肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋對乙型肝炎肝硬化患者門靜脈血栓發(fā)生的影響

劉 立， 李俊義， 劉春云， 常麗仙， 張麗華， 黃紅麗， 羅 煜， 高建鵬

昆明市第三人民醫(yī)院 云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學中心， 昆明 650041

乙型肝炎肝硬化是慢性乙型肝炎發(fā)展的較嚴重階段，其并發(fā)癥較多，且抗病毒治療效果仍不令人滿意，患者預后較差，嚴重者進展至肝癌或死亡[1]。據(jù)調(diào)查，2009年—2016年由肝硬化造成的年病死率從10.5%升高至20.0%[2]。隨著我國乙型肝炎疫苗接種的推廣，慢性乙型肝炎的發(fā)病率逐年下降，但部分地區(qū)感染率仍較高，且若治療不及時或不規(guī)范，極易誘導肝纖維組織增生和肝硬化的形成[3]。近年來研究[4-5]發(fā)現(xiàn)肝硬化患者凝血譜紊亂，表現(xiàn)為抗凝蛋白減少，促凝因子增加，抗凝與止血均失衡，可能同時合并門靜脈高壓出血和門靜脈血栓(portal vein thrombosis, PVT)，出血及血栓形成的閾值均降低。肝硬化患者的門靜脈血流速度減慢[6-10]、血管損傷[11]、炎癥[12-14]、D-二聚體(D-Dimer, D-D)水平升高[15]等是PVT的高危因素。而抗凝治療對PVT效果很差，且存在出血的風險。部分中藥的有效成分具有抗炎、抗氧化應激、調(diào)節(jié)免疫、抗纖維化、降低門靜脈壓力等作用，具有多途徑、多靶點且不良反應少等優(yōu)點。本研究觀察肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋對乙型肝炎肝硬化患者PVT發(fā)生率的影響，為臨床提供必要的依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月1日—2020年12月31日于本院就診及住院的乙型肝炎肝硬化患者。納入標準：(1)D-D水平升高；(2)符合肝硬化的診斷標準[16]；(3)HBsAg陽性超過半年，HBV DNA陽性；(4)入組前6個月內(nèi)無抗病毒治療史；(5)隨訪時間超過6個月。排除標準：(1)合并可引起血漿D-D水平升高的其他疾病，如惡性腫瘤、心腦血管性疾病、原發(fā)性血液系統(tǒng)疾病等；(2)6個月內(nèi)使用抗凝或促凝藥物；(3)合并其他嗜肝病毒感染、藥物性、酒精性、中毒性、遺傳代謝性、自身免疫性肝病等肝臟疾?。?4)肝癌；(5)妊娠及哺乳期婦女；(6)已診斷PVT或其他部位栓塞者；(7)有脾切除術史、脾栓塞術史、分流術史等；(8)有恩替卡韋或肝爽顆粒使用禁忌證；(9)隨訪不足6個月或3個月內(nèi)死亡。

1.2 研究方法 收集所有患者的一般資料、病史、性別、年齡、HBsAg、HBV DNA、WBC、Hb、PLT、TBil、ALT、AST、GGT、D-D、Alb、總蛋白(TP)、總膽汁酸(TBA)、膽堿酯酶(ChE)、葡萄糖(GLU)、尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、估算腎小球濾過率(eGFR)、凝血酶原時間(PT)、國際標準化比值(INR)、肝硬度值(LSM)、心肺功能、彩超、CT、MRI等基線指標。治療后每3個月檢測1次，必要時增加相關檢測。開始治療后每3個月隨訪1次，以基線和隨訪6、12、24、36個月為主要觀測時間點，PVT為觀察終點事件。

1.3 治療方法 所有患者均根據(jù)病情需要酌情給予安體舒通、呋塞米、白蛋白、血漿等常規(guī)對癥支持治療。在此基礎上，將患者隨機分為聯(lián)合組和對照組，其中聯(lián)合組患者予以肝爽顆粒(3 g/袋，生產(chǎn)批號：20180102)聯(lián)合恩替卡韋分散片(0.5 mg/片，生產(chǎn)批號：20171230)，對照組患者僅應用恩替卡韋。恩替卡韋分散片為0.5 mg/次，口服，1次/d；肝爽顆粒為3 g/次，3次/d。服用肝爽顆粒和/或恩替卡韋分散片時間至少6個月。因聯(lián)合組患者使用肝爽顆粒時間不一，需2個月以上的累積劑量才能顯示出其效果，故計算患者在隨訪期間應用肝爽顆粒的累積日劑量(cumulate defined daily doses, cDDD)，服用肝爽顆?！?80 cDDD的患者方可納入分析。

1.4 檢測儀器及試劑 治療前、治療后每3個月檢測1次血漿D-D水平，應用日本希森美公司生產(chǎn)的Sysmex CA-7000全自動凝血分析儀，采用免疫比濁法，試劑盒由Sysmex公司提供。

臨床生化指標檢測使用日本奧林巴斯AU400全自動生化儀(Japan,Olympus Optical Industry Co.,Ltd.)。外周血檢測應用Sysmex-XT 4000i全自動血細胞分析儀(Japan, Sysmex Corporation)。B超使用荷蘭邁德彩色多普勒超聲診斷設備和支持系統(tǒng)(Netherlands, Royal Dutch Philips Electronics Ltd.)。乙型肝炎血清學標志物檢測采用ROCHE公司e601全自動電化學發(fā)光免疫分析系統(tǒng)(Switzerland, Roche Diagnostics Products CO.,Ltd)，試劑購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司的配套試劑(HBsAg的稀釋采用HBsAg-QN Dil HepB在相應的平臺強制稀釋)。cobas HBV DNA檢測應用ROCHE公司全自動AmpliPrep/cobas TaqMan 48系統(tǒng)檢測儀，試劑使用ROCHE公司的配套試劑(Switzerland, Roche Diagnostics Products CO.,Ltd)，線性檢測范圍為2×101～1.7×108IU/mL。應用法國ECHOSENS FIBROSCAN儀器(France, ECHOSENS Co., Ltd)進行LSM(kPa)檢測。CT使用美國GE公司64排lightspeed VCT機、AW4.3工作站、perfusion-3.0灌注軟件包獲得圖像(the United States, General Electric Company)。MRI使用上海聯(lián)影3.0T核磁共振成像系統(tǒng)uMR780進行掃描(China, Shanghai Lianying Medical Technology Co., Ltd)。

2 結果

2.1 基線資料 納入乙型肝炎肝硬化患者356例，其中聯(lián)合組191例，對照組165例。聯(lián)合組中男133例，女58例，年齡18～74歲，平均(48.29±9.89)歲；對照組中男118例，女47例，年齡19～73歲，平均(49.45±10.48)歲。兩組性別、年齡、BMI、肝腎功能、D-D水平等基線資料比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)(表1)。

表1 兩組患者的基線特征Table 1 Baseline characteristics of the two groups of patients

2.2 兩組患者PVT累積發(fā)生率的比較 聯(lián)合組191例患者共隨訪296.25人年，人均隨訪時間(1.55±0.65)年，PVT發(fā)生率為4.19%(8例)，發(fā)病密度1.41/萬人年。對照組165例患者共隨訪253.25人年，人均隨訪時間(1.53±0.67)年，PVT發(fā)生率為12.12%(20例)，發(fā)病密度4.79/萬人年。兩組PVT發(fā)生率比較，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.687，P=0.006)。應用Kaplan-Meier法繪制兩組PVT累積發(fā)生率(圖1)，結果顯示聯(lián)合組PVT的累積發(fā)生率明顯低于對照組(χ2=7.226，P=0.007)，相對危險度為3.155(95%CI：1.351～7.370)。

2.3 Cox比例風險分析乙型肝炎肝硬化患者PVT的影響因素 以基線特征、并發(fā)癥、治療方案等為自變量，PVT為因變量，進行Cox回歸分析。單因素分析結果顯示：合并高血壓、TBil、ALT、AST、Alb、ChE、eGFR、AFP、D-D、Child-Pugh、肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋治療是PVT的影響因素(P值均<0.05)；將P<0.05的變量納入多因素分析，結果顯示：AST、Alb、D-D、肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋治療是PVT的獨立影響因素(P值均<0.05)(表2)，其中肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋治療和Alb是防止PVT發(fā)生的保護因素。

圖1 兩組患者PVT累積發(fā)生率的比較Figure 1 Comparison of rates of cumulative incidence of PVT in the two groups

表2 單因素和多因素Cox比例風險分析乙型肝炎肝硬化患者PVT的影響因素Table 2 Univariate and multivariate Cox proportional hazards analysis of the influencing factors of portal vein thrombosis in patients with hepatitis B cirrhosis

2.4 兩組患者的并發(fā)癥發(fā)生情況 兩組患者在治療過程中，新發(fā)腹水、自發(fā)性細菌性腹膜炎、上消化道出血、肝腎綜合征的發(fā)生率比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)(表3)。

3 討論

肝硬化患者PVT患病率為5%～20%[17-18]，表明其是肝硬化的常見并發(fā)癥。PVT可能增加肝硬化患者出血、腹水、腎損傷及肝移植術后死亡的風險[19-21]，但肝硬化PVT是否需要抗凝治療、何時啟動治療以及如何治療均需謹慎評估出血風險及獲益，特別是PLT減少、PT明顯延長、食管胃底靜脈曲張者[22-23]。

長期抗病毒治療對有效改善部分乙型肝炎肝硬化患者肝細胞炎癥、逆轉肝纖維化、減輕肝內(nèi)血管內(nèi)皮細胞和肝巨噬細胞功能障礙、降低門靜脈壓力、恢復肝血流動力學功能等具有一定的作用[24-26]。但仍有相當一部分患者，特別是失代償期肝硬化患者的治療效果并不理想。

肝爽顆粒組方以柴胡、黨參為君藥，白術、當歸、丹參、虎杖為臣藥，茯苓、白芍、桃仁、鱉甲、蒲公英、夏枯草、枳殼為佐藥。柴胡的主要活性成分柴胡皂苷能明顯降低肝纖維化大鼠透明質(zhì)酸、層粘連蛋白和Ⅵ型膠原水平[27]，還可能通過阻斷ERK1/2信號通路減輕內(nèi)毒素彌散性血管內(nèi)凝血引起的凝血功能障礙[28]。黨參的主要提取物可以通過抑制VWF信號級聯(lián)的絲氨酸-蘇氨酸激酶效應物Lyn激酶，降低D-D、血小板活化標志物CD41和血栓素A2水平，有效防止缺氧誘導的血小板活化和由此產(chǎn)生的促凝狀態(tài)[29]。黨參多糖具有調(diào)節(jié)血脂、抗凝血、抑制血小板聚積、改善微循環(huán)的作用[30-31]。而丹參的主要活性成分丹參酮Ⅱ-A、丹酚酸B、丹酚酸A、丹參單體IH764-3能改善血液流變學障礙、血管內(nèi)皮功能，可能對深靜脈血栓的治療有潛在作用[32-34]，同時可以抑制血小板聚積和黏附，還具有抗凝血、抗血栓、抗氧化的作用，能夠從多途徑改善高凝狀態(tài)[35-37]。有研究[38]證實，肝爽顆粒的主要活性成分經(jīng)高效液相色譜分析鑒定為柚皮苷，其可以誘導自噬的激活，減輕肝細胞損傷，還可能通過MTOR途徑抑制肝星狀細胞活化，從而達到抗纖維化的作用。Lu等[39]研究證實，恩替卡韋聯(lián)合肝爽顆粒能夠改善乙型肝炎引起的晚期纖維化和肝硬化的組織學改變。有學者[40]發(fā)現(xiàn)，應用肝爽顆粒治療的肝硬化小鼠IL-6、TNFα、IL-1β表達水平更高，而TGFβ1表達降低，肝爽顆?？赡芡ㄟ^部分抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞分化發(fā)揮重要的抗纖維化作用，有助于肝臟再生和修復。劉立等[41]研究顯示，肝爽顆粒聯(lián)合富馬酸替諾福韋酯能更好地改善乙型肝炎肝硬化的門靜脈血流動力學指標，如門靜脈內(nèi)徑、門靜脈平均血流速度、門靜脈血流量等，提示肝爽顆粒的多種活性成分可能通過誘導激活自噬、抑制肝星狀細胞活化、抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細胞分化、抑制血小板聚積和黏附、抗凝血、改善血管內(nèi)皮功能、提高門靜脈系統(tǒng)血流速度等多靶點影響肝組織學和血流動力學狀態(tài)，從而改善肝硬化的高凝狀態(tài)，降低D-D水平，減少PVT的發(fā)生。然而，肝爽顆粒在不與抗病毒藥物聯(lián)合的情況下，是否能夠有效改善肝硬化患者的肝纖維化、血流動力學狀態(tài)以及D-D水平尚需要更多的證據(jù)來證實。

本研究基于本院連續(xù)3年的隨訪數(shù)據(jù)，分析肝爽顆粒聯(lián)合恩替卡韋對乙型肝炎肝硬化患者PVT的影響。結果顯示，與單用恩替卡韋相比，聯(lián)合組PVT的發(fā)生率明顯下降(4.19% vs 12.12%，P=0.006)，并且肝爽顆粒治療時間越長，兩組PVT的累積發(fā)生率差異越明顯(χ2=7.226，P=0.007)。多因素Cox比例風險分析顯示，AST、D-D水平是乙型肝炎肝硬化患者發(fā)生PVT的獨立危險因素，而恩替卡韋聯(lián)合肝爽顆粒治療和Alb是預防PVT形成的保護因素。但肝爽顆粒降低肝硬化患者PVT發(fā)生的機制及作用靶點，需要未來更深入和詳細的探究。

治療過程中并發(fā)癥的情況分析結果顯示，兩組新發(fā)腹水、原發(fā)性自發(fā)性細菌性腹膜炎、上消化道出血和肝腎綜合征的發(fā)生率差異有統(tǒng)計學意義(P值均<0.05)，表明聯(lián)合組對血流動力學、門靜脈壓力和纖維化的改善優(yōu)于對照組；但新發(fā)的肝性腦病和肝癌的發(fā)生率兩組間無顯著差異，可能還需要更多的數(shù)據(jù)或更長時間的觀察。

表3 兩組患者并發(fā)癥發(fā)生情況比較Table 3 Comparison of complications between the two groups

本研究為單中心研究，病例選擇可能存在一定的偏倚。因此，未來需要更多的前瞻性、多中心臨床研究進一步探討和驗證肝爽顆粒對肝硬化患者凝血狀態(tài)的作用機制。

倫理學聲明：本研究方案于2017年1月15日經(jīng)由昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審批，批號：昆三倫20170115。所納入患者均由本人或監(jiān)護人簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉立、李俊義負責課題設計，資料分析，撰寫論文；劉春云、常麗仙參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；張麗華負責統(tǒng)計分析；黃紅麗、羅煜、高建鵬負責擬定寫作思路，指導撰寫文章并最后定稿。