任建委，任明輝

（西藏大學醫(yī)學院，西藏拉薩 850000）

放線菌是一類能夠產(chǎn)生抗生素、抗腫瘤活性物質(zhì)、免疫調(diào)節(jié)劑和酶抑制劑等多種活性物質(zhì)，具有較高經(jīng)濟價值的一類原核細胞微生物[1-2]。目前，國內(nèi)外研究人員對放線菌的開發(fā)與研究主要集中在放線菌的極端生境[3-5]。我國青藏高原地區(qū)被稱為“世界屋脊”“世界第三極”，具有海拔高、空氣稀薄、太陽輻射強等特點，放線菌資源比較豐富[6]，而且還存在一些未知的放線菌，非常值得展開青藏高原放線菌的研究。本研究對采自青藏高原拉薩地區(qū)羅布林卡公園的3 份土壤樣品進行分離，探討了土壤預(yù)處理不同溫度對土壤放線菌分離的影響。

1 放線菌分離影響因素分析

放線菌分離過程中需要注意的問題是，在放線菌分離過程中既要保證抑制雜菌（細菌、真菌等）的生長，同時又不影響放線菌的生長。為了提高放線菌的分離率，許多學者對多種相關(guān)因素進行研究，包括土壤預(yù)處理、培養(yǎng)基成分、雜菌抑制劑等。

1.1 土壤預(yù)處理

土壤預(yù)處理是影響放線菌分離效率至關(guān)重要的一個步驟，適當?shù)耐寥李A(yù)處理可以激活放線菌孢子的萌發(fā)及提高放線菌的檢出率。常用的土壤預(yù)處理方法包括風干與加熱處理、超聲波處理和制作土壤稀釋液時的試劑處理等。何建清等[7]以土樣風干，120℃干熱1h，制作土壤稀釋液后又加入0.05%SDS，40℃懸浮0.5h后涂布分離為土壤預(yù)處理方式得到放線菌。盛海彥等[8]用控制變量法對土壤預(yù)處理的條件（溫度、SDS、酵母膏）進行了探討，發(fā)現(xiàn)在120℃處理1h、土壤懸浮液中加入SDS 0.5g/kg、6%酵母膏并于40℃常溫振蕩0.5h的條件下分離的放線菌數(shù)量最多，并有效抑制了細菌的生長。田華等[9]將樣品自然風干0、2、4、6、8d，發(fā)現(xiàn)將土壤樣品風干放置6d 前的時間里，分離的放線菌數(shù)目隨風干天數(shù)增加，在一定程度上說明通過適當風干時間，有利于土壤中放線菌的活化；將土壤稀釋液分別進行40℃、50℃、60℃、70℃加熱處理20min，發(fā)現(xiàn)以50℃為分界點，放線菌的數(shù)目也會隨著溫度升高而增加或減少，在某種程度上說明，適當?shù)臏囟忍幚碛欣诜啪€菌的活化。毛寧等[10]對采集的土壤樣品分別進行0s、20s、50s、100s 的超聲波處理，發(fā)現(xiàn)放線菌的種類和數(shù)量均不同，說明通過適當時間的超聲波處理，有利于增加需分離的土壤放線菌的數(shù)量和種類。閆建芳等[11]分別用不同濃度的SDS 溶液（0.01%、0.05%、0.10%、0.20%）稀釋風干土壤樣品涂布于高氏培養(yǎng)基后觀察放線菌數(shù)量，發(fā)現(xiàn)0.05%SDS 溶液稀釋的土壤樣品能有效分離土壤中黃瓜枯萎病菌的拮抗放線菌。茹祥等[12]采用了3 種預(yù)處理方法，其中放線菌出菌率最高的方法是向土壤稀釋液中加入1‰螯合樹脂—膽酸鈉溶液并用50W 超聲波水浴60s，得到稀釋液；另取土樣以磷酸鹽緩沖液為稀釋液，振蕩15min 后，將兩者混合，進行涂布后培養(yǎng)得到放線菌的菌落數(shù)是最多的。來航線等[13]分離鹽堿土中的放線菌時，用20g/kg 腐殖酸溶液浸泡土壤，于40℃下振蕩20 min，結(jié)果可提高放線菌的出菌率并抑制了雜菌生長。

1.2 培養(yǎng)基成分

培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對微生物生長至關(guān)重要。一種培養(yǎng)基中所含營養(yǎng)物質(zhì)不可能滿足所有放線菌的生長要求，所以試驗者可根據(jù)目的改變培養(yǎng)基的成分，從而分離出相關(guān)目的放線菌菌株。閆建芳等[11]利用7 種培養(yǎng)基對瓜類枯萎病菌拮抗放線菌進行分離，發(fā)現(xiàn)高氏一號培養(yǎng)基、淀粉瓊脂培養(yǎng)基和HVG 培養(yǎng)基對拮抗放線菌的分離效果較好，聯(lián)合培養(yǎng)能夠盡可能多地分離放線菌。茹祥等[12]利用高氏一號培養(yǎng)基、BN 培養(yǎng)基、葡萄糖-天冬門素培養(yǎng)基和腐殖酸培養(yǎng)基，結(jié)果表明，BN 培養(yǎng)基在分離放線菌的種類和數(shù)量上比其他3種培養(yǎng)基的分離效果好。周娟等[14]采用9 種培養(yǎng)基對分離的土樣進行放線菌分離，LNMS 培養(yǎng)基培養(yǎng)的放線菌數(shù)量最多，燕麥瓊脂培養(yǎng)基分離種類最多，但由于培養(yǎng)基成分種類和比例不同，分離出放線菌數(shù)量和種類是不同的。李菲等[15]從紅樹林土壤中共分離到444株放線菌，其中3 株放線菌為潛在新種。在酶活性方面，至少有1 種酶活性的放線菌共56 株，2 種酶活性的放線菌共31 株，蘊藏著新的且功能酶活性顯著，具有較大的挖掘潛力。

1.3 雜菌抑制劑

雜菌抑制劑在分離放線菌過程中，主要作用是排除雜菌如細菌、真菌及其他非目的放線菌等微生物，不影響目的放線菌的分離。在分離放線菌時，向培養(yǎng)基中加入一定量的抑制劑，會抑制細菌和真菌的數(shù)量，減少放線菌分離時兩者的干擾，進而有效提高放線菌檢出率。因此，有效抑制細菌和真菌的生長是放線菌分離雜菌抑制方面需要解決的重要問題。閆建芳等[11]以重鉻酸鉀（K2CrO2）、放線菌酮、鏈霉素、青霉素和氟哌酸等作為雜菌抑制劑，發(fā)現(xiàn)1μg/mL 青霉素、40μg/mL氟哌酸、75μg/mL K2CrO2適合作為土壤放線菌分離的雜菌抑制劑，其中以1μg/mL 青霉素效果最明顯。司美茹等[16]在培養(yǎng)基中加入化學抑制劑（75μg/mL K2CrO2+2μg/mL 青霉素），培養(yǎng)基中細菌數(shù)量明顯減少，但不影響放線菌種類和數(shù)量；若化學抑制劑和土樣加熱雙重處理，細菌數(shù)量比單純使用分離方法明顯減少，放線菌的數(shù)量和種類比單純使用化學抑制劑明顯增加。安德榮等[17]向高氏一號培養(yǎng)基中加入4 種（放線菌酮、制霉素、多菌靈、K2CrO2）化學抑制劑，發(fā)現(xiàn)放線菌酮和K2CrO2是理想的放線菌分離抑制劑，既可以作為土壤中細菌和真菌的抑制劑，又不會影響放線菌的正常生長。

2 放線菌分離的材料與方法

2.1 試驗材料

采用五點取樣法取土壤樣品3 份，樣品來源于羅布林卡公園5～20cm 深土層。將3 份土壤分別過2 層醫(yī)用紗布。

2.2 土壤預(yù)處理

將土壤樣品分為2 份，一份做常溫風干處理；一份做65℃烘干處理。

2.3 培養(yǎng)基使用

本試驗分離放線菌采用2 種培養(yǎng)基，即高氏一號瓊脂培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。高氏一號瓊脂培養(yǎng)基成品、PDA 成品，按照說明書配制培養(yǎng)基，121℃滅菌20min。

2.4 土壤稀釋液制備及純種分離

稱取1g 土壤加入到10mL 滅菌的無菌水中，震蕩10min，獲得土壤懸液為10%濃度的土壤稀釋液。向裝有9mL 無菌水的試管里加入上述稀釋液1mL，需用移液管吸取，搖勻，制成1%濃度的土壤稀釋液。按照1∶10 的比例，依次稀釋至0.1%濃度梯度的土壤稀釋液。整個稀釋過程都在超凈工作臺中進行。在土壤稀釋過程中，發(fā)現(xiàn)即便土壤經(jīng)過過篩后，試管下仍沉積很多類似于沙子的不溶物。因曾做過預(yù)試驗，發(fā)現(xiàn)至0.1%土壤稀釋濃度已經(jīng)很少有放線菌存在。所以本試驗只稀釋到0.1%土壤稀釋度。

完成等濃度梯度稀釋土壤稀釋液的制備之后，配制高氏一號培養(yǎng)基，121℃15 min，待其冷卻至55～60℃時，倒平板。待凝固以后，用移液槍分別吸取等量的濃度為10%、1%、0.1%的土壤稀釋液于無菌平板上，最后用燒灼后的無菌玻璃涂布器分別均勻涂布，并且在平板上做標記。靜置20min 左右后將平板倒置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～5d。每個稀釋梯度重復(fù)2 次。

2.5 放線菌分離結(jié)果

以65℃溫度處理、3 號土壤為例，采用土壤濃度稀釋法，用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌，分離結(jié)果如圖1所示。從圖中可以看出，在培養(yǎng)皿中長有細菌菌落，在其他的培養(yǎng)皿中還長有真菌，對放線菌菌落大概數(shù)目做初步統(tǒng)計見表1。

圖1 經(jīng)65℃預(yù)處理的3 號土壤

表1 放線菌菌落的數(shù)目約數(shù) 單位：個/mL

2.6 放線菌培養(yǎng)特性及染色

圖3 部分放線菌培養(yǎng)插片法

圖4 部分放線菌插片法后的染色情況

放線菌制片染色方法包括印片法和插片法，前者主要觀察放線菌孢子絲的形態(tài)、孢子的排列及其形狀等，但形態(tài)特征可能有所改變（使用的是石炭酸復(fù)紅染液）；后者可觀察到放線菌自然生長狀態(tài)下的特征和不同生長期的形態(tài)，也是放線菌染色常用的方法。本次放線菌初步培養(yǎng)鑒定使用的是插片法，具體步驟如下：①接種。采用無菌接種法接種挑取放線菌，在高氏一號培養(yǎng)基約一半面積上密集劃線接種。②插片。無菌操作法用鑷子取無菌蓋玻片，在劃線接種區(qū)內(nèi)45°角插入平板瓊脂培養(yǎng)基內(nèi)，另一半未劃線的區(qū)域也以同樣的方式插入數(shù)塊蓋玻片。③培養(yǎng)。平板倒置28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d。④鏡檢。取蓋玻片，用紙擦去背面培養(yǎng)物，菌面向上放載玻片上，滴0.1%堿性美蘭染液。

3 討論

采樣時，用五點取樣法在同一地方采集3 份土壤，不同份數(shù)土壤中，統(tǒng)計放線菌菌落數(shù)的大概數(shù)目并不相同，并且有些形成的菌落顏色也不相同，這可能是在取土壤樣品時，附近生長的植物不同。

溶解土壤時，發(fā)現(xiàn)土壤的沙化，即便用2 層醫(yī)用紗布篩過后，仍有大部分土壤無法溶解并沉在試管底部，這樣每克土壤樣品中含有放線菌的數(shù)量減少，所以用稀釋涂布平板法培養(yǎng)放線菌時，土壤稀釋濃度（10%、1%、0.1%）與普通土壤稀釋度（0.1%、0.01%、0.001%）不同。

使用高氏一號培養(yǎng)基培養(yǎng)放線菌時，培養(yǎng)基中會有細菌菌落和霉菌菌落，需要添加真菌抑制劑和細菌抑制劑來抑制除放線菌以外的其他雜菌的生長。