低氧環(huán)境下HLA-G及EPAS1參與大鼠子癇前期發(fā)病機制研究

謝瑩鶯，馬 萌，趙海寧，徐夢婷，何岑盈，孫春蕾，許文宇

高原地區(qū)有低壓、缺氧、寒冷、強紫外線輻射等特點，其中最重要的是低氧環(huán)境，易誘發(fā)子癇前期(preeclampsia，PE)。該課題組前期研究[1]發(fā)現(xiàn)，低氧條件下通過小分子干擾RNA抑制絨毛膜滋養(yǎng)細胞系JEG-3細胞人類白細胞抗原-G(human leukocyte antigen-G，HLA-G)的表達，可能影響滋養(yǎng)細胞的增殖及侵襲能力，參與妊娠期高血壓疾病的發(fā)生。內皮PAS結構域包含蛋白1(endothelial PAS domain-containing protein 1，EPAS1)是細胞在缺氧應答反應中最重要的調節(jié)因子之一。依據(jù)EPAS1的生物學特性，可將EPAS1低氧信號通路作為主要細胞信號通路，通過大鼠實驗來明確HLA-G、EPAS1蛋白參與高原低氧環(huán)境下子癇前期發(fā)病的分子機制。故該研究建立PE孕鼠模型，在模擬低氧環(huán)境下研究低氧環(huán)境對正常妊娠和PE孕鼠血壓、24 h尿蛋白、血清丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、白蛋白(albumin，ALB)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)值的影響及胎盤HLA-G蛋白和EPAS1蛋白表達變化，探討低氧環(huán)境下孕鼠胎盤HLA-G、EPAS1低氧反應通路對子癇前期的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雌性和雄性SD大鼠，10～12周齡，體質量(230±20)g，SPF級，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。SD大鼠于動物飼養(yǎng)中心適應性喂養(yǎng)1周后，于下午18點將雌鼠與雄鼠按2 ∶1合籠，次日上午8點觀察受孕情況，以觀察到陰道栓日為妊娠第1天。本實驗通過了青海大學附屬醫(yī)院倫理委員會的倫理審查(倫理批號：P-SL-2017064)。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 觀察到孕栓的大鼠隨機分為常氧組(5只正常妊娠孕鼠，5只PE模型孕鼠，共10只)，急性低氧組：分48 h、72 h 和1周三個時間點，(每個低氧時間點包括5只正常妊娠孕鼠、5只PE模型孕鼠，共30只)，慢性低氧組：分2周、3周兩個時間點(每個低氧時間點包括5只正常妊娠孕鼠、5只PE模型孕鼠，共20只)。因大鼠平均孕期在22 d左右，低氧48 h處理孕鼠于妊娠第19天放置低壓氧艙中(模擬5 000 m海拔，氧濃度12%左右)，低氧72 h處理孕鼠于妊娠第18天放置低壓氧艙中，低氧1周處理孕鼠于妊娠第14天放置低壓氧艙中，低氧2周處理孕鼠于妊娠第7天放置低壓氧艙中，低氧3周處理孕鼠于妊娠第1天放置低壓氧艙中，這樣檢測孕鼠胎盤因子表達結果時，孕鼠都處于妊娠晚期，可消除妊娠不同時期胎盤因子的變化對實驗結果的影響。低氧處理期間每日固定時間喂水，喂食。

1.2.2PE造模 孕鼠于妊娠第11天開始，使用亞硝基左精氨酸甲酯 (N-nitro-L-arginine methylester, L-NAME)溶液(美國SIGMA公司)0.25 g/(kg·d)腹腔注射，共7 d，正常妊娠孕鼠于妊娠第11天開始規(guī)律腹腔注射同劑量生理鹽水，共7 d。低氧48 h、72 h模型組大鼠為造模成功后放置低壓氧艙中，低氧1周、2周、3周模型組大鼠為低氧處理同時腹腔注射L-NAME。所有孕鼠于妊娠第9天和妊娠第21天運用大鼠鼠尾無創(chuàng)血壓儀(安徽正華生物儀器設備有限公司)測量血壓；分別于妊娠第9天和妊娠第21天放入代謝籠中，禁食不禁水，收集孕鼠24 h尿液。運用全自動生化分析儀測量24 h尿蛋白總量。

目前國內外尚無統(tǒng)一的動物子癇前期診斷標準，本實驗按收縮壓和(或)舒張壓達到140 mmHg和(或)90 mmHg[2]，造模前后24 h尿蛋白明顯升高為造模成功。

1.2.3肝、腎功能檢測 于妊娠第21天，使用20%烏拉坦按[梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司]5 ml/kg劑量腹腔注射麻醉后，留取下腔靜脈血4 ml左右，全自動生化分析儀檢測ALT、ALB、BUN、Cr值。

1.2.4免疫組化檢測胎盤組織HLA-G、EPAS1蛋白表達 孕鼠麻醉后切開子宮，無菌剪剪取適量胎盤組織，放至甲醛溶液(中性)中固定。免疫組化檢測胎盤組織中HLA-G、EPAS1低氧反應通路蛋白表達。

2 結果

2.1 大鼠無創(chuàng)血壓儀測量血壓值妊娠第1天，各組孕鼠平均收縮壓與舒張壓差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。妊娠第21天，各組孕鼠平均收縮壓與舒張壓均有差異，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，與同條件正常妊娠孕鼠比較，各PE組平均收縮壓、舒張壓均升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，PE孕鼠造模成功；各正常妊娠低氧組、PE低氧組孕鼠平均收縮壓、舒張壓分別與對應常氧組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即低氧處理對孕鼠血壓無影響，見表1。

表1 各組孕鼠收縮壓、舒張壓變化

2.2 全自動生化分析儀測量24h尿蛋白總量妊娠第1天，各組孕鼠24 h尿蛋白差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。妊娠第21天，各組孕鼠24 h尿蛋白間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中，與同條件正常孕鼠比較，各PE組24 h尿蛋白增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即注射L-NAME溶液后孕鼠24 h尿蛋白增加；各正常妊娠低氧組、PE低氧組孕鼠24 h尿蛋白與同條件常氧組比較均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即低氧處理對正常妊娠孕鼠、PE孕鼠24 h尿蛋白無影響，見表2。

表2 各組孕鼠24h尿蛋白變化

2.3 全自動生化分析儀檢測ALT、ALB、BUN、Cr值各組孕鼠ALT、BUN值比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，其中低氧環(huán)境下正常妊娠孕鼠ALT、BUN值均呈一過性改變，ALT值在低氧72 h后開始上升，低氧1周、2周升高達最大值，低氧3周下降，但仍比常氧組和低氧48 h組增高(P<0.05)；BUN值在低氧48 h后即開始升高，至低氧1周達最大值，低氧2周、3周降低，但仍比常氧組稍高(P<0.05)，PE組ALT、BUN值呈相同趨勢；各低氧時間點的PE組ALT、BUN值與同條件正常妊娠組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即注射L-NAME對孕鼠ALT、BUN值無影響。各組孕鼠ALB、Cr值比較均差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，即低氧處理和注射L-NAME溶液對正常妊娠孕鼠和PE孕鼠ALB、Cr值無影響，見表3。

表3 各組孕鼠ALT、ALB、BUN、Cr值變化

2.4 各組孕鼠胎盤組織HLA-G蛋白表達每張免疫組化片子里隨機選取20個高倍視野，每組5張片子，共100個視野進行統(tǒng)計分析。HLA-G蛋白主要表達于胎盤滋養(yǎng)細胞的胞質和胞膜中(見圖1A、B)。低氧環(huán)境下正常妊娠組內胎盤組織HLA-G蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=201.62，P<0.001)、PE組內比較差異亦有統(tǒng)計學意義(χ2=159.74，P<0.001)，說明低氧環(huán)境影響HLA-G蛋白表達；正常妊娠組組內比較，胎盤HLA-G蛋白表達陽性率在低氧48 h、72 h處理后下降，低氧1周處理后陽性率較低氧48 h、72 h增加，但仍低于常氧水平，至低氧2周、3周陽性率與常氧無差異，PE組組內比較胎盤HLA-G蛋白陽性表達率呈相同趨勢。各PE組孕鼠胎盤HLA-G蛋白表達陽性率與同條件正常妊娠組孕鼠比較，HLA-G蛋白表達陽性率均下降，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，即PE孕鼠胎盤HLA-G蛋白陽性表達率低于正常妊娠孕鼠，見表4。

表4 低氧環(huán)境孕鼠HLA-G蛋白表達變化

正常妊娠組和PE組孕鼠組內兩兩比較調整檢驗水準=0.05/15=0.003 3。正常妊娠組組內比較總χ2=194.609，P=0.000，PE組組內比較總χ2=162.232，P=0.000，兩組組內均是除低氧48 h組vs低氧72 h組、低氧2周組vs常氧組、低氧3周組vs常氧組、低氧2周組vs低氧3周組無差異，其余組間兩兩比較P均<0.003 3

2.5 各組孕鼠胎盤組織EPAS1蛋白表達EPAS1蛋白主要表達于滋養(yǎng)細胞胞核和胞質(見圖1C、D)。低氧環(huán)境下正常妊娠組內胎盤組織EPAS1蛋白表達比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=229.04，P=0.000)、PE組內比較差異亦有統(tǒng)計學意義(χ2=245.73，P=0.000)，說明低氧環(huán)境下EPAS1蛋白表達水平升高；正常妊娠組組內比較，胎盤EPAS1蛋白表達陽性率在低氧48 h、72 h處理后陽性率上升，低氧1周處理后陽性率下降，至低氧2周、3周陽性率與常氧無差異，PE組組內比較胎盤EPAS1蛋白陽性表達率呈相同趨勢。各PE組孕鼠胎盤EPAS1蛋白表達陽性率與同條件正常妊娠組孕鼠比較，EPAS1蛋白表達陽性率均上升，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。即PE孕鼠胎盤EPAS1蛋白陽性表達率高于正常妊娠孕鼠，見表5。

圖1 HLA-G蛋白與EPAS1蛋白免疫組化表達部位 SP×400

表5 低氧環(huán)境孕鼠EPAS1蛋白表達變化

3 討論

3.1 高原低氧環(huán)境與PE的關系高原低氧是人類生存面臨的最大環(huán)境威脅之一，缺氧是許多廣泛存在的人類疾病的中心特征，而且高海拔會損害胎兒生長，增加PE的發(fā)病率，并因此增加圍產(chǎn)期和/或產(chǎn)婦發(fā)病率和死亡率的風險[3]。眾所周知，血管內皮細胞損傷是PE的基本病理變化之一，它使血正常妊娠組內和PE組孕鼠組內兩兩比較調整檢驗水準=0.05/15=0.003 3。正常妊娠組內比較總χ2=229.036，P=0.000，PE組組內比較總χ2=245.731，P=0.000，兩組組內均是除低氧48 h組vs低氧72 h組、低氧2周組vs常氧組、低氧3周組vs常氧組、低氧2周組vs低氧3周組無差異，其余組間兩兩比較P均<0.003 3管擴張物質如一氧化氮等合成減少，從而促進血管痙攣。L-NAME作為一種一氧化氮合酶的抑制劑，可抑制一氧化氮產(chǎn)生，使動物模型的血流動力學發(fā)生了一系列變化，包括胎盤和腎臟缺血，缺氧癥狀，血管內皮損傷、氧化應激和炎癥反應加劇，L-NAME誘發(fā)PE模型為研究PE的發(fā)病機制提供了強有力的工具[4]。本研究使用L-NAME溶液制作PE孕鼠模型，模擬海拔5 000 m高原低氧環(huán)境研究低氧對正常孕鼠及PE孕鼠的影響，結果顯示低氧處理對孕鼠ALB、Cr值均無影響，ALT、BUN值于低氧48 h至72 h后開始上升，低氧1周、2周升高達最大值，可能是ALT、BUN值對缺氧的反應更為敏感。而低氧對孕鼠血壓、尿蛋白無明顯影響，不能體現(xiàn)高原地區(qū)對PE發(fā)病率的影響，可能與實驗樣本量不夠大及大鼠在西寧地區(qū)(海拔2 200 m)適應性喂養(yǎng)1周有關。

3.2 低氧環(huán)境下大鼠胎盤組織HLA-G表達的影響HLA-G稱為非經(jīng)典的HLA-Ⅰ分子，區(qū)別于經(jīng)典HLA分子，具有有限的基因多態(tài)性、限制性組織分布、特殊的選擇性剪切模式的特點[5]。HLA-G分子的特點及功能決定了它必然在母胎免疫耐受方面具有關鍵性作用。首次對青海高原地區(qū)PE患者胎盤組織中HLA-G mRNA及蛋白進行定量分析發(fā)現(xiàn)，HLA-G基因轉錄的下調及其蛋白質表達下降，在青海高原地區(qū)PE的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用[6]。前期還研究了不同海拔PE患者HLA-G的表達，結果發(fā)現(xiàn)海拔的增高引起HLA-G低表達，可能是高原地區(qū)PE發(fā)病率高于平原地區(qū)的原因之一[7]。本研究中通過免疫組化研究了低氧環(huán)境下孕鼠胎盤HLA-G蛋白的表達，結果表明HLA-G蛋白在PE孕鼠胎盤陽性表達率明顯降低，進一步通過動物實驗驗證了HLA-G可能參與PE的發(fā)病機制。另外胎盤HLA-G蛋白整體表達呈先下降后上升的動態(tài)變化。這與課題組前期低氧環(huán)境下細胞實驗結果一致，低氧組在48 h及72 h，JEG-3細胞中HLA-G mRNA水平較常氧組降低[8]。急性低氧可能加重母體對胎盤產(chǎn)生免疫攻擊性，但在機體適應低氧后，母體和胎盤免疫關系又恢復正常。

3.3 低氧環(huán)境下大鼠胎盤組織EPAS1表達的影響胎盤最初是在含氧量為1%的低氧環(huán)境中發(fā)育，直到懷孕10周后。在此期間，氧濃度對滋養(yǎng)細胞活性有重要影響，缺氧誘導因子被認為是影響妊娠早期滋養(yǎng)細胞生物學行為的重要調節(jié)因子之一[9]。其中HIF-1和 EPAS1是細胞在缺氧應答反應中最重要的調節(jié)因子。EPAS1又名缺氧誘導因子2(hypoxia inducible factor-2，HIF-2)。有研究報道低氧狀態(tài)下為維持內皮細胞氧平衡，HIF-2α可能替代HIF-1α起作用，HIF-2α在長期慢性缺氧反應中起著重要作用，HIF-1α則與急性缺氧反應有關[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，各PE組的孕鼠胎盤EPAS1蛋白陽性表達率較正常妊娠孕鼠高，EPAS1可能參與PE的發(fā)病機制。另外低氧環(huán)境下胎盤EPAS1蛋白整體表達呈先上升后下降的動態(tài)變化，這表明孕鼠在急性缺氧的48 h、72 h內對EPAS1蛋白的影響最大，從低氧1周開始由急性缺氧轉為初期習服過程，至低氧2周、3周，尤其3周達到習服水平，與Ahmed et al[11]的研究結果一致，可能預示著PE的低氧細胞對缺氧的高選擇性壓力的反應，具有更高的遺傳變異性，這可能導致適應高海拔。

綜上所述，HLA-G和EPAS1可能參與PE發(fā)病機制。本研究推測，HLA-G作為一種免疫抑制因子，急性低氧可能會下調HLA-G表達使母胎免疫失衡。在急性低氧環(huán)境下滋養(yǎng)細胞可能為了應對低氧使EPAS1表達增加，從而調節(jié)下游基因使血管生成增加，組織血供增加應對缺氧，在機體適應缺氧后EPAS1蛋白表達又恢復至正常水平，低氧環(huán)境下胎盤EPAS1的整體表達趨勢可看作機體對低氧反應的適應。而HLA-G和EPAS1也可能存在某種關系，將下一步實驗計劃中嘗試通過細胞實驗檢測沉默表達后HLA-G、EPAS1和其下游基因的變化，為PE的發(fā)病機制和治療提供更好的依據(jù)。