不同產(chǎn)地地參核苷類成分的UPLC-MS-MS定性定量分析

黃小蘭，何旭峰，周祥德，趙順鑫，楊勤，肖琦，周濃

（1.重慶市萬(wàn)州食品藥品檢驗(yàn)所，重慶 404100；2.重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 404120；3.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校中醫(yī)學(xué)院，重慶 404120）

地參為唇形科地筍屬植物硬毛地筍（Lycopus lucidus var.hirtus Regel.）的干燥根莖，其性平、味甘，有化瘀止血、益氣利水的功效，對(duì)產(chǎn)后腹痛、黃疸、水腫、帶下和氣虛乏力有較好的療效[1]。在我國(guó)云南、江蘇、山東、四川、陜西和重慶等地均有栽培[2]?，F(xiàn)代研究表明地參主要含有酚酸類、多糖類、揮發(fā)油、三萜類、黃酮類[3-5]等活性成分，具有抗氧化、抗炎、增強(qiáng)免疫、降血糖血脂、抗腫瘤等多種生物活性[6-7]，同時(shí)地參還含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)素[8-9]，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，有“蔬菜珍品”、“山中之王”的美譽(yù)[7]。

核苷是核酸的主要成分，是構(gòu)成生命活動(dòng)的基本單元，不僅參與機(jī)體DNA代謝，且存在廣泛的藥理活性[10-11]。研究表明，核苷類物質(zhì)對(duì)人體免疫系統(tǒng)、肝臟、心血管和神經(jīng)系統(tǒng)具有很好的調(diào)節(jié)能力[12]，已被作為功能強(qiáng)化劑添加到食品中[13]。關(guān)于地參水溶性提取物的研究多在地參多糖的提取、純化和生理活性上，而地參中水溶性核苷類成分的研究鮮見(jiàn)報(bào)道，因此，對(duì)其進(jìn)行測(cè)定分析有助于挖掘潛在的保健功能。

高效液相色譜法[10-11，14-15]為核苷類物質(zhì)的常用分析法，但此法在復(fù)雜基質(zhì)中存在定性能力差、分析時(shí)間長(zhǎng)的問(wèn)題，不利于穩(wěn)定性差的核苷類物質(zhì)[14]含量的準(zhǔn)確測(cè)定。而采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（liquid chromatograph mass spectrometer，LC-MS）測(cè)定核苷類成分，不僅定性定量準(zhǔn)確、靈敏度高，而且分析時(shí)間短[16-17]。因此，本試驗(yàn)建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（ultra performance liquid chromatograph tandem mass spectrometer，UPLC-MS-MS）測(cè)定地參中核苷類成分，并對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地地參進(jìn)行定性定量分析、聚類分析和相關(guān)性分析，不僅可為地參質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考，還可為今后進(jìn)一步探索地參的生物活性指明方向。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與設(shè)備

TSQ Quantum Access Max型液相質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司；SB-5200DTN型超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；ML204型萬(wàn)分之一分析天平、MS105型十萬(wàn)分之一分析天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HDL-4型離心機(jī)：江蘇省金壇市鴻科科技有限公司。

1.2 材料與試劑

尿嘧啶、腺嘌呤、腺苷、胞苷：南京都萊生物技術(shù)有限公司；鳥(niǎo)苷、尿苷：成都普思生物科技股份有限公司；甲醇（質(zhì)譜純）：美國(guó)Fisher公司；其余試劑均為分析純。

地參自采或委托采集于云南、江蘇、重慶、山東和廣西等我國(guó)地參主要栽培基地，共10批次，編號(hào)為重慶萬(wàn)州（S1）、云南大理（S2）、云南騰沖（S3）、云南昆明（S4）、廣西玉林（S5）、山東菏澤（S6）、江蘇徐州（S7）、江蘇鹽城（S8）、江蘇沛縣（S9）、江蘇宿遷（S10），經(jīng)重慶三峽學(xué)院生物與食品工程學(xué)院周濃教授鑒定為唇形科地筍屬植物硬毛地筍（Lycopus lucidus var.hirtus Regel.）的根莖。將地參洗凈泥沙，晾干水分，置于恒溫干燥箱45℃烘干至恒重，粉碎過(guò)35目篩，備用。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn)

精密稱取地參粉末（S1）0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，按照1∶20（g/mL）的料液比分別加入純水、2%氯化鈉溶液、10%甲醇溶液、20%甲醇溶液和0.1 mol/L氫氧化鈉溶液，超聲輔助提取30 min，合并2次提取液，以提取到的核苷種類多少為評(píng)價(jià)指標(biāo)，確定提取溶劑。

以上述確定的溶劑提取，采用本文建立的方法測(cè)定核苷總量?；A(chǔ)提取試驗(yàn)條件：地參粉末與提取溶劑料液比 1∶20（g/mL）、超聲時(shí)間 30 min，提取2 次。考察單因素變量為超聲時(shí)間（10、20、30、40、50、60 min）、料液比[1 ∶5、1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25（g/mL）]、提取次數(shù)（1、2、3次）。

1.3.2 色譜柱的選擇

以甲酸水溶液（pH4.0）-甲醇作為流動(dòng)相，在柱溫40℃、流速0.2 mL/min條件下分別考察3種色譜柱Waters BEH C18、親水作用色譜柱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）和 Agilent SB-C18的分離效果。

1.3.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的配制

精密稱取減壓干燥至恒重的胞苷0.005 54 g、尿嘧啶 0.005 56 g、腺嘌呤 0.004 37 g、尿苷 0.004 89 g、鳥(niǎo)苷0.004 46 g、腺苷0.005 69 g，分別置于6個(gè)10 mL棕色容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，即得質(zhì)量濃度分別為 554.0、556.0、437.0、489.0、446.0、569.0 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

1.3.4 樣品溶液的制備

精密稱取地參粉末0.5 g置于100 mL具塞錐形瓶中，加純水10 mL，混勻，室溫（25℃）下超聲輔助提取30 min，4 000 r/min離心10 min，取上清液于20 mL棕色容量瓶中，按上述條件復(fù)提1次，合并上清液并定容至刻度，搖勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，即得樣品溶液。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相：A相為甲酸水溶液（pH4.0），B相為甲醇，梯度洗脫（0～1.5 min，97%A；1.5 min～6.0 min，97%～60%A；6.0 min～11.0 min，60%A；11.0 min～11.1 min，60%～97%A；11.1 min～15.0 min，97%A）；柱溫 40 ℃；流速0.2 mL/min；進(jìn)樣量 2 μL。

1.3.6 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源（electrospray ion source，ESI）；電離模式：正離子模式；電離電壓：3 500 V；毛細(xì)管溫度：270℃；鞘氣流量：35 Arb；輔助氣溫度：280℃；輔助氣流量：10 Arb；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple reaction monitoring，MRM）。6種核苷類成分具體的質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 6種核苷類成分的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrometry parameters of 6 nucleosides

續(xù)表1 6種核苷類成分的質(zhì)譜參數(shù)Continue table 1 Mass spectrometry parameters of 6 nucleosides

1.3.7 方法學(xué)考察

1.3.7.1 線性范圍和檢出限

分別取1.3.3所得的胞苷、尿嘧啶、腺苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.20 mL，腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷對(duì)照品儲(chǔ)備液各0.60 mL于同一10 mL棕色容量瓶中，加純水定容至刻度，搖勻得混合對(duì)照品溶液。分別吸取混合對(duì)照品溶液0.05、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于 7 個(gè) 10mL棕色容量瓶中，加純水定容至刻度，搖勻，得系列混合對(duì)照品溶液。以1.3.5和1.3.6方法中的條件進(jìn)樣分析，記錄色譜峰峰面積，以各成分的峰面積（Y）與其相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X）繪制回歸方程，并以3倍信噪比對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限。

1.3.7.2 精密度試驗(yàn)

取1.3.7.1中的同一混合對(duì)照品溶液，按1.3.5和1.3.6中的條件測(cè)定6次，計(jì)算6種核苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）值，驗(yàn)證儀器精密度。

1.3.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)

平行稱取6份樣品（S1），每份0.500 0 g，以1.3.4中的方法制備樣品溶液，并按1.3.5和1.3.6中的條件測(cè)定，將6種核苷成分峰面積分別代入回歸方程計(jì)算含量，求得6份樣品不同核苷含量的RSD值，驗(yàn)證方法的重復(fù)性。

1.3.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取樣品（S1），按照1.3.4的條件制備樣品溶液，室溫（25℃）下分別在 0、2、4、6、8、10 h內(nèi)進(jìn)樣測(cè)定，記錄各核苷的色譜峰面積并計(jì)算RSD值，驗(yàn)證樣品的穩(wěn)定性。

1.3.7.5 加標(biāo)回收率試驗(yàn)

精密稱取已測(cè)得含量的地參粉末0.250 0 g（S1），平行6份，分別依次精密加入1.3.3所得的各核苷對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，按1.3.4的方法制備樣品溶液，按1.3.5和1.3.6中的方法進(jìn)樣，計(jì)算各成分的加標(biāo)回收率和RSD值，驗(yàn)證方法的準(zhǔn)確性。

1.3.8 樣品的含量測(cè)定

取10批地參粉末按照1.3.4的方法進(jìn)行樣品溶液的制備，每批平行3份，注入U(xiǎn)PLC-MS-MS測(cè)定6種核苷類成分的含量。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2019軟件對(duì)測(cè)定數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計(jì)算核苷含量以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。采用SPSS 20軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異性分析、相關(guān)性分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溶劑的確定

通過(guò)測(cè)得核苷成分的種類發(fā)現(xiàn)：0.1 mol/L氫氧化鈉溶液除提取到少量的腺嘌呤外，其他核苷成分不明顯，且基線噪聲較大；10%甲醇溶液和20%甲醇溶液僅能提取到胞苷、鳥(niǎo)苷、尿苷和腺苷4種核苷；純水和2%氯化鈉溶液均能有效提取6種核苷成分，但考慮到無(wú)機(jī)鹽可能對(duì)液質(zhì)聯(lián)用儀造成污染，最終選擇純水作為提取溶劑。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)地參核苷總量的影響

不同超聲時(shí)間對(duì)核苷總量的影響見(jiàn)圖1。

圖1 超聲時(shí)間對(duì)地參核苷總量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on the total content of nucleosides

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，地參中核苷總量呈先大幅度增加后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min后，核苷總量變化不明顯。因此，本試驗(yàn)選擇超聲時(shí)間為30 min。

2.1.3 料液比對(duì)地參核苷總量的影響

不同料液比對(duì)核苷總量的影響見(jiàn)圖2。

圖2 料液比對(duì)地參核苷總量的影響Fig.2 Effect of material-to-liquid ratio on the total content of nucleosides

由圖2可知，溶劑體積過(guò)小，物質(zhì)和溶劑不能充分接觸，核苷總量較低。隨著溶液體積的增大，核苷總量明顯上升，但當(dāng)料液比達(dá)到1∶20（g/mL）后，上升趨勢(shì)不明顯。因此，本試驗(yàn)選擇料液比為1∶20（g/mL）。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)地參核苷總量的影響

不同的提取次數(shù)對(duì)核苷總量的影響見(jiàn)圖3。

圖3 提取次數(shù)對(duì)地參核苷總量的影響Fig.3 Effect of extraction times on the total content of nucleosides

由圖3可知，核苷總量隨著提取次數(shù)的增加而上升，但提取3次的含量相較2次增幅不大，考慮到時(shí)間成本，因此最終確定提取2次。

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，最終確定以純水作為提取溶劑，地參粉末與純水的料液比1∶20（g/mL），超聲提取30 min，重復(fù)提取2次的效果最好。

2.2 色譜柱的選擇

由于核苷類化合物含有堿基，極性較強(qiáng)，對(duì)色譜柱的適應(yīng)性有一定要求。本試驗(yàn)比較了3種不同的色譜柱 Waters BEH C18、HILIC 和 Agilent SB-C18，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 混合對(duì)照品溶液在不同色譜柱上的MRM離子流圖Fig.4 MRM ion chromatograms of mixed reference solution on different columns

由圖4可知，目標(biāo)物在高惰性色譜柱Waters BEH C18上的保留效果較差，出峰快導(dǎo)致保留時(shí)間過(guò)于集中且重現(xiàn)性差；HILIC親水型色譜柱上雖然目標(biāo)物保留效果較好，但部分核苷類化合物的峰形較差；而未封端的Agilent SB-C18色譜柱不僅可以在反相條件下消除因高水相引起的色譜柱疏水塌陷帶來(lái)的保留時(shí)間漂移等問(wèn)題，且峰形較好，同時(shí)也保證了低pH值流動(dòng)相條件下色譜柱的穩(wěn)定性和使用壽命。故本試驗(yàn)最終選擇色譜柱Agilent SB-C18。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性范圍、檢出限的確定

地參中6種核苷成分的回歸方程、線性范圍及檢出限見(jiàn)表2。

表2 6種核苷成分的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)Table 2 Regression equations，linear ranges，and correlation coefficients of 6 nucleosides

由表2可知，6種核苷成分在各自的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)相關(guān)系數(shù)為0.995 2～0.999 9，檢出限為0.07 ng/mL～8.34 ng/mL，表明該方法線性關(guān)系良好且靈敏度高。

2.3.2 精密度的確定

胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷峰面積的RSD值分別是 2.41%、1.85%、2.05%、3.00%、2.74%和2.42%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 重復(fù)性的確定

地參樣品（S1）中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷含量的RSD值分別為2.71%、1.58%、2.41%、2.73%、1.24%和2.18%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.4 穩(wěn)定性的確定

地參樣品（S1）中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷峰面積的RSD值分別為1.78%、1.35%、2.05%、0.97%、1.54%和2.84%，表明樣品溶液在室溫（25℃）下10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 加標(biāo)回收率的確定

地參中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的平均回收率分別為103.71%、96.30%、101.54%、98.67%、97.52%和 102.38%，RSD值分別為 1.96%、2.32%、1.10%、0.68%、1.52%和2.09%，表明本方法加標(biāo)回收良好，準(zhǔn)確度高。

2.4 樣品含量分析

10個(gè)產(chǎn)地地參中核苷成分含量結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同產(chǎn)地地參中6種核苷成分含量（n=3）Table 3 Content of 6 nucleosides in dried rhizome of Lycopus lucidus var.hirtus Regel.from different habitats（n=3）μg/g

由表3可知，不同產(chǎn)地地參中均不同程度檢出了胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷，與川黨參[15]、銀線蓮[17]中核苷類成分種類相似，但含量存在顯著差異（p＜0.05），核苷總量為 154.86 μg/g～630.79 μg/g，從高到低排序?yàn)榻K徐州（S7）＞江蘇宿遷（S10）＞重慶萬(wàn)州（S1）＞江蘇鹽城（S8）＞山東菏澤（S6）＞云南昆明（S4）＞江蘇沛縣（S9）＞云南騰沖（S3）＞云南大理（S2）＞廣西玉林（S5），含量最高的江蘇徐州（S7）約為廣西玉林（S5）的4倍。從南北產(chǎn)區(qū)上看，南方產(chǎn)區(qū)（S2～S5）含量較低且接近，而北方產(chǎn)區(qū)（S6、S8～S10）與西南方產(chǎn)區(qū)（S1）含量略高且接近，表明地參中核苷類物質(zhì)的積累存在一定的地域性。

地參中6種核苷成分之間含量差異也較大，胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的含量分別為10.77 μg/g～89.80 μg/g、3.17 μg/g～79.71 μg/g、2.68 μg/g～87.53 μg/g、47.69 μg/g～228.85 μg/g、38.50 μg/g～187.68 μg/g和 1.33 μg/g～14.38 μg/g，平均含量由高到低排序?yàn)槟蜍眨绝B(niǎo)苷＞胞苷＞腺嘌呤＞尿嘧啶＞腺苷，含量最高的尿苷和鳥(niǎo)苷分別為96.70 μg/g和94.00 μg/g，占核苷總量的35.60%和34.60%，為地參主要的核苷類成分。這一研究結(jié)果與浙貝母[18]、澤瀉[19]中主要核苷類成分一致。據(jù)報(bào)道，鳥(niǎo)苷對(duì)細(xì)胞損傷有抗凋亡作用，對(duì)腦缺血具有神經(jīng)保護(hù)作用[20]；尿苷作為一種具有嘧啶環(huán)結(jié)構(gòu)的天然核苷，在抗癲癇方面有明顯作用[21]；其次含量較高的胞苷是合成抗病毒、抗腫瘤藥物的良好中間體，也是核苷酸類功能性食品的重要原料[22]。因此，地參中核苷類成分的含量分析為其在生物活性關(guān)聯(lián)性研究上奠定了基礎(chǔ)。

2.5 相關(guān)性分析

不同產(chǎn)地地參中6種核苷類成分的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 地參中核苷成分的相關(guān)性分析Table 4 Correlation of nucleosides in dried rhizome of Lycopus lucidus var.hirtus Regel.

由表4可知，不同產(chǎn)地地參中6種核苷類成分存在一定的相關(guān)性，整體表現(xiàn)為正相關(guān)。如尿苷與胞苷（r=0.888，p＜0.01）、尿苷和腺嘌呤（r=0.818，p＜0.01）、腺苷和胞苷（r=0.970，p＜0.01）、腺苷和尿苷（r=0.835，p＜0.01）之間均為極顯著正相關(guān)，腺嘌呤和尿嘧啶（r=0.679，p＜0.05）、鳥(niǎo)苷和胞苷（r=0.707，p＜0.05）、腺苷和鳥(niǎo)苷（r=0.727，p＜0.05）之間表現(xiàn)為顯著正相關(guān)。由此說(shuō)明，地參中6種核苷類成分在合成或轉(zhuǎn)化過(guò)程中相互促進(jìn)，彼此協(xié)同。

2.6 聚類分析

利用SPSS 20軟件對(duì)10個(gè)不同產(chǎn)地地參中核苷類成分進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 樣品的聚類分析Fig.5 Cluster analysis of samples

由圖5可知，在歐式距離為10時(shí)，10個(gè)不同產(chǎn)地可以聚為3類，產(chǎn)地江蘇徐州（S7）為第I類；江蘇宿遷（S10）為第II類；剩余8個(gè)產(chǎn)地為第III類。表明不同產(chǎn)地核苷類成分含量差異性較大，其中江蘇徐州產(chǎn)地參核苷類成分含量最高，其次是江蘇宿遷產(chǎn)地，而其他產(chǎn)地成分差異不明顯。

3 結(jié)論

準(zhǔn)確定性定量分析是開(kāi)展地參品質(zhì)評(píng)價(jià)的技術(shù)基礎(chǔ)，本研究采用純水超聲輔助提取地參中核苷成分，利用Agilent SB-C18色譜柱梯度洗脫，正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式檢測(cè)，建立了同時(shí)測(cè)定地參中胞苷、尿嘧啶、腺嘌呤、尿苷、鳥(niǎo)苷和腺苷的UPLC-MSMS法。該方法相關(guān)系數(shù)均大于0.995 2，線性關(guān)系良好；檢出限為 0.07 ng/mL～8.34 ng/mL，靈敏度高；加標(biāo)回收率為96.30%～103.71%，準(zhǔn)確度高，可用于地參中核苷類成分的定性定量分析，為地參質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)的完善以及生物活性探索提供參考；同時(shí)比較了不同產(chǎn)地地參中核苷類成分差異性，為優(yōu)勢(shì)地參種源提供參考。