青蛤I型溶菌酶在畢赤酵母中的重組DNA表達

馮付靄，趙 震，陶 妍,2，謝 晶,2，錢韻芳,2

( 1.上海海洋大學 食品學院，上海 201306；2.上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306 )

溶菌酶在大多數(shù)生物先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用，其主要包括植物、動物和微生物來源的溶菌酶[1]；而動物來源的溶菌酶則可分為雞型(C型)、鵝型(G型)和無脊椎動物型(I型)，其中研究最多、最具代表性的是C型，即雞蛋清中的天然C型溶菌酶。水產(chǎn)動物溶菌酶的研究起步較晚，但因其特殊的作用機理及其在動物免疫中的重要作用而越來越受到關注[2]。魚類等脊椎動物中僅存在C、G型溶菌酶，而貝類等無脊椎動物中3種類型溶菌酶均存在[3]。三者之間在一級結構上存在較大差異，C型溶菌酶含保守的8個半胱氨酸殘基，魚類G型溶菌酶大多數(shù)缺乏半胱氨酸殘基；而I型溶菌酶含多至14個的半胱氨酸殘基，以致在空間上可形成7對二硫鍵而賦予其結構的高穩(wěn)定性[4-5]。自1975年Jollès等[6]從海星Asteriasrubens中分離出第一個I型溶菌酶以來，已從斑節(jié)對蝦(Penaeusmonodon)[7]、仿刺參(Apostichopusjaponicus)[8]、青蛤(Cyclinasinensis)[9]、剃刀蛤(Sinonovaculaconstricta)[10]和文昌魚(Branchiostomajaponicum)[3]等無脊椎動物中克隆到I型溶菌酶基因。

曾有學者對文昌魚施行鰻弧菌(Vibrioanguillarum)挑戰(zhàn)試驗，發(fā)現(xiàn)其鰓中C型和G型溶菌酶基因的mRNA轉錄水平并無明顯變化，但I型溶菌酶的轉錄水平在24 h后明顯提高[3]；有研究顯示，將菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)置于人為設置的鰻弧菌污染的養(yǎng)殖環(huán)境中，其I型溶菌酶基因在血細胞中的轉錄水平顯著提高[11]；此外，當剃刀蛤在有副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)的環(huán)境中生長時，其鰓和肝胰腺中I型溶菌酶基因的轉錄水平顯著增加[10]。由此可以確定I型溶菌酶是無脊椎動物的重要蛋白質免疫因子，因此其可以成為開發(fā)天然抗菌劑的良好候選者。曾有學者構建了剃刀蛤和仿刺參的I型溶菌酶的原核表達系統(tǒng)，最初獲得的是無活性的表達產(chǎn)物，對其進行基于尿素透析的復性處理后才使其顯示部分活性[10,12]；另有學者通過巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統(tǒng)獲得克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)的重組I型溶菌酶，其顯示了抗多種細菌的生物學活性[13]。

青蛤是我國沿海重要的經(jīng)濟貝類之一，其作為濾食性的水產(chǎn)生物，具有較強的抗逆能力。研究表明，在有鰻弧菌的養(yǎng)殖環(huán)境中生長的青蛤，其體內的某些溶菌酶的轉錄水平會明顯提高[9]。對其C型溶菌酶基因進行了cDNA克隆及基于重組畢赤酵母的生物合成研究，發(fā)現(xiàn)重組C型溶菌酶具有良好的抑菌活性和穩(wěn)定性[14]。然而，關于青蛤I型溶菌酶的重組表達方面的研究尚未見報道。據(jù)此，筆者擬通過構建重組畢赤酵母菌株，實現(xiàn)青蛤I型溶菌酶的分泌表達，旨在為無脊椎動物來源I型溶菌酶的制備提供重組DNA技術。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物、載體和菌株

青蛤來源于上海市魚港路海鮮市場；pMD-19T來源于日本TaKaRa公司；pPICZαA和畢赤酵母X-33來源于美國Invitrogen公司(pPICZαA屬穿梭載體，它含眾多限制性酶切位點以便于目的基因與其連接構建重組載體；此外，它含有強誘導型醇氧化酶啟動子5′AOX1和分泌信號肽α-factor，前者可以利用甲醇表達任何外源基因，而后者能夠實現(xiàn)外源蛋白的持續(xù)分泌表達)；大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α來源于北京天根生物科技有限公司；試驗細菌為副溶血性弧菌(ATCC17802)、大腸桿菌(ATCC25922)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，ATCC6538)。

1.1.2 主要試劑

RNAiso plus、Taq DNA 聚合酶、T4DNA連接酶和3種核酸內切酶(Xba Ⅰ、Xho Ⅰ、Sac Ⅰ)來源于日本TaKaRa公司；Fastking cDNA第1鏈合成試劑盒、DNA分子量標準、膠上DNA和酵母基因組DNA以及質粒提取的試劑盒來源于北京天根生物科技有限公司；蛋白質分子量標準來源于北京中科瑞泰生物科技有限公司；Western Blot試劑盒來源于北京康為世紀生物科技有限公司。DNA測序和PCR引物的合成委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。用于培養(yǎng)細菌和畢赤酵母的所有培養(yǎng)基配方(LB、YPD、MM、MD、BMGY、BMMY)見畢赤酵母表達系統(tǒng)手冊(Invitrogen公司)。

1.2 方法

1.2.1 反轉錄PCR擴增青蛤I型溶菌酶基因

新鮮青蛤采購后快速運至實驗室，立即取其閉殼肌，按RNAiso Plus說明書提取總RNA。第1鏈cDNA的合成：2 μL總RNA、1 μL 3′ RACE Adaptor primer (5 μmol/L)、2 μL 5×Prime Script Buffer、1 μL dNTPs Mixture (10 mmol/L each)、0.25 μL RNase Inhibitor (40 U/μL)、0.25 μL Prime Script RTase (200 U/μL)、3.5 μL RNase-Free dH2O；先42 ℃ 60 min，再70 ℃ 15 min。

參考青蛤I型溶菌酶基因序列(GenBank登錄號：HQ651175)設計引物(表1)。以第1鏈 cDNA 為模板、F1和 R1為引物，通過PCR擴增編碼青蛤I型溶菌酶的全長cDNA。PCR體系：1 μL 10×Taq Buffer、0.8 μL dNTPs(2.5 μmol/L each)、各 0.2 μL 的F1和R1(10 μmol/L)、0.1 μL第1鏈 cDNA、0.1 μL Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)，調至總量10 μL。PCR程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 40 s，56.5 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。以pMD-19T為克隆載體，將第1次PCR產(chǎn)物與其連接后轉入大腸桿菌DH5α細胞，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基培養(yǎng)后挑取白色菌落用于陽性克隆的篩選，入選的陽性克隆由生工生物工程(上海)股份有限公司進行DNA測序。在此基礎上再分別以2對引物(F2、R2和F2、R3)(表1)進行第2次和第3次PCR，以在5′端(Xho Ⅰ位點、Kex 2信號肽酶切位點)和3′端(6×His標簽、終止密碼子、Xba Ⅰ位點)添加相關位點，反應體系和程序同第1次PCR，退火溫度分別改為58.6 ℃和58.4 ℃。最終獲得的目的片段同上經(jīng)DNA測序后命名為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因。經(jīng)ExPASy軟件(http：//web.expasy.org/compute.pi/)預測CslyI的分子質量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2.2 pPICZαA-CslyI和X-33/pPICZαA-CslyI的構建

pMD-19T-CslyI經(jīng)Xba Ⅰ和Xho Ⅰ雙酶切后獲得目的片段CslyI，按試劑盒說明書將其與pPICZαA連接構建重組表達載體pPICZαA-CslyI(圖1)，再轉入大腸桿菌DH5α細胞后經(jīng)增殖培養(yǎng)、按照快速小提質粒試劑盒說明書提取純化重組載體pPICZαA-CslyI，通過雙酶切、菌落PCR和DNA測序對其進行確證。雙酶切反應體系：70 μL重組載體、10 μL 10×M Buffer、10 μL 0.1% BSA、5 μL Xho Ⅰ(15 U/μL)、4 μL Xba Ⅰ(10 U/μL)，37 ℃反應8 h。

圖1 重組表達載體pPICZαA-CslyI的構建Fig.1 Construction of recombinant expression vector pPICZαA-CslyI

使用Sac Ⅰ對pPICZαA-CslyI進行線性化酶切后，將其與畢赤酵母X-33按1∶8(體積比)混合，置于電轉杯中冰浴數(shù)分鐘后電擊5 ms (1.5 kV、25 μF、200 Ω)；加入1 mol/L的山梨醇1 mL，約1.5 h后加入YPD培養(yǎng)基1 mL于搖床培養(yǎng)1.5 h；菌體涂于含100 μg/mL博萊霉素YPD平板，于29 ℃培養(yǎng)3～5 d。挑選長勢飽滿的酵母單菌落再依次接種至含1000 μg/mL博萊霉素MM、MD、YPD平板，經(jīng)培養(yǎng)后篩選優(yōu)質的X-33/pPICZαA-CslyI酵母轉化子，并使用5′AOX 1和3′AOX 1(表1)對其基因組DNA進行PCR鑒定。另外，同上方法構建X-33/pPICZαA酵母轉化子作為陰性對照。

1.2.3 重組青蛤I型溶菌酶的誘導表達和鑒定

于5 mL的YPD培養(yǎng)基中接種入優(yōu)質的酵母轉化子后，28 ℃、250 r/min搖床培養(yǎng)16 h；轉接250 μL于50 mL的BMGY培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)48 h；菌體重懸于250 mL的BMMY培養(yǎng)基(含1%甲醇)中，再培養(yǎng)72 h。通過Tricine-SDS-PAGE分析離心后的培養(yǎng)液上清[4%濃縮膠、18%分離膠、9%三羥甲基氨基甲烷(Tris)、0.1%十二烷基硫酸鈉(SDS)]。

Western blot分析按試劑盒說明書進行：凝膠上的蛋白質條帶被電轉至聚偏二氟乙烯膜后，加入封閉液8 mL反應1 h；用1×TBST兩次洗膜后再分別與鼠單克隆抗體和山羊抗小鼠單克隆抗體反應2 h和1 h；經(jīng)洗膜后使用HRP-DAB試劑盒對其顯色。由上海中科新生命生物科技有限公司對經(jīng)鎳離子親和層析純化后的重組蛋白進行基于MALDI-TOF-TOF的序列分析。

1.2.4 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性及穩(wěn)定性測定

將培養(yǎng)至600 nm吸光值[D(600 nm)]為0.5的副溶血性弧菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌分別稀釋100倍后，按1∶100(體積比)與X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液于37 ℃作用2 h；然后取30 μL涂于LB平板上，37 ℃培養(yǎng)至菌落長出。以X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液作為陰性對照。

另一方面，將40 μL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別注入96孔板中，加入經(jīng)100 ℃沸水浴保溫0、20、40、60 min的80 μL培養(yǎng)液上清液，于37 ℃孵育過夜后使用酶標儀(BioTeK?，美國)測定D(600 nm)，以考察經(jīng)高溫處理不同時間后的培養(yǎng)液上清液對細菌的抑制作用[15]。每個試驗組3個平行，使用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。

2 結 果

2.1 青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因的cDNA克隆

經(jīng)過3次PCR依次擴增到590、516、528 bp的cDNA片段，最后的PCR產(chǎn)物為青蛤I型溶菌酶(CslyI)基因(圖2)，其DNA測序結果見圖3，Xho Ⅰ和Xba Ⅰ 2個限制性位點、Kex 2信號肽酶切位點及6×His標簽均被添加。除去這些位點，CslyI基因編碼了由162個氨基酸殘基組成的青蛤I型溶菌酶成熟肽，含有的14個保守半胱氨酸殘基可以在空間上形成7對二硫鍵以穩(wěn)定其空間結構。經(jīng)分析，CslyI的理論分子質量為19.97 ku，等電點為7.6。

圖2 PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR productsM.DNA標記；1.第1次PCR擴增片段；2.第2次PCR擴增片段；3.第3次PCR擴增片段.M.DNA marker;1.the first PCR amplification fragment;2.the second PCR amplification fragment;3.the third PCR amplification fragment.

圖3 目的基因CslyI的核苷酸及其推斷的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide and deduced amino acid sequences of the target gene CslyI斜體指示Xho Ⅰ和Xba Ⅰ酶切位點；下劃線指示Kex 2信號肽酶切位點；陰影指示半胱氨酸殘基.Italics indicate Xho Ⅰ and Xba Ⅰ restriction sites;underline indicates Kex 2 signal cleavage site;cysteine residues are shaded.

2.2 pPICZαA-CslyI的鑒定及其X-33/pPICZαA-CslyI的篩選

以DH5α/pPICZαA-CslyI為模板，使用引物5′AOX1和3′AOX1對重組表達載體pPICZαA-CslyI進行PCR鑒定，擴增到1個約1000 bp的片段，與1030 bp的理論值相符(圖4a)。另一方面，使用Xho Ⅰ和 Xba Ⅰ對pPICZαA-CslyI進行雙酶切后顯示，在略高于500 bp處有淡淡的條帶，與預期的528 bp相符(圖4b)。最終通過DNA測序證明目的基因CslyI已正確連接至pPICZαA表達載體。通過含1000 μg/mL博萊霉素的YPD平板篩選到5株高拷貝的X-33/pPICZαA-CslyI重組菌株，對它們的基因組DNA的驗證結果顯示，5株重組酵母菌均擴增到約1000 bp的片段(圖4c)，與預期的1030 bp相符。

圖4 pPICZαA-CslyI的菌落PCR(a)和雙酶切驗證(b)及X-33/pPICZαA-CslyI的篩選(c)Fig.4 Identification of pPICZαA-CslyI by colony PCR (a) and digestion of two endonucleases (b) as well as screening of X-33/pPICZαA-CslyI (c)M.DNA標記；1.PCR產(chǎn)物；2.雙酶切產(chǎn)物；3～7.含pPICZαA-CslyI的酵母轉化子；8.含pPICZαA的酵母轉化子.M.DNA marker;lane 1.PCR product;lane 2.pPICZαA-CslyI products digested by two endonucleases;lanes 3～7.yeast transformants containing pPICZαA-CslyI;lane 8.yeast transformant containing pPICZαA.

2.3 在畢赤酵母中表達重組蛋白

選擇6號菌株用于重組蛋白質的誘導表達，Tricine-SDS-PAGE結果顯示(圖5a)：培養(yǎng)液上清液在靠近22.0 ku 處存在明顯條帶，基本接近重組蛋白的理論分子質量19.97 ku，初步推測其為目的蛋白；其條帶位置偏上可能與待分析蛋白質樣品變性不完全有關[16]，以下試驗結果將進一步證明此判斷。

圖5 重組菌株表達產(chǎn)物的Tricine-SDS-PAGE(a)和Western blot(b)分析Fig.5 Tricine-SDS-PAGE (a) and Western blot (b) analysis for the recombinant strain productsM1.超低蛋白質分子質量標準；M2.彩虹預染蛋白質分子質量標準；1.含pPICZαA的酵母轉化子培養(yǎng)液上清液；2.含pPICZαA-CslyI的酵母轉化子培養(yǎng)液上清液.M1.ultra-low protein molecular weight marker;M2:rainbow pre-stained protein molecular weight marker;lane 1.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA;lane 2.culture supernatant of yeast transformant containing pPICZαA-CslyI.

2.4 基于Western blot和MALDI-TOF-TOF質譜的表達產(chǎn)物鑒定

通過Western blot對X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液進行分析，其為1個近25 ku的單一明顯雜交條帶，其分子質量明顯高于理論分子質量 19.97 ku(圖5b)，分析原因可能與使用的彩虹預染蛋白質分子量標準有關，即目的蛋白與顯色染料共價偶聯(lián)后，減慢了其在凝膠中的遷移速度，以致顯示的分子量變大，此現(xiàn)象在筆者之前的研究中也有出現(xiàn)。而X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液未出現(xiàn)任何雜交條帶。進一步對表達產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質譜進行分析，結果顯示，在m/z1441.8～2727.4 之間捕獲到2個肽段：m/z為1499.7352的峰代表自N端起第143～155的肽段(GCKSGSTIGYWQR)(圖6)、m/z為2251.0564的峰代表自N端起第67～85的肽段(NVGCKMDIGSYSCGYFQIK)。兩者與推斷的氨基酸理論序列完全一致，證明了表達產(chǎn)物即為預期的重組青蛤I型溶菌酶。

圖6 表達產(chǎn)物的MALDI-TOF-TOF質譜分析Fig.6 MALDI-TOF-TOF mass spectrometry analysis of the expressed products大寫字母指示氨基酸序列.Capital letters indicate amino acid sequences.

2.5 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性和穩(wěn)定性

基于平板涂布法的抑菌活性測定結果顯示，菌株X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液與金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌作用后，菌落數(shù)明顯少于陰性對照(X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液與細菌作用)(圖7)。另一方面，為了考察重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性，將培養(yǎng)液上清液置于沸水浴中保溫不同時間后與金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作用，保溫20、40、60 min后的培養(yǎng)液上清液仍然對上述2種細菌具有抑菌活性(圖8)，與陰性對照組差異不顯著(P>0.05)，表明青蛤I型溶菌酶具有良好的熱穩(wěn)定性。

圖7 重組青蛤I型溶菌酶的抑菌活性Fig.7 Antibacterial activity of the recombinant protein CslyIin clam C. sinensis1.用X-33/pPICZαA的培養(yǎng)液上清液處理的細菌；2.用X-33/pPICZαA-CslyI的培養(yǎng)液上清液處理的細菌.1.bacteria treated with X-33/pPICZαA culture supernatant;2.bacteria treated with X-33/pPICZαA-CslyI culture supernatant.

圖8 高溫處理對重組青蛤I型溶菌酶抑菌活性的影響Fig.8 Effect of high temperature on the antibacterial activity of recombinant CslyI in clam C. sinensis

3 討 論

3.1 影響重組青蛤I型溶菌酶表達量的因素

通過構建青蛤I型溶菌酶的重組畢赤酵母表達系統(tǒng)，首次獲得具有抑菌活性的重組青蛤I型溶菌酶，但表達量很低?？赡苡?個原因：(1)菌體接種量偏低。本次試驗使用的培養(yǎng)基含酵母浸出物和優(yōu)質蛋白胨，它較以前使用的無氨基氮源培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富，更有利于菌體生長，故嘗試將菌體接種量減為0.5%；但本試驗結果顯示，減少接種量會影響重組青蛤I型溶菌酶的表達量。有研究表明，菌體接種量為2%～10%，隨著接種量的增加重組蛋白質的表達量會隨之增加[17]。(2)根據(jù)Graphical Codon Usage Analyser(http://www.gcua.schoedl.de)預測，筆者通過反轉錄PCR克隆的青蛤I型溶菌酶cDNA中存在19個對于畢赤酵母來說的低頻密碼子，該現(xiàn)象可能會影響重組蛋白質的高效表達。有學者報道，其根據(jù)畢赤酵母的密碼子喜好優(yōu)化了納豆激酶成熟肽的基因nkD，結果發(fā)現(xiàn)使用合成的優(yōu)化基因后使重組納豆激酶成熟肽的表達量提高了3.5倍[18]；另有學者對人源溶菌酶基因LYZop進行優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)其在牛乳腺上皮細胞中的表達量提高2.2倍，在牛成纖維細胞中的表達量提高2.44倍[19]。綜上，進一步的研究將關注于菌體的接種量和密碼子的優(yōu)化。

3.2 重組青蛤I型溶菌酶熱穩(wěn)定性的結構基礎

有研究表明，二硫鍵的作用是疊加的，且引入二硫鍵突變體的蛋白質的變性溫度較野生型蛋白質高很多[20]。筆者對重組青蛤I型溶菌酶的熱穩(wěn)定性測定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)100 ℃處理60 min時，其抑菌活性較對照組并無明顯下降，證明重組青蛤I型溶菌酶具有良好的穩(wěn)定性。分析原因可能與其一級結構中含多至14個的半胱氨酸殘基有關，經(jīng)SWISS MODEL在線軟件(https:∥swissmodel.expasy.org/)初步預測，這些半胱氨酸殘基在空間上通過7對二硫鍵將數(shù)個α-螺旋與無規(guī)卷曲等二級結構單元締合在一起，形成緊密的球狀蛋白質而極大地穩(wěn)定了重組青蛤I型溶菌酶的結構。也有學者將海參I型溶菌酶置于85 ℃水浴中保溫50 min，發(fā)現(xiàn)其仍具有80%的相對酶活性[21]。

3.3 基于重組青蛤I型溶菌酶特性的應用展望

就目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展和食品安全而論，綠色無抗生素飼料的應用必將成為主要的趨勢，因此，具有良好熱穩(wěn)定性的重組青蛤I型溶菌酶極具開發(fā)和使用價值。飼料生產(chǎn)中餌料的制作一般須經(jīng)歷原料的粉碎、機械化處理和顆?；驂簤K等過程[22]，這些過程必然會伴隨溫度的上升，而熱穩(wěn)定性良好的重組青蛤I型溶菌酶則能夠抵抗高溫的影響，從而成為水產(chǎn)飼料添加劑的極佳候選者。此外，含重組青蛤I型溶菌酶的培養(yǎng)液上清液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌具有良好的抑菌活性，預示了大規(guī)模制備時對培養(yǎng)液上清液無需進行純化即可將其作為生產(chǎn)天然抗菌劑的原液，這既簡化了工業(yè)上的操作流程，也節(jié)約了生產(chǎn)成本。

4 結 論

通過反轉錄PCR獲得編碼青蛤I型溶菌酶的成熟肽基因CslyI，并成功構建了X-33/pPICZαA-CslyI畢赤酵母重組菌株；該菌株于28 ℃、250 r/min、1%甲醇、72 h的發(fā)酵條件下，成功表達重組青蛤I型溶菌酶；經(jīng)抑菌試驗證明，重組青蛤I型溶菌酶具有明顯的抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和副溶血性弧菌的活性，并在高溫下顯示良好的穩(wěn)定性。試驗結果可為無脊椎動物來源I型溶菌酶的制備提供基于重組畢赤酵母的生物合成技術。