甘薯鄭紅23號高效脫毒技術探討

胡琳琳，王雁楠，卞倩倩，尹雨萌，陳金金，楊曉平，楊育峰

（河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所，河南 鄭州 450002）

甘薯（Ipomoea batatas（L.）Lam）是我國主要的糧食作物之一，同時也是重要的工業(yè)原料及飼料作物[1-5]，以適應性廣、營養(yǎng)價值高、產(chǎn)量高而著稱[6-7]。病毒病是甘薯上一類比較嚴重的病害，對甘薯的品質(zhì)與產(chǎn)量造成嚴重的危害，導致甘薯種性減退、品質(zhì)產(chǎn)量降低、商品率降低，嚴重者導致絕收[8-15]。脫毒可以使甘薯恢復其原有的良種特性。目前既缺少抗病毒病的甘薯品種，又沒有防治甘薯病毒病的特效藥劑，因此甘薯脫毒是防范甘薯病毒病、提高甘薯產(chǎn)量最有效的方法之一[16-17]。鄭紅23號是由河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所選育的鮮食兼淀粉型品種，該品種紫紅皮白肉，抗病耐逆，綜合表現(xiàn)優(yōu)良，2013年和2019年分別通過河南省農(nóng)作物品種鑒定和國家品種登記。自20世紀60年代美國學者NIELSEN首次報道利用莖尖分生組織培育技術獲得甘薯脫毒植株以來，研究人員相繼選取不同的甘薯品種對莖尖進行甘薯脫毒培養(yǎng)研究[18-24]，但植株再生效果存在較大差異且大部分已報道的再生率偏低。

河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所甘薯研究團隊前期經(jīng)過多年的研究與實踐，從多種生長激素中篩選出NAA、6-BA等2種生長激素進行甘薯莖尖分生組織再生研究，且發(fā)現(xiàn)當NAA的質(zhì)量濃度為0.1 mg/L時，較適合甘薯莖尖分生組織的再生。在鄭紅22的脫毒研究中，先后設計了13種添加不同NAA、6-BA質(zhì)量濃度的MS培養(yǎng)基對鄭紅22進行培養(yǎng)，所得植株最高再生率和脫毒率分別為54.58%、8.77%[9]，甘薯莖尖再生率和脫毒率偏低，還有待進一步提高。由于不同甘薯品種的基因型不同，故采用不同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方法獲得的植株再生率和脫毒率也不同。

在前期研究基礎上，本研究以鄭紅23號為試驗材料，以期建立適合鄭紅23號的高效穩(wěn)定的植株再生及脫毒技術體系，從而為生產(chǎn)更多高質(zhì)量的鄭紅23號脫毒苗提供理論依據(jù)和技術支撐。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試甘薯品種為鄭紅23號。

1.2 試驗方法

試驗于2020—2021年在河南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所進行。

1.2.1 莖尖再生取鄭紅23號生長旺盛（試管苗高度約7 cm）、干凈無菌的試管苗頂芽1～2 cm，在40倍解剖顯微鏡下剝?nèi)?.2～0.4 mm的莖尖分生組織（帶1～2片葉原基），放在含有不同質(zhì)量濃度6-BA（6-芐氨基嘌呤）及NAA（萘乙酸）的MS培養(yǎng)基（pH值為5.8）上，于27℃，3 000 lx的光照下，每日培養(yǎng)13 h，從而誘導芽的分化。

試驗設置7個處理，即空白對照（MS培養(yǎng)基），MS+0.1 mg/L NAA+1 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+2 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+3 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+4 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+5 mg/L 6-BA，MS+0.1 mg/L NAA+6 mg/L 6-BA，每個處理重復3次，每個重復30個莖尖，共計630個。觀察莖尖膨大和再生出芽情況，從而對比分析莖尖在不同分化培養(yǎng)基上的再生效果。

1.2.2 再生植株脫毒檢測將各處理再生植株轉到MS培養(yǎng)基上，進行繼代培養(yǎng)，取繼代培養(yǎng)30 d內(nèi)的植株葉片，液氮速凍。用CTAB法提取樣品DNA，參照TRIeasy?Total Extraction Reagent（購自上海翊圣生物科技有限公司）進行植物總RNA的提取，參照TransScript?One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反轉錄試劑盒（購自北京全式金生物技術有限公司）反轉錄合成cDNA。采用PCR檢測方法依次對甘薯卷葉病毒（Sweet potato leaf curl virus，SPLCV）、甘薯褪綠矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus，SPCSV）、甘薯羽狀斑駁病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）、甘薯潛隱病毒（Sweet potato latent virus，SPLV）和甘薯病毒G（Sweet potato virus G，SPVG）5種重要病毒進行檢測（特異性引物如表1所示）。

表1 PCR擴增的特異性引物Tab.1 Specific primers for PCR amplification

使用的PCR檢測反應體系如下：取樣本cDNA 1μL，病毒的上、下游引物各0.5μL，Mix 12.5μL，用ddH2O補足至總體積25μL，混勻后離心。反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性30 s，54～56℃退火30 s，72℃延伸1 min，35次循環(huán)；72℃終延伸10 min，4℃保存。反應進行完后，取8μL的PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓150 V，電泳后將膠塊放置在凝膠成像儀上觀察拍照。將目標條帶切膠，參照膠回收試劑盒說明書進行回收純化，然后與pMD19-Tvector連接，將連接產(chǎn)物轉化至大腸桿菌中，之后挑取單克隆，進行菌液PCR，反應體系及條件同上述PCR檢測。反應結束后，取8μL的PCR擴增產(chǎn)物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電壓150 V，電泳后將膠塊放置在凝膠成像儀上觀察拍照，將呈陽性的菌液測 序，測序結果經(jīng)NCBI BLAST比對分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel對愈傷組織誘導率、再生率和脫毒率進行統(tǒng)計，采用SPSS 19.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同激素質(zhì)量濃度配比對鄭紅23號莖尖苗再生的影響

2.1.1 不同激素濃度配比對愈傷組織誘導率的影響將鄭紅23號莖尖分生組織培養(yǎng)在含有不同質(zhì)量濃度配比的NAA和6-BA的MS固體培養(yǎng)基上，7 d左右莖尖開始膨大變綠（圖1-A）。在莖尖分生組織的植株再生中（表2），3次重復共培養(yǎng)630個莖尖，各處理均獲得了較高的平均愈傷誘導率。其中，在添加0.1 mg/L NAA、6 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上，莖尖分生組織獲得了最高的平均愈傷組織誘導率，達100%；在添加0.1 mg/L NAA、1 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上平均愈傷誘導率最低，為94.44%。

圖1 鄭紅23號莖尖植株再生Fig.1 Shoot apical plant regeneration of Zhenghong 23

2.1.2 不同激素質(zhì)量濃度配比對植株再生率的影響在鄭紅23號莖尖分生組織的植株再生中，50 d左右莖尖分生組織開始陸續(xù)再生出植株（圖1-B、C），結果顯示，培養(yǎng)在分別添加0.1 mg/L NAA、4 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上的莖尖分生組織，其植株再生率較其他處理最高，為97.78%（表2）。培養(yǎng)在不同處理的分化培養(yǎng)基上的鄭紅23號莖尖分生組織，均有較高的植株再生率，且差異不顯著，說明添加這2種激素及不同質(zhì)量濃度配比的分化培養(yǎng)基較適合鄭紅23號莖尖分生組織的植株再生。之后將再生植株轉到MS基本培養(yǎng)基上，所有再生植株都發(fā)育成完整植株（圖1-D）。

表2 不同分化培養(yǎng)基對鄭紅23號莖尖植株再生的影響Tab.2 Effect of different differentiation mediums on shoot apical plant regeneration of Zhenghong 23

2.2 鄭紅23號再生植株脫毒檢測結果

2.2.1 PCR條帶檢 測取8μL的PCR擴增產(chǎn) 物在1.0%瓊脂糖凝膠中進行電泳，電泳后將膠塊放置在凝膠成像儀上觀察拍照，各種病毒（SPVG在再生植株中未檢出）所顯示目標條帶在2 000 bp DNA Maker標準下與預期條帶大小一致（圖2）。

圖2 SPLCV、SPCSV、SPFMV、SPLV、SPVG的PCR檢測Fig.2 PCR detection of SPLCV，SPCSV，SPFMV，SPLV，and SPVG

之后的測序結果表明，擴增片段大小與預期的條帶一致。所得序列與GenBank中其他分離的核苷酸序列同源性達99%以上，表明所得結果可靠。

2.2.2 再生植株平均脫毒率 在鄭紅23號莖尖分生組織的植株再生中，用PCR方法對鄭紅23號再生苗依次檢測甘薯卷葉病毒、甘薯褪綠矮化病毒、甘薯羽狀斑駁病毒、甘薯潛隱病毒、甘薯病毒G，各處理的平均脫毒率較低，且差異顯著，在添加0.1 mg/L NAA和4 mg/L 6-BA的分化培養(yǎng)基上，莖尖再生苗得到了最高的脫毒率，為13.60%（表3）。

表3 不同分化培養(yǎng)基對鄭紅23號再生苗5種病毒脫毒率的影響Tab.3 Effect of different differentiation mediums on virus-free rate of 5 viruses in regenerated seedlings of Zhenghong23

3 結論與討論

有研究表明，甘薯莖尖分生組織的再生效果受NAA、6-BA等激素的影響較大[18]。董芳等[19]比較不同6-BA和NAA組合下莖尖成苗率，湘薯15號和湘薯19號的最佳植物激素配比分別為MS+3.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA和MS+2.0 mg/L 6-BA+0.67 mg/L NAA，成苗率分別為40.7%和57.8%。阮先樂等[20]通過對甘薯品種豫薯12的莖尖分生組織的研究，發(fā)現(xiàn)誘導豫薯12再生成苗的最佳培養(yǎng)基是MS+0.3 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA，此時莖尖萌芽率為80.4%，成苗率為72.3%。許泳清等[21]研究發(fā)現(xiàn)，福薯604莖尖組培成苗的最佳培養(yǎng)基為MS+1.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3，其莖尖組培苗萌芽率為93.3%，成苗率為50.0%。邱鵬飛等[22]以煙薯26號和煙紫薯3號為試驗材料，發(fā)現(xiàn)煙薯26號和煙紫薯3號較適宜的莖尖誘導培養(yǎng)基為MS+1.5 mg/L NAA，植株再生率分別為88%和80%。閆明明等[23]研究發(fā)現(xiàn)，脫毒甘薯一號在激素配比為MS+0.1 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IAA時，脫毒試管苗的繁殖系數(shù)最高。譚冠寧等[24]以桂紫薯12號甘薯為試驗材料，發(fā)現(xiàn)在MS+1.0 mg/L 6-BA+0.01 mg/L NAA+0.1 mg/L GA3的培養(yǎng)基中，叢芽增殖率最高，叢芽誘導率為44.4%。這說明莖尖苗在不同激素濃度配比和不同的甘薯種類下，再生率及生長速度存在較大的差異。而通過與前人研究的對比發(fā)現(xiàn)，本研究中鄭紅23號莖尖苗再生率比目前已報道的大部分研究中的甘薯莖尖苗再生率高。表明本研究設計的激素質(zhì)量濃度配比較適合甘薯莖尖再生，且本研究3次重復所培養(yǎng)莖尖總數(shù)為630個，群體較大，所得結果比較可靠。

目前，莖尖分生組織培養(yǎng)是獲取脫毒苗的主要手段，但在脫毒苗培育過程中，莖尖再生苗不一定是脫毒苗，需要對再生植株進行快速和準確的檢測，因此，研究快速、確切地檢測病毒的高效檢測技術具有關鍵的作用。本研究用PCR方法檢測了各處理再生植株的脫毒情況，各處理之間莖尖再生苗脫毒率存在差異。莖尖再生苗在激素配比為0.1 mg/L NAA與4 mg/L 6-BA的MS培養(yǎng)基處理中進行培養(yǎng)時，對5種病毒有最高的脫毒率，為13.60%，脫毒率偏低，這可能與所培養(yǎng)的莖尖大小、形態(tài)等有關；且不同的檢測方法、檢測儀器的靈敏度等也會造成脫毒率的不同。朱紅彩等[25]研究發(fā)現(xiàn)，剝離的莖尖越小,所帶病毒越少，獲得無病毒植株的概率就越大，但誘導成活的難度大。李軍等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物熱處理結合莖尖培養(yǎng)脫毒要比單純莖尖培養(yǎng)脫毒效果好。有研究報道，在莖尖分生組織中，病毒的復制會被高濃度的生長激素所抑制[27]，外源激素如何抑制病毒的復制還有待進一步研究。目前，在植物脫毒技術方面，已經(jīng)從莖尖培養(yǎng)、熱處理脫毒、病毒抑制劑處理等單一脫毒方法向多種方法結合使用發(fā)展。在今后的研究中，將會結合其他脫毒方法，逐步提高鄭紅23號再生植株的脫毒率，研究更加適宜鄭紅23號的高效脫毒技術，為鄭紅23號及其他甘薯品種的高效脫毒及生產(chǎn)應用等提供重要的理論與實踐依據(jù)。

本研究通過設計不同質(zhì)量濃度的NAA及6-BA配比，探討適宜鄭紅23號的莖尖分生組織高效愈傷組織誘導和植株再生體系，并通過PCR方法對再生苗進行病毒病檢測，結果表明，在NAA和6-BA激素處理下培養(yǎng)的鄭紅23號再生率均高于90%，且極顯著高于空白對照，但各處理間的差異不顯著。其中MS+0.1 mg/L NAA+4.0 mg/L 6-BA再生率最高，為97.78%，且該處理下脫毒率也最高，為13.6%。此外，MS+0.1 mg/L NAA+6.0 mg/L 6-BA的愈傷組織誘導率高達100%，該處理下的再生率和脫毒率分別為91.11%和11.79%。本研究旨在建立適宜甘薯鄭紅23號的高效脫毒技術體系，為鄭紅23號的健康脫毒種薯種苗繁育及綠色高效生產(chǎn)提供科學的技術支撐，但本研究中脫毒率還有待進一步提高。