)結(jié)構(gòu)和β片層骨架結(jié)構(gòu)形成DNA結(jié)合面,而在腫瘤中大多數(shù)p53熱點(diǎn)突變的殘基全都集中在此結(jié)合面上,從而失去與DNA的結(jié)合能力[4]。p53熱點(diǎn)突變主要包括Arg175、Ser245、Arg248、Arg273、Arg249和Arg282。p53蛋白突變可分為兩種類型:一類為DNA結(jié)合性突變(如R248Q、R273H),此類突變主要是影響p53蛋白與DNA的接觸點(diǎn),如第273位和第248位精氨酸發(fā)生突變后,鹽橋和疏水作用減弱,并且對DNA的親和力降低甚至喪失;另一類為構(gòu)象型突變,此類突變可導(dǎo)致突變位點(diǎn)原位(如R249S、G245S)或蛋白質(zhì)整體的構(gòu)象扭曲(如R175H、R282W)突變,如R175H位點(diǎn)突變后,疏水作用消失,使得環(huán)狀結(jié)構(gòu)L2和L3不再作用,導(dǎo)致p53蛋白核心結(jié)構(gòu)松散而失去功能[5]。p53蛋白主要以四聚體的形式存在,通常p53發(fā)生突變后會(huì)導(dǎo)致熱力學(xué)和動(dòng)力學(xué)穩(wěn)定性下降,蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定,活性構(gòu)象改變,失去轉(zhuǎn)錄激活能力,但其不會(huì)失活,仍保持著構(gòu)象從非折疊向折疊轉(zhuǎn)換的能力[6]。

    大量的研究已經(jīng)報(bào)道,許多小分子化合物可作為mutp53潛在的重激活劑,引入小分子或多肽與mutp53結(jié)合可以恢復(fù)其與DNA的結(jié)合功能而發(fā)揮抗腫瘤作用[7]。這種突變構(gòu)象改變的微弱性以及自身結(jié)構(gòu)的可恢復(fù)性,為設(shè)計(jì)小分子化合物恢復(fù)mutp53構(gòu)象提供了可能性。由于突變型p53(mutp53)在腫瘤細(xì)胞中通常有較高表達(dá),從而成為區(qū)別于正常細(xì)胞的一個(gè)特異性抗腫瘤藥物靶點(diǎn)[8]。迄今為止,只有PRIMA-1的衍生物APR-246進(jìn)入Ⅱ期臨床實(shí)驗(yàn)[9]。因此,急需開發(fā)新的mutp53潛在重激活劑。在大自然中,存在很多天然產(chǎn)物,而且天然產(chǎn)物在創(chuàng)新藥物發(fā)現(xiàn)中是其他新技術(shù)和新手段無法替代的。因此從天然化合物中尋找和研究靶向mutp53的化合物具有重要的意義。

    穿心蓮內(nèi)酯(andrographolide)是從穿心蓮(A.paniculata)中提取的化合物,穿心蓮是一種傳統(tǒng)中草藥,在中國古代和東亞其他地區(qū)被用來治療一系列疾病,如癌癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、腹瀉、上呼吸道感染和喉炎[10]。此外,它還具有抗氧化、抗炎、抗凋亡和神經(jīng)功能調(diào)節(jié)作用,如在阿爾茨海默病、創(chuàng)傷性腦損傷和缺血性中風(fēng)的動(dòng)物模型中具有很好的抗炎活性和治療效果[11]。通過腺苷A2a受體激活Nrf2/HO-1途徑,發(fā)揮抗氧化防御系統(tǒng)的功能[12];在抗腫瘤方面發(fā)現(xiàn)可通過抑制自噬并增強(qiáng)順鉑介導(dǎo)的肺癌A549細(xì)胞的凋亡[13];此外,通過以p53依賴的方式上調(diào)TRAIL死亡受體(DR4和DR5)抑制T24膀胱癌細(xì)胞的遷移和促進(jìn)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[14]。還能通過抑制COX-2表達(dá)及失活p300信號通路和VEGF途徑抑制乳腺癌發(fā)生與發(fā)展;誘導(dǎo)人惡性黑色素瘤C8161和A375細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯而有效抑制其細(xì)胞增殖[15]。而在mutp53的腫瘤細(xì)胞中,可以誘導(dǎo)熱休克蛋白(Hsp70)的表達(dá),增加Hsp70與mutp53蛋白的結(jié)合,從而促進(jìn)p53的蛋白酶體降解[16]。

    本研究在進(jìn)行靶向mutp53重激活劑的篩選中發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可能作為mutp53潛在的重激活劑,初步探討了穿心蓮內(nèi)酯在恢復(fù)mutp53的功能及其抗腫瘤作用。還發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯可能通過影響Hsp70的表達(dá)從而激活p53下游靶基因而發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究為靶向mutp53的藥物研發(fā)提供一定的理論依據(jù),同時(shí)也擴(kuò)大了穿心蓮內(nèi)酯在抗腫瘤研究方面的應(yīng)用價(jià)值。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    人結(jié)腸癌HT29、人乳腺癌SK-BR-3、人肺癌H1299細(xì)胞購自中科院細(xì)胞庫;H1299(p53R273H)-WTPUMApromoter BS2、H1299(p53R175H)-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞,穿心蓮內(nèi)脂、PRIMA-1購置Selleck公司;胎牛血清、1640培養(yǎng)基購置Gibco公司;DMSO(溶解藥物)購自Amresco公司;Secrete-PairTMDual Luminescence Assay Kit購自GeneCopoeia公司;CHIP、p53、Noxa抗體購自Santa公司;PAb1620、PAb240抗體購自Millipore公司;PARP抗體購自CST公司;MDM2、PUMA抗體購自Abcam公司;p21抗體購自BD公司;Hsp70抗體購自CST公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

    人肺癌H1299(p53R273H)-WTPUMApromoter BS2、H1299(p53R175H)-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞是通過DNA重組技術(shù),將PUMA啟動(dòng)子序列插入到雙報(bào)告基因載體pEZX-GA01的GLuc報(bào)告基因上游,并通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定表達(dá)PUMA啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),通過檢測化合物對細(xì)胞中報(bào)告基因的表達(dá)量影響,可以表征p53與PUMA啟動(dòng)子的結(jié)合情況,作為mutp53重激活的篩選依據(jù)。以上細(xì)胞和人結(jié)腸癌HT29、SK-BR-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.2.2 MTT實(shí)驗(yàn)

    取生長狀態(tài)良好的細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),按照一定的細(xì)胞密度接種到96孔板中(不同的細(xì)胞設(shè)置不同的接種密度),37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;穿心蓮內(nèi) 酯 設(shè) 置5個(gè) 濃 度 梯 度(0.1、1、10、50、100 μmol/L)3個(gè)復(fù)孔,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后終止培養(yǎng);每孔加入5 g/L MTT溶液25 μl,放置于培養(yǎng)箱中4 h;去除細(xì)胞懸液加入150 μl DMSO,置于搖床上振蕩10 min;多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-TeK)儀器490 nm波長下測定A值。根據(jù)測定的A值計(jì)算出IC50值和細(xì)胞的相對存活率。

    1.2.3 相對熒光素酶活實(shí)驗(yàn)

    取生長狀態(tài)良好的H1299(p53R273H)-WTPUMApromoter BS2、H1299(p53R175H)-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞,用0.25%的胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液,血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),按照一定的細(xì)胞密度接種到24孔板中(不同的細(xì)胞設(shè)置不同的接種密度),37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜;加入10或20 μmol/L穿心蓮內(nèi)脂、50 μmol/L PRIMA-1作為正對照(已經(jīng)被證實(shí)作為mutp53的重激活劑)處理24 h,吸取細(xì)胞上清后,通過Secrete-PairTMDual Luminescence Assay Kit進(jìn)行相對熒光酶活檢測。

    1.2.4 AnnexinV/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡

    取生長狀態(tài)良好的HT29、SK-BR-3細(xì)胞種于帶有蓋玻片的6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,用穿心蓮內(nèi)酯(10或20 μmol/L)處理48 h后,1×PBS洗滌細(xì)胞,加入0.25%胰酶(不含EDTA)消化,然后用培養(yǎng)基終止消化,輕輕吹散細(xì)胞,并將轉(zhuǎn)移至15 ml離心管中,4℃,1 000×g,離心5 min。去上清,用1×PBS重懸細(xì)胞沉淀,轉(zhuǎn)移至1.5 ml EP管中,4℃,1 000×g,離心5 min。然后根據(jù)凋亡試劑盒(北京四正柏生物公司,貨號:FXP021)使用說明進(jìn)行染色,避光孵育20 min,每個(gè)離心管加入緩沖液終止染色,采用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測以及數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)。

    1.2.5 免疫熒光實(shí)驗(yàn)

    取生長狀態(tài)良好的HT29、SK-BR-3細(xì)胞種于帶有蓋玻片的6孔板中,待細(xì)胞貼壁后,用穿心蓮內(nèi)酯(10或20 μmol/L)處理48 h后,1×PBS洗滌細(xì)胞,固定液(5%多聚甲醛∶1×PBS∶20%蔗糖=6∶3∶1)固定10 min,5%BSA室溫封閉2 h,加一抗PAb240抗體(識別突變型p53)、PAb1620抗體(識別野生型p53)孵育過夜,加Goat-anti-mouse 488(綠光)熒光二抗,避光室溫孵育2 h,1×PBS洗滌,染DAPI,室溫孵育15 min,然后封片,拍片,觀察穿心蓮內(nèi)酯處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞后PAb240(識別突變型p53)與PAb1620(識別野生型p53)表達(dá)情況。

    1.2.6 免疫印跡(Western blot)實(shí)驗(yàn)

    穿 心 蓮 內(nèi) 酯(10或20 μmol/L)處 理 后 的HT29、SK-BR-3細(xì)胞用細(xì)胞刮刮下并收集細(xì)胞懸液,1 500 r/min離心5 min,用1×PBS清洗1次,加入細(xì)胞裂解液,提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)。用12%SDS聚丙烯酰胺凝膠對細(xì)胞樣品進(jìn)行電泳,電泳結(jié)束后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜),用5%的脫脂奶粉封閉1 h,加入一抗4℃過夜,用1×TBST清洗3次,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗,室溫孵育2 h。用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)檢測。

    1.2.7 細(xì)胞總RNA提取實(shí)驗(yàn)

    穿 心 蓮 內(nèi) 酯(10或20 μmol/L)處 理 后 的HT29、SK-BR-3細(xì)胞,棄去舊培養(yǎng)基并用1 ml預(yù)冷的1×PBS充分清洗。然后,加入1 ml Trizol裂解液充分晃勻后靜置1 min。用1 ml微量移液器反復(fù)吹吸,使細(xì)胞離壁并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的1.5 ml EP管中,樣品經(jīng)渦旋劇烈振蕩30 s后,冰浴中靜置孵育10 min,然后加入200 μl氯仿。再次渦旋振蕩30 s后,冰浴中靜置孵育10 min,4℃,13 000 r/min離心15 min。將上層水相(RNA分布在上層)移至已預(yù)冷的新1.5 ml離心管中,加入等體積的預(yù)冷異丙醇,充分混勻后,放入-20℃冰箱中孵育30 min后,4℃下13 000 r/min離心15 min,小心棄去上清,用1 ml 75%乙醇(用DEPC水配制)輕輕重懸清洗RNA沉淀,然后4℃,以8 000 r/min離心5 min,小心棄去上清。打開樣品管的蓋子并倒扣在干凈的濾紙上直至乙醇完全揮發(fā),加入適量DEPC水溶解RNA沉淀,樣品在多功能酶標(biāo)儀(Bio-TeK)儀器測量濃度,樣品用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

    1.2.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

    反應(yīng)體系:4 μl SYBR Green,2 μl上游引物(1 μmol/L),2 μl下游引物(1 μmol/L),2~5 μl DNA模板,加ddH2O至20 μl。反應(yīng)參數(shù):Cycle 1(1×)、50℃、30 min;Cycle 2(1×)、90℃、10 min;Cycle 3(35×)、95℃、15 s,60℃、60 s,95℃、15 s;Cycle 4(1×)、65℃、60 s;95℃、15 s。根據(jù)3次實(shí)驗(yàn)所得到的各基因Ct平均值,通過2-ΔΔCt計(jì)算基因相對表達(dá)量。

    1.2.9 RNA干擾實(shí)驗(yàn)

    對數(shù)生長期的HT29、SK-BR-3細(xì)胞消化及終止消化后制成單細(xì)胞懸液,按計(jì)數(shù)結(jié)果將8×105個(gè)細(xì)胞種于培養(yǎng)皿(60 mm規(guī)格),并以1640完全培養(yǎng)基將體積補(bǔ)足至5 ml后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)至次日。待細(xì)胞匯合度為60%~80%左右時(shí),即可進(jìn)行siRNA/ShRNA轉(zhuǎn)染。首先,將TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑從4℃取出并移取適量至1.5 ml離心管使其恢復(fù)至室溫,然后取已在冰水浴解凍的500 pmol siRNA/8.0 μg ShRNA至裝有500 μl Opti-MEM培養(yǎng)基的1.5 ml EP管中,輕輕混勻。然后,加入18 μl已恢復(fù)至常溫的TransIntroTMEL轉(zhuǎn)染試劑再次混勻后在常溫孵育20 min,制備siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物。將待轉(zhuǎn)染的細(xì)胞從培養(yǎng)箱取出,棄去舊培養(yǎng)基后加入5 ml新鮮Opti-MEM培養(yǎng)基,將siRNA-轉(zhuǎn)染試劑復(fù)合物緩慢加至細(xì)胞中,輕微晃勻后放于培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。最后,將Opti-MEM更換為1640完全培養(yǎng)基,并將細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集蛋白質(zhì)進(jìn)行免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測干擾情況。siRNA NC與siRNA Hsp70片段(5'-AGAAGAAGGTGCTGGACAA-3')是由廣州銳博生物科技有限公司定制合成。

    2 結(jié) 果

    2.1 穿心蓮內(nèi)酯對mutp53具有重激活作用

    為了能夠從天然產(chǎn)物中尋找mutp53潛在的重激活因子,將mutp53(R273H和R175H)轉(zhuǎn)入到H1299(p53null)細(xì)胞中,同時(shí)將PUMA啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建至細(xì)胞中構(gòu)建了H1299-p53 R273H-WTPUMApromoter和H1299-p53R175H-WTPUMApromoter BS2穩(wěn)定細(xì)胞株,并且篩選了一系列天然化合物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯(20 μmol/L)處 理H1299(p53R273H)-WTPUMApromoter BS2、H1299(p53 R175H)-WTPUMApromoter BS2細(xì)胞48 h后,可以增加PUMA熒光素報(bào)告基因相對熒光酶活2倍,而PRIMA-1(50 μmol/L)(已經(jīng)報(bào)道是mutp53的重激活劑)增加了3倍(圖1)。提示化合物穿心蓮內(nèi)酯可能對mutp53 R273H和R175H有重激活功能。

    Fig.1 The relative luciferase activity of compounds in the H1299 p53R273H-PUMA promoter(a)and H1299 p53R175H-PUMA promoter(b)cells

    2.2 穿心蓮內(nèi)酯可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡

    采用MTT方法檢測了穿心蓮內(nèi)酯在不同突變p53背景下腫瘤細(xì)胞的增殖作用,發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯能夠抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,其中對SK-BR-3(R175H)細(xì)胞的抑制作用最強(qiáng),其IC50值4.81 μmol/L,其次為HT29(R273H)和H1299-R273H,IC50值分別為17.69 μmol/L和15.55 μmol/L(表1),提示穿心蓮內(nèi)酯對mutp53細(xì)胞具有抗腫瘤作用。為了進(jìn)一步探究穿心蓮內(nèi)酯是否能夠誘導(dǎo)突變p53細(xì)胞產(chǎn)生凋亡,采用穿心蓮內(nèi)酯(10、20 μmol/L)處理HT29、SK-BR-3細(xì) 胞12、24、48 h后,隨著時(shí)間梯度的增加,通過Western blot的方法檢測,發(fā)現(xiàn)凋亡相關(guān)蛋白PARP產(chǎn)生切割,mutp53表達(dá)降低(圖2)。此外通過C6流式細(xì)胞自動(dòng)分析儀(美國BD)分析檢測發(fā)現(xiàn),在穿心蓮內(nèi)酯(10、20 μmol/L)處理HT29細(xì)胞48 h后,此細(xì)胞的凋亡比例明顯增加(圖3)。上述結(jié)果說明穿心蓮內(nèi)酯可以抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    Table 1 The anti-tumor effect of andrographolide on cell proliferation

    Fig.2 The anti-proliferation and apoptosis effects of andrographolide in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    Fig.3 The apoptosis effects of andrographolide in HT29 cells by cell flow cytometry analysis and statistical analysis of early apoptosis fraction

    2.3 穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)mutp53的野生型構(gòu)象

    為了進(jìn)一步探究穿心蓮內(nèi)酯是否能夠?qū)utp53轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧蜆?gòu)象,采用穿心蓮內(nèi)酯(10、20 μmol/L)處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞48 h后,在分別用識別突變型p53抗體PAb240和識別野生型p53抗體PAb1620進(jìn)行免疫熒光。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),隨著化合物濃度的增加,突變型p53(PAb240)的比例降低,而野生型p53(PAb1620的比例增加(圖4)。提示穿心蓮內(nèi)酯具有將mutp53轉(zhuǎn)變?yōu)橐吧偷墓δ堋?/p>

    2.4 穿心蓮內(nèi)酯上調(diào)p53下游靶基因的表達(dá)

    為了進(jìn)一步探討穿心蓮內(nèi)酯在能夠恢復(fù)mutp53野生型功能的基礎(chǔ)上,是否也能夠恢復(fù)p53的轉(zhuǎn)錄活性,采用穿心蓮內(nèi)酯(10、20 μmol/L)處理HT29、SK-BR-3 12、24、48 h后,隨著時(shí)間的增加,細(xì)胞中p53下游基因PUMA、p21和Noxa的蛋白質(zhì)和mRNA水平上升(圖5、6)。提示穿心蓮內(nèi)酯可能是通過恢復(fù)部分野生型p53的活性,進(jìn)而轉(zhuǎn)錄激活p53下游凋亡相關(guān)蛋白PUMA、Noxa和細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21的表達(dá)而發(fā)揮抗腫瘤作用以及誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。

    2.5 穿心蓮內(nèi)酯上調(diào)p53下游靶基因依賴于mutp53

    由于p53家族成員TAp63、TAp73可以調(diào)控PUMA、BAX、NOXA、p21等共同下游靶基因[17],因此,進(jìn)一步驗(yàn)證穿心蓮內(nèi)酯處理后,PUMA、p21等p53靶基因的上調(diào)是否是依賴于mutp53。聯(lián)合p53轉(zhuǎn)錄抑制劑PFT-α抑制p53轉(zhuǎn)錄作用后,觀察到穿心蓮內(nèi)酯對HT29、SK-BR-3細(xì)胞中PUMA、p21等p53靶基因的蛋白質(zhì)水平(圖7)和mRNA水平(圖8)明顯受到抑制,提示穿心蓮內(nèi)酯可能通過依賴于重激活mutp53而上調(diào)p21、PUMA等p53下游靶基因的表達(dá)。

    Fig.4 The effect of andrographolide on the expression of mutp53 and wild-type p53 in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    Fig.5 The effect of andrographolide on the expression of p53 signaling pathway proteins in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    Fig.6 The effect of andrographolide on the mRNA expression of p53 signaling pathway in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    2.6 穿心蓮內(nèi)酯通過調(diào)控分子伴侶Hsp70的表達(dá)來影響mutp53轉(zhuǎn)錄激活

    Fig.7 The p53 related protein expressions in combination with p53 transcription inhibitor PFT-α in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    Fig.8 The mRNA expression of p53 target genes in combination with p53 transcription inhibitor PFT-α in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道[16],穿心蓮內(nèi)酯可以通過增加Hsp70的表達(dá),來促進(jìn)Hsp70與mutp53的結(jié)合,使mutp53通過蛋白酶體途徑降解。熱休克蛋白家族關(guān)鍵成員(如Hsp40、Hsp70、Hsp90)除了可與客體蛋白mutp53形成保護(hù)性復(fù)合體,使mutp53逃逸CHIP、MDM2介導(dǎo)的泛素化降解之外,還可以驅(qū)動(dòng)錯(cuò)疊蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,以及穩(wěn)定其活性[17]。因此,本文進(jìn)一步探究了是否穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活是否也與分子伴侶Hsp70表達(dá)有關(guān)。在穿心蓮內(nèi)酯處理后發(fā)現(xiàn)Hsp70的表達(dá)增加,采用RNA干擾技術(shù),在敲低Hsp70后,穿心蓮內(nèi)酯對p53下游靶蛋白的上調(diào)作用明顯受到抑制(圖9)。因此,提示穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活作用可能依賴于Hsp70的調(diào)控。

    Fig.9 The effect of andrographolide with Hsp70 knock-down on the p53 target protein expressions in HT29(a)and SK-BR-3(b)cells

    3 討 論

    突變p53不僅失去其原有野生型的抑癌功能,同時(shí)通過功能獲得性效應(yīng)(gain-of-function,GOF)并與其他一些因子相互作用,使其穩(wěn)定并積累促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[18]。由于在腫瘤細(xì)胞中p53突變頻率高,因此,靶向作用mutp53(降解mutp53或恢復(fù)為野生型p53)而發(fā)揮抗腫瘤作用具有較好的研究前景[5]。針對靶向mutp53的腫瘤治療策略之一是恢復(fù)mutp53野生型功能[19-20]。

    穿心蓮內(nèi)酯作為一種神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)的藥物[21],同時(shí)也具有抗腫瘤的作用,Yuwen等[12]發(fā)現(xiàn)在人肺癌A549細(xì)胞中,穿心蓮內(nèi)酯通過抑制自噬途徑來增強(qiáng)順鉑誘導(dǎo)的凋亡。此外它還能通過抑制COX-2表達(dá)和失活p300信號通路和VEGF途徑抑制乳腺癌發(fā)生與發(fā)展[14]。前期Sato等[16]發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可以通過增加Hsp70的表達(dá),來促進(jìn)Hsp70與mutp53的結(jié)合,使突變p53通過蛋白酶體途徑降解,同時(shí)增加細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡。而本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),在具有mutp53背景的細(xì)胞中,穿心蓮內(nèi)酯能夠明顯抑制腫瘤的增殖,發(fā)揮很好的抗腫瘤效果;同時(shí),穿心蓮內(nèi)酯可以使mutp53背景的細(xì)胞中野生型p53比例增加,并且上調(diào)p53下游靶蛋白PUMA、p21、Noxa的表達(dá),從而參與調(diào)控細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期因子PARP切割增強(qiáng),誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。從蛋白質(zhì)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測,穿心蓮內(nèi)酯處理HT29、SK-BR-3細(xì)胞后可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯的發(fā)生,與Sato等[16]報(bào)道的結(jié)果一致。Deng等[13]發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯以p53依賴的方式上調(diào)TRAIL的死亡受體(DR4和DR5)來抑制T24膀胱癌細(xì)胞的遷移,并促進(jìn)caspase介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。說明穿心蓮內(nèi)酯可以調(diào)控野生型p53的功能?;衔锶鏟RIMA-1、STIMA-1、MIRA-1等在恢復(fù)mutp53野生型功能后,對腫瘤細(xì)胞的生長具有很好的抑制效果[22-23]。此外,由于mutp53在腫瘤細(xì)胞中可以與其他腫瘤抑制因子(如TAp63和TAp73)形成復(fù)合物,使腫瘤抑癌基因失活;在恢復(fù)mutp53的野生型功能后,可以使這些腫瘤抑制因子激活,發(fā)揮抗腫瘤作用;Zhang等[24]發(fā)現(xiàn),化合物NSC59984可以打破mutp53與TAp73的作用,從而激活TAp73調(diào)控p53的下游靶基因,誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞發(fā)生調(diào)亡。本課題組也發(fā)現(xiàn)在聯(lián)合p53轉(zhuǎn)錄抑制劑PFT-α處理時(shí),穿心蓮內(nèi)酯對mutp53重激活作用明顯受到抑制,說明穿心蓮內(nèi)酯對mutp53的轉(zhuǎn)錄激活是依賴于mutp53;同時(shí),能夠明顯上調(diào)CHIP的表達(dá),CHIP作為E3泛素連接酶,在腫瘤細(xì)胞中對mutp53的穩(wěn)定性起關(guān)鍵作用,已經(jīng)有報(bào)道,一些化合物可以通過CHIP泛素化途徑降解mutp53[17,25]。HSP90作為分子伴侶與mutp53形成穩(wěn)定的復(fù)合體而抑制MDM2和CHIP介導(dǎo)的泛素化降解途徑,使突變更好地發(fā)揮其癌基因功能[26]。HSP90抑制劑geldanamycin、17-DMAG(geldanamycin derivative)、ganetespib等都可破壞mutp53-HSP90/Hsp70-復(fù)合體,使mutp53去穩(wěn)定性,誘 導(dǎo) 突 變p53發(fā) 生 降 解[27]。HDAC抑 制 劑SAHA(Vorinostat)、丁酸鈉(sodium butyrate)、Romidepsin等,通過破壞HDAC6-HSP90/Hsp70-mutp53復(fù)合體,誘導(dǎo)mutp53通過MDM2和CHIP介導(dǎo)的泛素化途徑降解[28]。本研究也發(fā)現(xiàn),穿心蓮內(nèi)酯可以增加Hsp70、CHIP蛋白的表達(dá),提示穿心蓮內(nèi)酯可能從CHIP泛素化途徑降解mutp53的表達(dá),與此前報(bào)道一致。

    此外,熱休克蛋白家族作為重要的分子伴侶,可結(jié)合錯(cuò)疊蛋白并促進(jìn)其重折疊或泛素化降解。mutp53的穩(wěn)定性及構(gòu)象轉(zhuǎn)變均受熱休克蛋白的影響,并且mutp53與熱休克蛋白家族之間存在反饋調(diào)節(jié)機(jī)制。已發(fā)現(xiàn)熱休克蛋白家族關(guān)鍵成員Hsp40、Hsp70、Hsp90可與客體蛋白mutp53形成保護(hù)性復(fù)合體,使mutp53逃逸CHIP、MDM2介導(dǎo)的泛素化降解[17,29]。此外,mutp53可將pHSF1(Ser326)募集到靶基因啟動(dòng)子區(qū)轉(zhuǎn)錄激活Hsp70、Hsp90從而進(jìn)一步穩(wěn)定mutp53[30]。熱休克蛋白家族除了可以調(diào)控mutp53的穩(wěn)定性外,對其構(gòu)象及功能也具有潛在影響。由于mutp53與Hsp70、Hsp90形成復(fù)合體后會(huì)發(fā)生構(gòu)象解旋,mutp53從復(fù)合體解離后會(huì)自行重新折疊,因此mutp53有恢復(fù)野生型構(gòu)象的可能性[17],由于熱休克蛋白家族可以促進(jìn)錯(cuò)疊蛋白發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,這提示著熱休克蛋白家族除了與mutp53的降解有關(guān)外,也與mutp53的重激活有潛在聯(lián)系。已經(jīng)研究證實(shí),毛殼菌素通過Hsp40家族成員DNAJB1恢復(fù)mutp53(R175H)的野生型構(gòu)象及功能[31],而SLMP53-2則是通過另一分子伴侶Hsp70來重激活mutp53[7,31-32]。上述研究進(jìn)一步證實(shí)分子伴侶與mutp53這種潛在聯(lián)系。在生理和熱休克溫度下,Hsp70和Hsp90分子伴侶網(wǎng)絡(luò)不僅對維持野生型p53轉(zhuǎn)錄活的發(fā)揮重要作用,而且對mutp53蛋白的錯(cuò)誤折疊構(gòu)象穩(wěn)定性起著決定作用[33]。而本文研究發(fā)現(xiàn),穿心內(nèi)酯可能直接或間接通過與Hsp70作用,從而影響mutp53重激活,發(fā)揮抗腫瘤效果。但其具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

    4 結(jié) 論

    本研究初步揭示了穿心蓮內(nèi)酯可以作用不同突變p53的腫瘤細(xì)胞HT29、SK-BR-3,抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)凋亡和降低mutp53的表達(dá),同時(shí)增加野生型p53的比例,并且增加了p53下游相關(guān)蛋白PUMA、p21、Noxa的表達(dá),且下游因子表達(dá)的增加是依賴于p53,進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)穿心蓮內(nèi)酯恢復(fù)mutp53野生型功能主要是通過Hsp70調(diào)控。為靶向mutp53抗腫瘤藥物治療提供了理論依據(jù),同時(shí)也闡述了穿心蓮內(nèi)酯的抗腫瘤機(jī)制,為其抗腫瘤藥物開發(fā)治療提供了實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

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