葡萄VvERF90的克隆及對(duì)乙烯合成基因的調(diào)控研究

石中亞 魏紅麗 栗溫新 鄒東方 黃瑩瑩 葉 霞 李志謙 馮建燦

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，河南 鄭州 450002)

葡萄(VitisviniferaL.)是世界廣泛種植的重要果樹之一，其漿果美味多汁，深受消費(fèi)者歡迎。我國種植的葡萄以鮮食品種為主，在采后貯藏過程中易發(fā)生果粒穗梗褐變現(xiàn)象，嚴(yán)重影響葡萄的外觀品質(zhì)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。葡萄是典型的非呼吸躍變型果實(shí)，在生長和發(fā)育過程中乙烯釋放量低，但是在采后貯藏過程中其穗梗的乙烯釋放量比果粒高10～100倍，且一些品種在成熟前有乙烯釋放量明顯增加的現(xiàn)象[1-2]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，穗梗褐變與穗梗的呼吸速率和乙烯釋放量有密切聯(lián)系[3-4]。已有研究表明，采用乙烯受體抑制劑1-甲基環(huán)丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)處理陽光玫瑰和無核白葡萄采后果穗，可以明顯抑制穗梗褐變，而乙烯利處理無核白可以加速穗梗褐變[2]；果實(shí)轉(zhuǎn)色前用乙烯利處理，可以誘導(dǎo)果實(shí)轉(zhuǎn)色和提高乙烯釋放量[5]?？芍蚁┦怯绊懫咸压麑?shí)發(fā)育和采后貯藏的重要因素[6-8]，了解葡萄穗梗乙烯合成與調(diào)控機(jī)制對(duì)葡萄貯藏保鮮具有重要意義。

乙烯合成起始于甲硫氨酸，經(jīng)過SAM合成酶(SAM synthetase)、ACC合成酶(ACC synthase，ACS)和ACC氧化酶(ACC oxidase，ACO)催化形成乙烯[9-10]，其中ACS和ACO是催化乙烯合成的兩個(gè)限速酶[11]。研究表明，在呼吸躍變型果實(shí)中，乙烯信號(hào)路徑的乙烯響應(yīng)因子(ethylene response factor，ERF)轉(zhuǎn)錄因子，可以通過調(diào)控ACS[12-13]和ACO[14]基因的表達(dá)從而參與植物的乙烯合成過程。例如，在香蕉(Musaacuminata)中，MaERF11可以抑制MaACS1和MaACO1的啟動(dòng)子活性，抑制乙烯合成[15]；在蘋果(Malusdomestica)生長發(fā)育過程中，MdERF2可以通過結(jié)合MdACS1和MdACS3a啟動(dòng)子關(guān)鍵順式元件脫水應(yīng)答順式元件(dehydration-responsive element，DRE)，抑制上述2個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄，MdERF3則通過與MdACS1啟動(dòng)子結(jié)合，上調(diào)其表達(dá)[13]。對(duì)葡萄中乙烯合成途徑基因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)在Shiraz葡萄中，VvACS1和VvACO1在果實(shí)成熟之前表達(dá)量較高[16]；在無核白葡萄中，VvACS1和VvACO1基因在果實(shí)成熟后、在穗梗中大量表達(dá)，且與穗梗中乙烯釋放量呈顯著正相關(guān)，其基因表達(dá)量直接影響采前和采后不同時(shí)期穗梗的乙烯釋放量，表明VvACS和VvACO1是調(diào)控葡萄穗梗中乙烯合成的關(guān)鍵基因，但其上游調(diào)控因子并不清晰[1]。葡萄中AP2/ERF超家族共有122個(gè)成員，VvERF90屬于ERF IX亞家族，在葡萄果皮、果肉、花序、葉片和莖中都有表達(dá)[17]。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)葡萄生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)前期對(duì)陽光玫瑰葡萄穗梗褐變現(xiàn)象進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)VvERF90在穗梗褐變過程中表達(dá)較高，且與穗梗中的乙烯釋放呈正相關(guān)[4]。但是在非呼吸躍變型果實(shí)中，ERFs反饋調(diào)節(jié)乙烯合成的研究尚鮮見報(bào)道，尤其是葡萄穗梗中，乙烯釋放量較高的原因，以及ERF是否可以通過調(diào)控VvACSs和VvACOs基因的表達(dá)，進(jìn)而影響果實(shí)和穗梗生長發(fā)育及衰老，仍有待深入研究。

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，ERF轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控乙烯生物合成過程中發(fā)揮重要作用[4,13]，將VvERF90與擬南芥、蘋果和香蕉中的ERF蛋白進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90與蘋果中可以調(diào)控乙烯合成的MdERF3和MdERF2親緣關(guān)系較近，且穗梗中差異表達(dá)的調(diào)控乙烯合成的關(guān)鍵基因VvACO1上有ERF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合的DRE順式元件，由此推測VvERF90可能是調(diào)控葡萄穗梗中乙烯合成的關(guān)鍵基因。因此，本研究克隆在陽光玫瑰葡萄采后貯藏過程中，與穗梗乙烯釋放呈相關(guān)的ERF家族轉(zhuǎn)錄因子VvERF90(GSVIVT00014265001)，并在擬南芥中進(jìn)行異源表達(dá)，旨在研究VvERF90與VvACO1之間的互作關(guān)系，探索VvERF90的基因功能，在分子水平上為調(diào)控葡萄穗梗乙烯合成奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試驗(yàn)于2018年在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試驗(yàn)所用葡萄穗梗材料為采自鄭大葡萄農(nóng)莊種植基地的陽光玫瑰。在果實(shí)成熟期采摘果穗，分離穗梗，液氮冷凍后在-80℃條件下保存，用于RNA的提取。本氏煙草(Nicotianabenthamiana)和擬南芥(Arabidopsisthaliana，哥倫比亞型擬南芥)均種植在人工氣候室中，培養(yǎng)條件為23℃，光照/黑暗16 h/8h。

1.2 基因序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

從葡萄基因組網(wǎng)站中下載VvERF90(GSVIVT00014265001)的氨基酸序列，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道下載擬南芥ERF家族[18]、香蕉MaERF9[19]和MaERF11[15]、蘋果MdERF2和MdERF3[13]的氨基酸序列。利用MEGA7軟件，采用鄰接法(neighbor-joining)和最短演化長度算法(minimal evolution)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap test設(shè)置為1 000。利用http://web.expasy.org/protparam/網(wǎng)站預(yù)測蛋白分子量及理論等電點(diǎn)。

1.3 引物和基因測序

本試驗(yàn)利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)VvERF90基因全長擴(kuò)增、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)引物和VvACO1基因的qRT-PCR引物及啟動(dòng)子擴(kuò)增、酵母單雜交、雙熒光素酶試驗(yàn)等引物序列，引物合成和基因測序均由上海生工生物技術(shù)有限公司完成，引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primers list

1.4 基因克隆及T載體構(gòu)建

利用Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒(生工，上海)和植物總RNA抽提純化試劑盒(生工，上海)提取陽光玫瑰葡萄穗軸的基因組DNA和RNA，分別用NanoDrop 2000分光光度計(jì)(Thermo Scientific，美國)和1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA和RNA的質(zhì)量。以提取的RNA為模板，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并將其稀釋至200 ng·μL-1，-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

基因全長擴(kuò)增采用KOD OneTM PCR master Mix試劑盒(東洋紡，上海)，qRT-PCR采用TaKaRa PrimeScript RT Master Mix試劑盒(TaKaRa，大連)進(jìn)行。擴(kuò)增體系為50 μL：PrimerSTAR Max 25 μL；正反引物各2 μL；cDNA 2 μL；ddH2O 19 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物用純化試劑盒(D2500-1，索萊寶，北京)進(jìn)行回收備用。

使用pClone007 Vector Kit試劑盒(TSV-007,擎科生物，北京)，將純化后的PCR產(chǎn)物連接到pClone007載體上，反應(yīng)體系為10 μL：5×Versatile Simple Vector Mix 2 μL；膠回收產(chǎn)物 2 μL；ddH2O 6 μL。室溫(20～25℃)連接5～10 min。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)中，涂板后挑取陽性克隆，進(jìn)行測序檢測。

1.5 酵母單雜交試驗(yàn)

VvERF90編碼區(qū)序列連接到pB42AD載體上，VvACO1基因啟動(dòng)子序列連接到pLaczi載體上。將以上兩種重組質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)化酵母EGY48感受態(tài)細(xì)胞，并均勻涂布于缺失氨基酸SD固體培養(yǎng)基上(SD-Trp/Ura)，28℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)2～3 d，然后挑取單克隆稀釋點(diǎn)于添加X-gal的SD-Trp/Ura培養(yǎng)基上，觀察菌落生長狀態(tài)。

1.6 雙熒光素酶(Dual-LUC)試驗(yàn)

VvERF90編碼區(qū)序列構(gòu)建到35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的pCAMBIA307-6 myc載體上，作為Effector載體；VvACO1啟動(dòng)子片段構(gòu)建到pGREEN-0800-LUC載體上，作為Reporter載體。將上述兩種質(zhì)粒同時(shí)轉(zhuǎn)入GV3101農(nóng)桿菌中，注射溫室中生長30 d煙草葉片，具體操作方法參考文獻(xiàn)[20]。熒光素酶活性分析利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒(RG027，碧云天，上海)，在Spark酶標(biāo)儀(TECAN，上海)分別測定螢火蟲熒光素酶(firefly luciferase，LUC)和海腎熒光素酶(renilla luciferase,REN)活性。

1.7 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥

將VvERF90構(gòu)建到pCambia1307-6 myc載體上，利用電擊法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101。將含有VvERF90::6 myc的農(nóng)桿菌分別接種于5 mL含利福平和卡那霉素的液體LB培養(yǎng)基中，在28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)10 h，然后將菌液轉(zhuǎn)移至50 mL含有相同抗生素的LB培養(yǎng)基28℃、200 r·min-1條件下振蕩培養(yǎng)5 h；5 500 r·min-1離心10 min，收集菌體，用10 mL重懸緩沖液(1/2 MS，5% 蔗糖，0.03% Silwet L-77)懸浮菌體，懸浮2次后，用懸浮緩沖液稀釋至OD600值為0.8。然后通過花序浸潤法侵染野生型擬南芥。收獲的種子記為T0代，播種在含有Kan抗生素的MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行初步篩選，然后提取DNA，通過PCR鑒定陽性植株。

1.8 VvERF90和AtACO3基因的定量表達(dá)分析

提取陽光玫瑰葡萄采后貯藏第0、第3、第7和第14天穗梗的RNA以及擬南芥轉(zhuǎn)基因株系和野生型株系的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，利用qRT-PCR技術(shù)檢測陽光玫瑰葡萄穗梗中VvERF90基因的表達(dá)量和擬南芥中AtACO3基因的表達(dá)量，內(nèi)參基因?yàn)閂vActin和AtGAPDH，具體方法參照文獻(xiàn)[21]。

1.9 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，利用SPSS 21.0軟件進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 葡萄VvERF90在穗梗褐變過程中的表達(dá)

為探明葡萄穗梗中乙烯合成的調(diào)控機(jī)制，對(duì)葡萄貯藏期間，穗梗中VvERF90的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90在貯藏0 d的穗梗中表達(dá)量較低，3 d時(shí)表達(dá)量升高，7和14 d時(shí)表達(dá)量逐漸降低(圖1)。

圖1 VvERF90在陽光玫瑰葡萄穗梗褐變過程中的表達(dá)Fig.1 Expression of VvERF90 during rachis browning of Shine Muscat grape

2.2 葡萄VvERF90的基因序列與蛋白特征分析

以陽光玫瑰葡萄穗梗cDNA為模板，VvERF90-F/R(表1)為引物進(jìn)行擴(kuò)增，得到VvERF90序列，測序結(jié)果顯示VvERF90基因的編碼序列(coding sequence，CDS)長度為807 bp，編碼268個(gè)氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理論等電點(diǎn)5.64。該基因含有ERF基因家族的AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域(圖2)。

注：黑色劃線部分為AP2/ERF結(jié)構(gòu)域；*表示翻譯終止。Note: Black line underlined represent AP2/ERF domain. * denote translation stopped.圖2 VvERF90基因序列信息Fig.2 Sequence information of VvERF90

2.3 葡萄VvERF90基因序列生物信息學(xué)分析

擬南芥中ERF轉(zhuǎn)錄因子家族可以分為12個(gè)亞家族，每個(gè)亞家族基因具有獨(dú)特的特征[16]。本研究選擇了擬南芥12個(gè)亞家族中的部分基因和蘋果、香蕉中與乙烯合成相關(guān)的基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)葡萄VvERF90和蘋果MdERF2、MdERF3和擬南芥AtERF101/AtERF2、AtERF100/AtERF1聚為同一分支，均聚類在第IX ERF亞家族(圖3)，VvERF90與蘋果MdERF2親緣關(guān)系較近。結(jié)果表明，VvERF90屬于ERFIX亞家族，與蘋果MdERF2之間可能存在功能上的相似性。

2.4 VvERF90對(duì)VvACO1啟動(dòng)子的調(diào)控分析

克隆含有ERF轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件的VvACO1啟動(dòng)子序列，進(jìn)行酵母單雜交試驗(yàn)，結(jié)果顯示，在加有X-gal的缺失氨基酸的培養(yǎng)基上，VvERF90和VvACO1啟動(dòng)子共同轉(zhuǎn)化酵母之后，菌斑可以生長并變藍(lán)，VvERF90與pLacZi、pB42AD與pLacZi及VvACO1啟動(dòng)子和pB42AD共同轉(zhuǎn)化酵母之后菌斑沒有變藍(lán)(圖4-A)。表明VvERF90可以結(jié)合VvACO1的啟動(dòng)子。

為進(jìn)一步驗(yàn)證VvERF90對(duì)VvACO1啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的調(diào)控作用，將VvERF90構(gòu)建至35 S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的效應(yīng)載體，VvACO1啟動(dòng)子構(gòu)建至pGreen0800-LUC報(bào)告載體載體。將VvERF90和VvACO1啟動(dòng)子共同轉(zhuǎn)化煙草葉片，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。結(jié)果顯示，與空載體相比，VvERF90與VvACO1啟動(dòng)子共同轉(zhuǎn)化煙草后，LUC相對(duì)活性明顯升高，說明VvERF90顯著提高了VvACO1啟動(dòng)子的活性，可以正調(diào)控VvACO1的表達(dá)(圖4-B)。

圖3 葡萄、擬南芥、蘋果和香蕉ERF蛋白進(jìn)化樹分析Fig.3 Phylogenetic tree of grape,Arabidopsis,apple and banana ERF proteins

2.5 VvERF90基因在擬南芥中異位表達(dá)

為了進(jìn)一步驗(yàn)證VvERF90在植物生長發(fā)育過程中的功能，本研究將VvERF90構(gòu)建至植物過表達(dá)載體pCambia1307-6 myc，轉(zhuǎn)化擬南芥。提取轉(zhuǎn)基因植株的DNA，以野生型植株為對(duì)照，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系檢測出與陽性質(zhì)粒大小一致的條帶，野生型植株中沒有條帶，表明目的基因VvERF90已導(dǎo)入擬南芥植株中(圖5-A)。與野生型擬南芥植株相比，轉(zhuǎn)基因株系在生長1周時(shí)，與野生型無明顯區(qū)別，生長至4周時(shí)，均表現(xiàn)出矮化表型(圖5-C)，對(duì)株高進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因株系高度明顯低于野生型(圖5-D)。

2.6 轉(zhuǎn)基因VvERF90對(duì)擬南芥中AtACO3表達(dá)和乙烯釋放速率的影響

為了進(jìn)一步探究VvERF90在乙烯合成中的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究測定了轉(zhuǎn)化后擬南芥乙烯釋放量，及VvERF90和乙烯合成相關(guān)基因的表達(dá)量。與野生型相比，VvERF90在轉(zhuǎn)基因株系中的表量達(dá)較高，而對(duì)照株系中未檢測到VvERF90的表達(dá)(圖6-A)。轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中，乙烯合成的關(guān)鍵基因AtACO3(葡萄VvACO1的同源基因)基因表達(dá)量均顯著升高(圖6-B)。同時(shí)，轉(zhuǎn)基因擬南芥的乙烯釋放量顯著增加，為WT的2倍(圖6-C)。這些結(jié)果進(jìn)一步說明，VvERF90可以通過調(diào)節(jié)乙烯合成關(guān)鍵基因VvACO1的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控乙烯的合成。

3 討論

在乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，乙烯響應(yīng)因子ERF是最下游的一類轉(zhuǎn)錄因子，已有研究結(jié)果顯示，其家族中多個(gè)成員，例如蘋果中的MdERF2[12-13]和MdERF3[14]，可以通過結(jié)合乙烯合成路徑關(guān)鍵基因ACS和ACO啟動(dòng)子上的DRE或GCC-box順式元件調(diào)節(jié)這兩類基因的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控植物乙烯合成過程。在葡萄基因組中有122個(gè)ERF轉(zhuǎn)錄因子[17]，本研究克隆了在陽光玫瑰葡萄采后貯藏過程中，在穗梗中表達(dá)量與乙烯釋放量呈正相關(guān)的ERF轉(zhuǎn)錄因子VvERF90。聚類分析發(fā)現(xiàn)VvERF90與已報(bào)道的蘋果MdERF2和MdERF3的親緣關(guān)系較近，且ACO1基因的表達(dá)趨勢與VvERF90相似，其啟動(dòng)子上含有ERF轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合的DRE順式元件，據(jù)此推測VvERF90可能與蘋果MdERF2和MdERF3有相似功能。通過體內(nèi)和體外試驗(yàn)驗(yàn)證檢測及轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中ACO3的表達(dá)水平和乙烯釋放量的測定分析，發(fā)現(xiàn)VvERF90可以結(jié)合VvACO1的啟動(dòng)子正調(diào)控其表達(dá)，從而增加乙烯的釋放量。

注：A:酵母單雜交試驗(yàn)分析VvERF90對(duì)VvACO1啟動(dòng)子的結(jié)合；B:雙熒光素酶試驗(yàn)分析VvERF90對(duì)VvACO1啟動(dòng)子調(diào)控的影響。**表示在P<0.01水平差異顯著。下同。Note:A: Binding analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by yeast one hybrid assay. B: Regulation analysis of VvERF90 on promoter of VvACO1 by Dual-LUC experiment. ** indicates significant difference at 0.01 level. The same as following.圖4 VvERF90對(duì)VvACO1啟動(dòng)子的調(diào)控分析Fig.4 Regulation analysis of VvERF90 on VvACO1 promoter

注：A：轉(zhuǎn)基因植株的PCR鑒定；B：正常條件下生長1周的轉(zhuǎn)基因植株；C：正常條件下生長4周的轉(zhuǎn)基因植株; D：過表達(dá)擬南芥的株高。WT：陰性對(duì)照；P：質(zhì)粒對(duì)照；#：不同轉(zhuǎn)VvERF90基因擬南芥株系； M：Marker 2 000。*表示在P<0.05水平差異顯著。下同。Note: A: Identification of transgenic plants by PCR. B: Transgenic plants growing 1 week under normal conditions. C: Transgenic plants growing 4 weeks under normal conditions. D: Height of transgenic plants of Arabidopsis. WT: Negative control. P: Plasmid control. #: Different strains of VvERF90 over-expression. M: Marker 2 000. * indicates significant difference at 0.05 level. The same as following.圖5 過表達(dá)VvERF90擬南芥陽性株系鑒定及轉(zhuǎn)基因擬南芥表型Fig.5 Identification of VvERF90 overexpression and phenotype of transgenic Arabidopsis plants

圖6 擬南芥中過表達(dá)VvERF90對(duì)AtACO3基因表達(dá)和乙烯釋放速率的影響Fig.6 Analysis of expression of AtACO3 and production of eEthylene in over-expressed VvERF90 Arabidopsis plants

植物中ERF轉(zhuǎn)錄因子可以分為12個(gè)亞家族[18]，根據(jù)聚類分析的結(jié)果，VvERF90屬于IX亞家族。已有研究結(jié)果顯示，獼猴桃ERF IX亞家族基因AdERF11～AdERF13在果實(shí)成熟過程中，隨著果實(shí)成熟表達(dá)量降低[22]，擬南芥ERF IX亞家族基因AtERF102和AtERF105參與植株的抗寒過程[23]，同時(shí)，AtERF102～AtERF105在植株的免疫過程也起著重要的作用[23-25]。AtERF1和AtORA59可能是茉莉酸(jasmonic acid,JA)和乙烯途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)基因，能提高擬南芥對(duì)腐生型病原菌的抗性[26-27]；玫瑰ERF IX亞家族基因RhERF092調(diào)控植株對(duì)乙烯的反應(yīng)[28]；橡膠樹HbERF-IXc5過表達(dá)可以促進(jìn)植株的生長和提高植株對(duì)非生物脅迫的抗性[29]；蘋果ERF IX亞家族基因MdERF2和MdERF3可以通過調(diào)控乙烯的合成調(diào)節(jié)果實(shí)的成熟進(jìn)程[13]。這些研究表明，ERF IX亞家族基因參與植物生長發(fā)育及逆境脅迫的多種生物學(xué)過程。本研究中，酵母單雜交、雙熒光素酶及VvERF90在擬南芥中過表達(dá)的試驗(yàn)結(jié)果表明，VvERF90具有調(diào)節(jié)乙烯合成的功能，與蘋果[13]和香蕉[14]中的研究結(jié)果一致，可能是葡萄貯藏期間調(diào)控穗梗中乙烯生成的關(guān)鍵基因，而VvERF90是否與擬南芥、橡膠樹及獼猴桃中的ERF IX家族基因的功能類似，參與抗逆反應(yīng)或果實(shí)的成熟過程還有待進(jìn)一步研究。VvERF90在擬南芥中過表達(dá)導(dǎo)致株高降低，與水稻[30]和小麥[31-32]中報(bào)道的ERF轉(zhuǎn)錄因子的功能類似。ERFIX亞家族基因在不同植物中功能研究的結(jié)果表明，ERF轉(zhuǎn)錄因子家族在植物生長發(fā)育過程中在功能上存在保守性。本研究結(jié)果說明VvERF90參與葡萄中乙烯的合成過程，但其在果實(shí)和采后貯藏過程中的功能還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

4 結(jié)論

本研究克隆了葡萄ERF IX亞家族VvERF90轉(zhuǎn)錄因子，長度為807 bp，編碼268個(gè)氨基酸，蛋白分子量30.0 kDa，理論等電點(diǎn)5.64；VvERF90可以結(jié)合乙烯合成關(guān)鍵基因VvACO1的啟動(dòng)子并正調(diào)控其表達(dá)，VvERF90轉(zhuǎn)基因擬南芥植株矮化，乙烯釋放量升高。綜上，VvERF90可以調(diào)節(jié)乙烯合成途徑基因VvACO1的表達(dá)。