三種常見(jiàn)殺菌劑對(duì)白僵菌純化以及生產(chǎn)中作用研究

王雪+馬軍+蘭瑩+趙東鵬+張躍華+趙晨晨

摘 要：為篩選出適合白僵菌生產(chǎn)中使用的高效殺菌劑。以3種常見(jiàn)的殺菌劑作為試劑，采用抑菌圈法和生長(zhǎng)速率法，研究3種殺菌劑對(duì)白僵菌生產(chǎn)中常見(jiàn)雜菌的抑制效果及其對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響。結(jié)果表明：在最高稀釋濃度條件下，脫氫乙酸鈉抑制3種雜菌效果最好的同時(shí)，對(duì)白僵菌的抑制率也為最大。二氯異氰尿酸鈉對(duì)大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑制效果優(yōu)于富馬酸二甲酯，但對(duì)枯草芽胞桿菌的抑制效果較差，且對(duì)白僵菌影響較小，可作為白僵菌殺菌劑。

關(guān)鍵詞：白僵菌；殺菌劑；雜菌；抑制試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S482.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI：10.11974/nyyjs.20170532001

白僵菌屬蟲(chóng)草菌科（Cordycip-itaceae），蟲(chóng)草屬（Cordyceps）[1]，是一類(lèi)重要的昆蟲(chóng)致病真菌，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)林害蟲(chóng)防治[2]。其菌落初期多呈現(xiàn)為白色，而后變?yōu)榈S色或淡紅色，背面無(wú)色、淡黃至粉紅色[3]。在分生孢子?；蚓z上聚合成在低倍鏡下即可看到的球形、卵形的孢子頭[4]。在白僵菌生物農(nóng)藥與傳統(tǒng)化學(xué)農(nóng)藥相比中，白僵菌生物農(nóng)藥具有不產(chǎn)生抗性、專(zhuān)一性強(qiáng)無(wú)化學(xué)農(nóng)藥殘留、和使用安全等無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)[5]。但因生產(chǎn)由于大量細(xì)菌及放線(xiàn)菌，如大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus 金葡菌）、枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）等與白僵菌的生長(zhǎng)條件相近，常導(dǎo)致白僵菌生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)重污染，影響生產(chǎn)效率。在白僵菌生產(chǎn)過(guò)程中，需要即能有效分離又不抑制白僵菌生長(zhǎng)的分離培養(yǎng)基，并能保證分離和培養(yǎng)過(guò)程中白僵菌的生長(zhǎng)不受非目標(biāo)菌的影響。該研究通過(guò)抑菌圈與生長(zhǎng)速率法，測(cè)試了3種常見(jiàn)殺菌劑對(duì)白僵菌生產(chǎn)中常見(jiàn)雜菌大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌的抑制效果，同時(shí)結(jié)合3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲的影響結(jié)果，篩選出抑制效果較好的藥物，以期為解決白僵菌生產(chǎn)中的實(shí)際問(wèn)題提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試藥劑

脫氫乙酸鈉（DHA-S）、富馬酸二甲酯（DMF）、二氯異氰尿酸鈉（SDIC）。

1.1.2 供試菌株

卵孢白僵菌（鹽城市神微生物菌種科技有限公司提供）。

1.1.3 供試試劑

依據(jù)藥劑推薦的最佳濃度范圍進(jìn)行不同濃度梯度的設(shè)置，調(diào)整至3種藥劑的稀釋倍數(shù)相同。DHA-S、DMF、SDIC配比稀釋濃度均分別為0.2mg/mL、0.4 mg/mL、

0.6 mg/mL、0.8 mg/mL、1.0 mg/mL、1.2 mg/mL。

1.1.4 培養(yǎng)基的配方

PDA培養(yǎng)基瓊脂20.0g/L、馬鈴薯200g/L、葡萄糖20.0g/L；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3.0g/L、蛋白胨5.0g/L、氯化鈉10.0 g/L。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 制備卵孢白僵菌懸液

稱(chēng)取0.5g卵孢白僵菌粉劑，在無(wú)菌工作條件下，放入裝有100mL無(wú)菌水的錐形瓶中，封口并震蕩3～5min，使其均勻分散，制成菌懸液。

1.2.2 白僵菌的分離與純化

無(wú)菌移液管移取0.1mL制好的白僵菌菌懸液，取無(wú)菌三角玻棒，把上述菌懸液在PDA平板表面涂抹均勻。將制備的帶菌平板倒置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)2d。無(wú)菌條件下取培養(yǎng)的菌株，用接種環(huán)挑取少量菌絲于PDA培養(yǎng)皿，于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2d。在無(wú)菌工作條件下，接種于PDA試管斜面培養(yǎng)基，置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)2d。后置于4℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 抑菌圈法測(cè)3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的3種斜面雜菌菌株，在無(wú)菌條件下，分別加入20mL無(wú)菌水，充分振搖稀釋后分別置于已滅菌的50mL三角瓶?jī)?nèi)，得到3種菌懸液，涂布培養(yǎng)，用滅菌鑷子夾取直徑為6mm消毒濾紙片投入不同藥液中浸藥3min，對(duì)照組將濾紙片放于無(wú)菌水中浸泡3min，每組3次重復(fù)；然后將帶不同濃度藥的濾紙片分別放置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)皿中央，并做好標(biāo)記。置于28℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24h后采用十字劃線(xiàn)法測(cè)量抑制圈直徑并記錄。

1.2.4 生長(zhǎng)速率法測(cè)3種殺菌劑對(duì)白僵菌的抑制效果

取4℃冰箱保存的斜面白僵菌菌株，在無(wú)菌工作條件下，轉(zhuǎn)接到含有不同濃度梯度的3種殺菌劑的固體培養(yǎng)基上。以不含藥劑的PDA培養(yǎng)皿作為對(duì)照，每組3次重復(fù)；觀察菌絲生長(zhǎng)情況，采用十字交叉法進(jìn)行各組菌絲直徑的確定。按以下公式計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[6]：

（1）

2 結(jié)果分析

2.1 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制效果

對(duì)白僵菌有害雜菌大腸桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)大腸桿菌抑制效果最佳的為DHA-S，在其測(cè)試濃度范圍內(nèi)，6組處理濃度的效果都很明顯，抑菌圈直徑范圍在21.7～42.0mm內(nèi)；SDIC的效果次之，抑菌圈直徑變化范圍為13.1～34.2mm；而DMF效果最低，抑菌圈直徑在7.57～ 17.8mm范圍內(nèi)。且不同濃度藥品間差異較大（見(jiàn)圖1）。

2.2 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌金黃色葡萄球菌的抑制效果

對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：DHA-S對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果最好，抑菌圈直徑范圍為27.2～41.6mm；DMF抑菌圈直徑最小為17.0 mm，1.0 mg/mL濃度的抑菌圈直徑為29.9mm，而在1.2mg/mL濃度的抑菌圈直徑為24.5mm，抑制效果與1.0mg/mL濃度液比抑制效果較差；而SDIC對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制效果較差，抑菌圈直徑范圍在8.5～22.7mm內(nèi)。每種殺菌劑6組處理濃度的抑菌圈直徑形成較大差異（見(jiàn)圖2）。

2.3 3種殺菌劑對(duì)白僵菌有害雜菌枯草芽孢桿菌的抑制效果

對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制試驗(yàn)結(jié)果表明：3種殺菌劑的6組處理濃度的效果都很明顯，其中對(duì)枯草芽孢桿菌抑制效果最佳的為DHA-S，其抑菌圈直徑范圍為21.7～ 42.5mm；SDIC效果次之，抑菌圈直徑范圍在7.9～20.3mm，且0.6mg/ml濃度與0.8mg/mL濃度形成較大差異；而DMF效果最低，抑菌圈直徑范圍為7.6～16.2mm（見(jiàn)圖3）。

2.4 3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果

對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明：3種殺菌劑對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)有明顯的抑制，就其抑制效果而言，在1.2mg/ml濃度條件下，DHA-S對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最強(qiáng)，高到100%，DMF對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)的抑制效果最弱為53.56%，SDIC可達(dá)到62.45%（見(jiàn)圖4）。

圖4 對(duì)白僵菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率

3 結(jié)論分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DHA-S抑制效果最好，但DHA-S對(duì)白僵菌菌落的生長(zhǎng)有較大的影響，不符合在生產(chǎn)中即能抑制雜菌生長(zhǎng)又對(duì)白僵菌菌絲生長(zhǎng)無(wú)抑制效果或抑制效果較弱的要求。SDIC和DMF對(duì)有害雜菌有一定的抑制作用，且不會(huì)對(duì)白僵菌生長(zhǎng)產(chǎn)生不良影響，都可以作為白僵菌生產(chǎn)中的抑菌劑。同時(shí)SDIC和DMF對(duì)雜菌的抑制效果不同，因此可以根據(jù)生產(chǎn)中雜菌污染情況選擇性地使用符合要求的藥劑。

參考文獻(xiàn)

[1]呂思行，劉吉平，湯歷，等.兩廣地區(qū)家蠶白僵菌的SSRs遺傳多樣性[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào)， 2012，55（10）.

[2]Feng MG. Production， formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control： current status[J]. Biocontrol Science & Technology， 1994， 4（1）：3-34.

[3]許壽濤.殺蚜球孢白僵菌孢子乳懸劑的改進(jìn)、中試及田間應(yīng)用效果評(píng)價(jià)[D]. 浙江大學(xué)， 2002.

[4]赫英偉.白僵菌的研究概況[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2010（4）：

145-147.

[5]張英財(cái)，農(nóng)向群，張澤華，等. 18種化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌相容性研究[J].中國(guó)生物防治學(xué)報(bào).2012，28（2）.

[6]楊華，徐金柱，秦長(zhǎng)生，等.3種真菌抗生素對(duì)綠僵菌和6種非目標(biāo)真菌的生長(zhǎng)影響分析[J].廣東林業(yè)科技， 2014，30（6）：34-39.