人類輔助生殖技術用液體類醫(yī)療器械細菌回復突變試驗的優(yōu)化研究

孫國偉 王麗潔 朱飛冀 胡彩珍 孫金陸 蘇靜娜 方菁嶷

1 蘇州蘇大衛(wèi)生與環(huán)境技術研究所有限公司 （江蘇 蘇州 215000）

2 蘇州大學蘇州醫(yī)學院 （江蘇 蘇州 215000）

內容提要：目的：對人類輔助生殖技術用液體類醫(yī)療器械的細菌回復突變試驗進行優(yōu)化研究。方法：以該類醫(yī)療器械的典型代表—囊胚培養(yǎng)液為研究對象，根據(jù)其特點對其細菌回復突變試驗的劑量水平選擇、結果判定方式等進行優(yōu)化，分析經(jīng)優(yōu)化后的細菌回復突變試驗結果。結果：在經(jīng)優(yōu)化的試驗條件下，細菌回復突變試驗系統(tǒng)有效，試驗結果為陰性且具有可重復性。結論：通過對細菌回復突變試驗劑量水平選擇、結果判定方式的優(yōu)化，可獲得更準確、可靠的測試結果。

細菌回復突變試驗是由Bruce N.Ames于1975年建立并不斷發(fā)展完善的一種用于測試致突變性的短期生物學試驗。細菌回復突變試驗的主要原理為：利用是否能引起組氨酸營養(yǎng)缺陷型（His-）菌株（S.typhimurium或E.coli）的回復突變來判斷受試物是否具有潛在的致突變性[4,5]。由于該方法具有快速、靈敏、操作簡便等優(yōu)點，是目前在化學品、藥品、醫(yī)療器械等諸多領域中被廣泛應用的一種遺傳毒性初篩測試方法。由于ART液體器械具有組分復雜、營養(yǎng)豐富等特點，使該類器械在進行細菌回復突變試驗時極易對試驗系統(tǒng)產生干擾作用，從而影響試驗有效性及最終測試結果的判讀。本文以ART液體器械的典型代表—囊胚培養(yǎng)液為例，對該類器械的細菌回復突變試驗進行了優(yōu)化研究，以期為其遺傳毒性等安全性評價提供技術參考[6]。

1.材料與方法

1.1 一般材料

試劑：生理鹽水（廣西裕源）；NaNH4HPO4·4H2O、K2HPO4·3H2O、MgSO4·7H2O、NaCl、KCl、MgCl2·6H2O、葡萄糖、L-組氨酸、D-生物素（國藥）；檸檬酸、疊氮鈉（Alfa Aesar）；PBS緩沖液（HyClone）；瓊脂粉（Beyotime）；葡萄糖-6-磷酸鹽、9-氨基吖啶、2-硝基芴、2-氨基蒽（Sigma-Aldrich）；NADP（Biohonren）；苯并（a）芘（Aladdin）；絲裂霉素C（GLPBIO）；大鼠肝微粒體酶S9（Moltox）。

菌種：鼠傷寒沙門氏菌（Salmonellatyphimurium)TA97a、TA98、TA100、TA102、TA1535（Moltox）。

儀器設備：高壓滅菌器（上海博迅）；超凈工作臺（江蘇蘇凈）；生物安全柜（Haier Biomedical）；生化培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)搖床（上海一恒）；分光光度計（Thermo Fisher）。

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

參照YY/T 0870.1分別配制S9-Mix、40%（W/V）葡萄糖溶液、Vogel-Bonner（VB）液、底層瓊脂培養(yǎng)基、頂層瓊脂培養(yǎng)基及陽性誘變劑。

1.2.2 菌懸液制備

將各試驗菌株接種至NB培養(yǎng)基中，37?C靜置過夜，隨后37?C振蕩培養(yǎng)至獲得109cfu/mL的菌懸液。

病害防治。在茄子的生長中，其病害主要有茄苗猝倒病、立枯病、綿疫病和病毒病，針對這些病害要采取具體的措施進行防治，一般采用用50%多菌靈可濕性粉劑每平方米苗床 8-10 g，與細土混勻，播種時下鋪上蓋，出苗后用75%百菌清可濕性粉劑六百倍液噴霧可防治猝倒病與立枯病菌；也可以用64%殺毒礬600倍液噴霧防治綿疫?。挥镁S生素A120倍液噴霧，苗期2次，移栽后1次，可防治病毒病。

1.2.3 樣品制備

無菌操作，將囊胚培養(yǎng)液用生理鹽水分別稀釋為50%、25%、12.5%、5%四個濃度，共平行制備三份樣品，稀釋完成后立即用于試驗（本研究共選取100%、50%、25%、12.5%、5%五個劑量水平）。

1.2.4 平板摻入流程

將頂層瓊脂培養(yǎng)基融化并保溫在45?C條件下，根據(jù)表1將各溶液加入頂層瓊脂培養(yǎng)基中，混勻后注入底層瓊脂平板上，轉動平板使其分布均勻（每組三個平行）。待頂層瓊脂培養(yǎng)基凝固后，于37?C倒置培養(yǎng)72h。培養(yǎng)后，觀察背景菌苔生長情況，記錄每皿回復突變菌落數(shù)，以每皿回復突變菌落數(shù)平均值±標準差（Mean±SD）表示。

表1.組別設置(mL)

1.2.5 結果評估

使用SPSS Statistics 25對各組間的回復突變菌落數(shù)進行差異性分析（t檢驗），P<0.01（陽性對照與陰性對照比較）、P<0.05（試驗組與陰性對照比較）即認為存在顯著性差異。

試驗菌懸液濃度應≥109cfu/mL，背景菌苔應生長良好；自發(fā)回復突變組回復突變菌落數(shù)應在實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍內；陽性對照較陰性對照應有顯著性增加且在實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍內；滿足上述條件，試驗系統(tǒng)方為有效。

不論在活化或非活化的試驗系統(tǒng)下，試驗組回復突變菌落數(shù)較對應陰性對照具有與劑量相關的增加，或至少在一個劑量水平，至少有一種試驗菌株呈現(xiàn)出可重復的并具有統(tǒng)計學意義的增加，且上述試驗組回復突變菌落數(shù)超出了陰性對照的實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍，即可判定為陽性結果；反之則判定為陰性結果[7,8]。

2.結果與分析

2.1 背景菌苔生長情況及回復突變菌落生長抑制性分析

背景菌苔生長情況[9]：與陰性對照相比，12.5%樣品的TA97a（+S9）和12.5%樣品的TA98（+S9）和100%樣品的TA1535（-S9）和100%、50%、25%樣品的TA1535（+S9）的背景菌苔顯著變薄，且背景菌落明顯增大，致使有肉眼可見的孤立菌落出現(xiàn)；100%、50%、25%樣品的TA97a（+S9）和TA98（+S9）有超過平皿面積90%的區(qū)域無背景菌苔產生；5%樣品的各菌種背景菌苔生長良好。

回復突變菌落生長抑制性：與陰性對照相比，100%樣品的TA102（-S9）回復突變菌落數(shù)的降低率超過50%，100%、50%、25%樣品的TA102（+S9）回復突變菌落數(shù)的降低率超過50%；12.5%、5%樣品各菌種每皿回復突變菌落數(shù)未出現(xiàn)上述情況。

通過對上述結果的綜合分析（見表2），排除對本試驗系統(tǒng)具有細胞毒性或生長抑制性的劑量水平后，用于后續(xù)細菌回復突變試驗結果評估的劑量分別為：100%樣品的TA97a（-S9）、TA98（-S9）、TA100（+S9和-S9），50%樣品的TA102（-S9）、TA1535（-S9），12.5%樣品的TA102（+S9）、TA1535（+S9）及5%樣品的TA97a（+S9）、TA98（+S9）。

表2.背景菌苔生長情況及回復突變菌落生長抑制性分析

2.2 細菌回復突變試驗結果分析

試驗菌懸液濃度為1.7×109cfu/mL，自發(fā)回復突變組回復突變菌落數(shù)均在實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍內。陽性對照回復突變菌落數(shù)較陰性對照具有顯著性增加（P<0.01）且在實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍內，差異性分析見表3。因此，本研究中的細菌回復突變試驗系統(tǒng)有效。

表3.回復突變菌落數(shù)的差異性分析(t檢驗)

與陰性對照相比，100%樣品的TA97a（-S9）、TA98（-S9）、TA100（+S9和-S9），50%樣品的TA102（-S9）、TA1535（-S9），12.5%樣品的TA102（+S9）、TA1535（+S9），5%樣品的TA97a（+S9）的回復突變菌落數(shù)均不存在統(tǒng)計學上的顯著性差異（P>0.05）；5%樣品的TA98（+S9）雖然存在顯著性差異（P<0.05），但其并未超出陰性對照的實驗室歷史數(shù)據(jù)范圍；故上述各組別的試驗數(shù)據(jù)均不符合“1.2.5結果評估”中關于陽性結果的評判要求，差異性分析見表3。

綜上所述：在本研究條件下，細菌回復突變試驗系統(tǒng)有效，試驗結果為陰性（無致突變作用），且試驗結果具有可重復性（三份平行樣品的試驗結果顯示出極高相似性，重復性數(shù)據(jù)未呈現(xiàn)），說明本研究對該試驗的優(yōu)化是行之有效的。

3.討論

3.1 ART液體器械細菌回復突變試驗劑量水平選擇的優(yōu)化

ISO/TR 10993-33中規(guī)定：對于無細胞毒性的可溶受試樣品，在≥5μL/皿的劑量范圍內選擇單一劑量水平進行細菌回復突變試驗即可[7]。但由于多數(shù)ART液體器械均含有豐富的供配子和胚胎生長發(fā)育所必需的能量物質（如氨基酸、葡萄糖、丙酮酸鹽等），受試樣品中大量的氨基酸和糖類等物質會干擾細菌回復突變試驗的部分細菌體系，造成部分試驗菌種的自發(fā)回復突變數(shù)量異常增多、背景菌苔生長異常等現(xiàn)象（過半數(shù)的組別在原液等其他高濃度時出現(xiàn)異常），從而導致整個細菌回復突變試驗的失敗或測試結果誤判等[10]。因此，對于ART液體器械的細菌回復突變試驗來說，在不確定其氨基酸或糖類等物質種類及含量的情況下，建議在≥5μL/皿的劑量范圍內進行多劑量水平試驗（如本研究中的100%、50%、25%、12.5%、5%五劑量水平），以規(guī)避高濃度的氨基酸和糖類等物質對試驗系統(tǒng)可能存在的干擾作用。

3.2 ART液體器械細菌回復突變試驗結果判定方式的優(yōu)化

對于多劑量水平的細菌回復突變試驗來說，其結果判定的方式通常為：通過背景菌苔生長情況及回復突變菌落生長抑制性的分析，篩選出對所有試驗菌株在各試驗系統(tǒng)（+S9與-S9）下均無異常的劑量組別，隨后使用該劑量水平的測試數(shù)據(jù)對結果進行最終判定；但經(jīng)過對多種ART液體器械的細菌回復突變試驗結果的分析，發(fā)現(xiàn)上述常用的結果判定方式存在著較大缺陷，極易造成陽性結果漏判等情況。因此，建議對ART液體器械細菌回復突變試驗的結果采用分類、多重判定的方式來進行（如2.1所述），這種分類判定的方式使得每種試驗菌株的各試驗系統(tǒng)均采用了對該組別試驗無干擾作用的最大劑量水平進行最終的結果判定，可以很好地避免陽性結果漏判情況，使結果更準確、可靠。