柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過程中酚酸抗氧化活性變化

鄧瑩瑩，焦迎春，蔣濤

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016）

柴達(dá)木大肥菇[Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc.]不僅富含脂肪、氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、膳食纖維等營養(yǎng)成分[1]，而且含有酚酸、三萜及多糖等活性物質(zhì)[2]，具有極高的開發(fā)價值。酚酸類化合物是指苯環(huán)上的氫原子被酚性羥基取代的一類化合物[3]，存在多種形式，主要以化學(xué)鍵與其他物質(zhì)相結(jié)合，極少為游離態(tài)。酚酸作為一種重要的天然酚類化合物，不僅是人類從自然界直接攝入的重要酚類物質(zhì)，還是多酚重要的體內(nèi)代謝物，具有抗炎、抗病毒、抗癌、抗氧化[4]等生物活性，可抑制肥胖、提高免疫力、改善情緒等。目前對于柴達(dá)木大肥菇研究多集中于柴達(dá)木大肥菇的生物學(xué)特性和馴化[5]菌絲體、子實(shí)體的成分分析[1]及多糖酚酸提取工藝優(yōu)化[4，6]，對其酚酸類活性成分缺乏較深入的研究[2]。

生物機(jī)體內(nèi)的氧自由基經(jīng)過不飽和脂肪酸的過氧化可引起細(xì)胞受到損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞新陳代謝和生理反應(yīng)無法正常進(jìn)行，使機(jī)體加速衰老。若機(jī)體內(nèi)氧化和抗氧化反應(yīng)失衡則容易引起氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這是一種負(fù)面效應(yīng)，嚴(yán)重時會加快機(jī)體衰老和各種疾病的產(chǎn)生，人體內(nèi)的自由基多數(shù)為活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），包括含氧自由基、超氧陰離子自由基和過氧化物?；钚匝醯纳砂殡S生物的正常代謝過程，但過量的活性氧會對細(xì)胞造成氧化損傷，危害人體健康[7]，因此，開發(fā)出具有低副作用天然無毒的抗氧化劑十分重要?？寡趸钚允欠铀嶙畛Ｒ娚锘钚灾?，酚酸以清除ROS為基礎(chǔ)實(shí)現(xiàn)抗氧化活性[8]，決定抗氧化活性的主要因素是酚羥基數(shù)目及其在化學(xué)結(jié)構(gòu)中的位置。柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過程中，可以分泌出大量酚酸，存在于發(fā)酵液和菌絲體中，分別對其提取即得胞外酚酸和胞內(nèi)酚酸。陳雅楠等[4]研究發(fā)現(xiàn)柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸具有較強(qiáng)的抗氧化活性。Leonard等[9]發(fā)現(xiàn)發(fā)酵通常會增加酚酸含量及其抗氧化活性；孟歌等[10]發(fā)現(xiàn)藥食用真菌靈芝的自身生長情況、次級代謝產(chǎn)物分泌及還原能力等因素直接影響其抗氧化能力，表明大型食用真菌在液態(tài)發(fā)酵過程會提高其分泌出酚酸的含量，影響其抗氧化能力。因此，柴達(dá)木大肥菇做為食用真菌發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酚酸也應(yīng)具有類似的抗氧化活性。

綜上所述，以柴達(dá)木大肥菇為研究對象，采用液體發(fā)酵的方法，測定發(fā)酵過程中的生物量、酚酸含量和酚酸的5種抗氧化指標(biāo)，探究柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過程中的抗氧化活性變化以及胞內(nèi)、胞外酚酸抗氧化活性的差異，為柴達(dá)木大肥菇酚酸中抗氧化功能因子的開發(fā)利用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柴達(dá)木大肥菇菌種：青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院食品工程實(shí)驗(yàn)室提供；三氯化鐵、鐵氰化鉀、麥芽糖、果糖、蛋白胨、硫酸鎂、氯化鈣、無水乙醇、戊二醛（均為分析純）：湖北永闊科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

鼓風(fēng)干燥箱（ZXRD-B5110）：上海智城分析儀器制造有限公司；數(shù)控超聲波清洗儀（KQ5200DE）：昆山市超聲儀器有限公司；紫外可見分光光度計（UV-1780）：日本島津儀器有限公司；臺式高速離心機(jī)（H/T16MM）：湖南赫西儀器裝備有限公司；恒溫振蕩培養(yǎng)箱（BS-1EA）：常州國華電器有限公司；掃描電鏡（EVO 18）：北京歐波同光學(xué)技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 液體種子培養(yǎng)

無菌條件下，從斜面培養(yǎng)基中取出黃豆大小的菌塊，接入250 mL的三角瓶中，于25℃、100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到出現(xiàn)細(xì)小均勻的菌絲球且菌液澄清透明為最佳[11]。

1.3.2 液體發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下，以體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接入250 mL錐形瓶中，置于25℃、100 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[11]。

1.3.3 柴達(dá)木大肥菇除糖工藝

菌絲體除糖：菌絲體與蒸餾水以1∶20（g/mL）放入燒杯，70℃、45 Hz超聲20 min后提取抽濾。

發(fā)酵液除糖：發(fā)酵液和無水乙醇以體積比1∶4放入燒杯，40℃、45 Hz超聲30 min后提取多糖，將上清液濃縮至原體積，即為胞外酚酸[4]。

1.3.4 柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸的提取

將除糖后的菌絲體與90%乙醇以1∶20（g/mL）料液比放入燒杯，60℃、45 Hz超聲30 min后提取抽濾，濾液即為胞內(nèi)酚酸。

1.3.5 菌絲體生物量的測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[12]測定菌絲體干重（g）。菌絲體生物量計算公式如下。

式中：M為菌絲體干重，g；V為發(fā)酵液總體積，mL。

1.3.6 菌絲體掃描電鏡觀察

將培養(yǎng)1 d～6 d的柴達(dá)木大肥菇菌絲體于2.5%戊二醛溶液中避光固定12 h。用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液沖洗2次，然后分別用30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液脫水2次[13]。

1.3.7 酚酸含量測定

制備沒食子酸對照品溶液，分別取 0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL沒食子酸對照品溶液置于25.0 mL的容量瓶中，加入1.0 mL的無水乙醇、0.3% C12H25SO4Na溶液、0.6% FeCl3溶液和 0.9 mL 0.9% K3[Fe（CN）6]溶液，并用0.1 mol/L鹽酸溶液定容，靜置20 min，測定720 nm處的吸光度[4]，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=1.267 8x-0.021 5，R2=0.996 4；確定酚酸的稀釋倍數(shù)，根據(jù)上述方法測得相應(yīng)的吸光度后計算相應(yīng)的胞內(nèi)、胞外酚酸濃度。

1.3.8 抗氧化指標(biāo)測定

1.3.8.1 超氧陰離子自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]的方法測定超氧陰離子自由基清除能力。清除率計算公式如下。

式中：△A空白為用無水乙醇代替樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A對照為以超純水代替鄰苯三酚的反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.8.2 鐵離子還原能力的測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[15]的方法測定鐵離子還原能力。

1.3.8.3 羥自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的方法測定羥自由基清除能力。清除率計算公式如下。

式中：△A空白為無水乙醇代替樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A對照為以蒸餾水替代H2O2的反應(yīng)體系的吸光度。

1.3.8.4 2，2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽陽離子 [2，2'-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）cation，ABTS+]自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[10]的方法測定ABTS+自由基清除能力。清除率計算公式如下。

式中：△A樣品為添加樣品后溶液的吸光度；△A空白為未添加樣品后溶液的吸光度。

1.3.8.5 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力測定

根據(jù)參考文獻(xiàn)[16]的方法測定DPPH自由基清除能力。清除率計算公式如下。

式中：△A空白為無水乙醇替代樣品的反應(yīng)體系的吸光度；△A樣品為添加樣品后溶液的吸光度；△A對照為無水乙醇替代DPPH的反應(yīng)體系的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)用IBM SPSS Statistics 20分析顯著性，用Origin 2018做圖，顯著水平設(shè)定為P=0.05，差異極顯著水平設(shè)為P=0.01，相同小寫字母表示差異不顯著（P＞0.05），不同小寫字母表示差異顯著（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過程中菌絲體生物量變化

發(fā)酵過程中菌絲體生物量的變化見圖1。發(fā)酵過程中菌絲細(xì)胞的形態(tài)變化見圖2。

圖1 發(fā)酵過程中菌絲體生物量的變化Fig.1 Variation curve of hyphae biomass

圖2 發(fā)酵過程中菌絲細(xì)胞的形態(tài)變化（掃描電鏡8 000×）Fig.2 Morphological changes of mycelium cells during fermentation（SEM 8 000×）

由圖1可知，在培養(yǎng)的6 d內(nèi)，菌絲體生物量呈先上升后下降的趨勢，并在第5天達(dá)到峰值（22.91±0.21）g/L，較第1天提升了25.08倍。由圖2可知，在發(fā)酵過程中，柴達(dá)木大肥菇菌絲球直徑隨著時間的延長呈先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢。與雞腿菇菌絲體生物量的試驗(yàn)結(jié)果趨勢[17]類似，但由于真菌種類的差異，生物量達(dá)到峰值的時間不一致，隨著發(fā)酵進(jìn)程延續(xù)發(fā)酵液體系中溶解氧含量持續(xù)降低，菌體爭奪養(yǎng)分、生長空間受限，菌體產(chǎn)量開始下降。

由圖2可知，柴達(dá)木大肥菇在液體發(fā)酵過程中主要以圓球形態(tài)存在。在發(fā)酵初期，菌球較小，邊緣為絨毛狀，發(fā)酵液澄清透明，呈淡黃色，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，菌球逐漸變大，菌絲逐漸變粗，并出現(xiàn)分支，發(fā)酵液逐漸渾濁、黏稠，6 d時，菌絲體老化，菌絲變細(xì)?？赡苁怯捎诎l(fā)酵后期時發(fā)酵液中營養(yǎng)物質(zhì)減少，菌絲開始自溶。

2.2 柴達(dá)木大肥菇酚酸含量變化

胞內(nèi)、胞外酚酸含量變化見圖3。

圖3 胞內(nèi)、胞外酚酸含量變化Fig.3 Changes of intracellular and extracellular phenolic acid content

由圖3可知，胞外酚酸含量始終高于胞內(nèi)酚酸。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸含量隨著時間的延長呈先上升后平緩的趨勢，并于第7天達(dá)到峰值，分別（6.73±0.05）、（10.11±0.05）g/L，較發(fā)酵第1天分別提高了 17.91倍、4.56倍，差異顯著（P＜0.05）。發(fā)酵前期菌絲體需一定的時間適應(yīng)新的液體環(huán)境，故產(chǎn)生的酚酸較少。進(jìn)入對數(shù)生長期后，菌絲體顯著增長，酚酸含量開始增多，一直持續(xù)到穩(wěn)定期，由于營養(yǎng)物質(zhì)有限，從而導(dǎo)致酚酸含量增加速度變緩，最終趨于平穩(wěn)。綜上所述，選擇發(fā)酵時間6 d作為一個發(fā)酵周期，完成對柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵。

2.3 柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過程中胞內(nèi)、外酚酸抗氧化活性變化

2.3.1 發(fā)酵過程中超氧陰離子自由基清除率變化

超氧陰離子自由基清除率變化見圖4。

圖4 發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外超氧陰離子自由基清除能力變化Fig.4 Changes of intracellular and extracellular superoxide anion scavenging ability during fermentation

超氧陰離子自由基（·O2-）是基態(tài)氧接受一個電子后形成的第一個氧自由基，可以轉(zhuǎn)化為其他自由基如單線態(tài)氧、H2O2和羥自由基，其氧化能力很強(qiáng)，對組織產(chǎn)生氧化損傷而引發(fā)各種疾病[18]。因此，常用樣品對超氧陰離子自由基清除能力來反映其抗氧化活性。由圖4可知，1 d～3 d時胞內(nèi)酚酸超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)于胞外酚酸，4 d～6 d時胞外酚酸超氧陰離子自由基清除能力強(qiáng)于胞內(nèi)酚酸。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸超氧陰離子自由基清除率隨著時間的延長呈先升高后下降最后趨于平穩(wěn)的趨勢，并于第3天達(dá)到最大值，分別為 63.90%、23.95%，差異極顯著（P＜0.01），較發(fā)酵第1天分別提高了1.82倍、13.09倍。與桑黃液體培養(yǎng)中超氧陰離子自由基清除能力趨勢類似[19]。

2.3.2 發(fā)酵過程中鐵離子還原能力變化

發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化見圖5。

圖5 發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化Fig.5 Changes of intracellular and extracellular phenolic acid iron ion reduction ability during fermentation

鐵離子還原能力的測定，實(shí)質(zhì)上是檢驗(yàn)樣品電子供應(yīng)能力的過程。鐵離子還原能力可以參與多種抗氧化反應(yīng)，可以破壞自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和過氧化物的降解，鐵離子還原能力可用來評價樣品總的抗氧化活性，且鐵離子還原能力越強(qiáng)，酚酸抗氧化能力就越強(qiáng)[20]。由圖5可知，胞內(nèi)酚酸鐵離子還原能力始終強(qiáng)于胞外酚酸，并在第4天達(dá)到最大差值，為3.93%，在第4天達(dá)到峰值，差異極顯著（P＜0.01）。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸鐵離子還原能力變化穩(wěn)定，分別為7.08%、3.49%。與樺褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)的1 d～6 d胞內(nèi)外多酚鐵離子還原能力變化趨勢一致[21]。

2.3.3 發(fā)酵過程中羥自由基清除率變化

發(fā)酵過程中胞內(nèi)、外酚酸羥自由基清除能力變化見圖6。

圖6 發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸羥自由基清除能力變化Fig.6 Changes of intracellular and extracellular scavenging ability of phenolic acid hydroxyl radical during fermentation

羥自由基是一種活性氧，可以破壞細(xì)胞膜與蛋白質(zhì)等生物分子發(fā)生反應(yīng)，造成組織破壞和細(xì)胞死亡，這也是引起衰老和其他疾病的重要因素[22]。因此，可用羥自由基的清除能力評價樣品的抗氧化能力。由圖6可知，胞內(nèi)酚酸羥自由基清除能力始終強(qiáng)于胞外酚酸。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸羥自由基清除率隨著時間的延長呈上升趨勢，并于第6天達(dá)到峰值，分別為 29.35%、28.61%，差異顯著（P＜0.05），較發(fā)酵第 1天分別提高了2.52倍、4.61倍。與靈芝液體培養(yǎng)2 d～6 d的羥自由基清除能力變化趨勢類似[10]。

2.3.4 發(fā)酵過程中ABTS+自由基清除率變化

發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力變化見圖7。

圖7 發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力變化Fig.7 Changes of intracellular and extracellular ABTS+scavenging ability during fermentation

ABTS是一種水溶性的自由基引發(fā)劑，在清除ABTS+自由基反應(yīng)中，抗氧化劑通過抑制藍(lán)綠色的ABTS+自由基的產(chǎn)生來評價抗氧化性。當(dāng)遇到具有抗氧化活性的物質(zhì)時，ABTS+自由基會被還原，溶液顏色變淺，吸光值降低；吸光值越小，說明自由基清除劑的清除能力越強(qiáng)，以此可評價物質(zhì)的抗氧化活性[23]。由圖7可知，胞內(nèi)、胞外酚酸ABTS+自由基清除能力基本相同。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸的ABTS+自由基清除率隨著時間的延長呈上升趨勢，并于第6天達(dá)到峰值，分別為 44.52%、47.32%，差異顯著（P＜0.05），較發(fā)酵第1天分別提高了1.03倍、1.14倍。與桑黃液體發(fā)酵培養(yǎng)2d～6d過程中ABTS+自由基清除能力趨勢一致[19]。

2.3.5 發(fā)酵過程中DPPH自由基清除率變化

發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力變化見圖8。

圖8 發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力變化Fig.8 Changes of DPPH scavenging capacity of intracellular and extracellular phenolic acids during fermentation

DPPH是一種穩(wěn)定的順磁化合物，若自由基清除劑存在時，則DPPH接受一個電子或氫原子，單電子被配對而形成穩(wěn)定的DPPH-H化合物，使其乙醇溶液從深紫色變?yōu)辄S色，變色程度與配對電子數(shù)（自由基清除活性）成正比[24]。因此通過DPPH的清除率可反映出酚酸的抗氧化活性。由圖8可知，在發(fā)酵前期，胞外酚酸DPPH自由基清除能力大于胞內(nèi)酚酸，在發(fā)酵后期，情況相反。在發(fā)酵過程中，胞內(nèi)、胞外酚酸DPPH自由基清除能力隨著時間的延長呈上升趨勢，并于第6天達(dá)到峰值，分別為50.54%、34.39%，差異極顯著（P＜0.01），較發(fā)酵第1天分別提高了10.52倍、3.17倍。與櫟生桑黃液體發(fā)酵過程中DPPH自由基清除能力變化趨勢一致[25]。

3 結(jié)論

本文以發(fā)酵過程中的柴達(dá)木大肥菇為研究對象，利用超聲波輔助法提取胞內(nèi)、胞外酚酸，采用ABTS+自由基、DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子自由基清除能力及鐵離子還原能力5個抗氧化體系，綜合分析柴達(dá)木大肥菇在發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸抗氧化活性變化。結(jié)果顯示：在發(fā)酵過程中菌絲體生物量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在第5天時菌絲體生物量達(dá)到最大，較第1天提升25.08倍；酚酸含量變化呈現(xiàn)先上升后趨于平穩(wěn)的趨勢，胞外酚酸含量高于胞內(nèi)酚酸含量，在發(fā)酵后胞外酚酸含量提升了4.56倍，胞內(nèi)酚酸含量提升了17.91倍；柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸具有良好的抗氧化活性，且胞內(nèi)酚酸的抗氧化能力高于胞外酚酸的抗氧化能力。所得柴達(dá)木大肥菇胞內(nèi)酚酸對ABTS+自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基的最高清除率及最高鐵離子還原能力分別為44.52%、50.54%、63.90%、29.35%、7.17%，分別是最低值的2.03倍、11.52倍、20.61倍、3.52倍、1.05倍，胞外酚酸對4種自由基的最高清除率及鐵離子還原能力分別為47.32%、34.39%、23.95%、28.61%、3.67%，分別是最低值的2.14倍、4.17倍、14.09倍、5.61倍、1.13倍。柴達(dá)木大肥菇發(fā)酵過程中胞內(nèi)、胞外酚酸體現(xiàn)了良好的抗氧化能力，可以作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開發(fā)利用。