病毒miRNA檢測與早產(chǎn)兒腦室周圍白質(zhì)軟化癥關(guān)系的研究

吳秋萍 李 宏 文香淑 陳 姍 劉麗娟

1.珠海市婦幼保健院兒童腦發(fā)育與康復(fù)科，廣東珠海 519000；2.南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院兒科，廣東廣州 510000

腦室周圍白質(zhì)軟化癥（periventricular leukomalacia in preterm infants，PVL）是早產(chǎn)兒常見的腦損傷方式，圍生期的感染及炎癥影響也是PVL大腦白質(zhì)損傷的原因[1-2]，Gibson等[3]檢測了443例腦癱患兒和883例健康對照兒童中單純皰疹病毒1型（herpes simplex virus 1，HSV1）、單 純 皰 疹 病毒2型（herpes simplex virus 2，HSV2）、巨 細(xì) 胞 病毒（cytomegalovirus，CMV）、EB病 毒（epstein-Barr virus，EBV）等嗜神經(jīng)病毒核酸的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)腦癱患兒在圍生期高度暴露于上述皰疹病毒和腸道病毒中。本研究前期應(yīng)用miRNA基因芯片檢測PVL早產(chǎn)兒及5例健康早產(chǎn)兒外周血清中miRNA的表達(dá)[4]，其中有差異表達(dá)顯著的4個病毒miRNA：sv40-miR-S1-5p、ebv-miR-BART8-3p、hsv1-miRH6-5p、hsv2-miR-H10，提示相關(guān)病毒感染引發(fā)炎癥反應(yīng)可能參與PVL的發(fā)病。本研究應(yīng)用生物學(xué)信息分析方法和實(shí)時熒光定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行驗(yàn)證miRNA基因芯片檢測結(jié)果，以證明病毒miRNA與PVL發(fā)表的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

將2013年1月至2021年8月于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院就診的7例早產(chǎn)兒PVL的患兒作為試驗(yàn)組，5例健康早產(chǎn)兒為對照組。納入標(biāo)準(zhǔn)：試驗(yàn)組患兒有早產(chǎn)病史（胎齡小于37周），生后有運(yùn)動發(fā)育遲緩的臨床表現(xiàn)，查體有肢體肌張力增高，膝腱反射亢進(jìn)，踝陣攣陽性等錐體束征陽性表現(xiàn)，頭顱磁共振檢查有側(cè)腦室周圍白質(zhì)軟化的病灶表現(xiàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有遺傳代謝病、身體發(fā)育不良，嚴(yán)重肝腎疾病的患兒；對照組為早產(chǎn)兒（胎齡小于37周），生長發(fā)育里程碑正常，無發(fā)育異常表現(xiàn)的健康嬰兒。兩組嬰兒年齡、出生胎齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05），具有可比性。見表1。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，且所有嬰兒檢測標(biāo)本均獲得其監(jiān)護(hù)人的同意，并且簽署相關(guān)知情同意書。

表1 兩組研究對象年齡、胎齡、性別比較

1.2 主要材料

Trizol RNA提取試劑（美國Invitrogen公司）、RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國promega公司）、焦碳酸二乙酯（DEPC，北京普瑞達(dá)生物有限公司）、RT-qPCR試劑盒（廣州萊德爾生物科技有限公司）、PCR擴(kuò)增儀（鄭州博邦）、核酸蛋白測定儀（德國Eppendorf）、7500型快速實(shí)時熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司ABI）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 兩組研究對象均采集靜脈血液樣本2 ml，用EDTA管抗凝，離心吸取血清，分裝于1.5 ml EP管中，-80℃冰箱保存。

1.3.2 應(yīng)用生物信息學(xué)方法進(jìn)行靶基因預(yù)測及信號通路分析 對應(yīng)用miRNA基因芯片檢測篩選出顯著差異表達(dá)的4個病毒miRNA，采用miRNA靶基因預(yù)測軟件（miRanda和targetscan）進(jìn)行靶基因的預(yù)測，將兩個軟件預(yù)測的結(jié)果整合作為miRNA的候選靶基因。應(yīng)用Gene Ontology（GO）分析將兩個數(shù)據(jù)庫預(yù)測的靶基因進(jìn)行富集和分類，篩選出與感染、炎癥、免疫等密切相關(guān)的靶基因，并采用Pathway生物學(xué)通路分析進(jìn)行相關(guān)信號通路預(yù)測。

1.3.3 應(yīng)用qRT-PCR驗(yàn)證4個病毒miRNA的差異表達(dá) ①試驗(yàn)組及對照組外周血標(biāo)本進(jìn)行總RNA提取，進(jìn)行標(biāo)本合格性檢測；②逆轉(zhuǎn)錄：在PCR的擴(kuò)增儀上，使用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，后續(xù)進(jìn)行翻譯；③qRT-PCR定量：將逆轉(zhuǎn)錄后的標(biāo)本進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)體系進(jìn)行反應(yīng)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本非參數(shù)K-S檢驗(yàn)進(jìn)行分析，計量資料采用χ2檢驗(yàn)。P< 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 病毒miRNA進(jìn)行生物信息學(xué)分析

2.1.1 靶基因預(yù)測 對病毒miRNA（sv40-miRS1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebvmiR-BART8-3p）進(jìn)行靶基因預(yù)測。采用miRanda及targetscan兩個數(shù)據(jù)庫對篩選出的4個病毒miRNA進(jìn)行預(yù)測，得到靶基因信息進(jìn)行整合后作為4個病毒miRNA的候選靶基因。

2.1.2 GO分析結(jié)果 根據(jù)靶基因預(yù)測結(jié)果，對4個病毒miRNA進(jìn)行GO分析靶基因富集、分類結(jié)果顯示，sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10與炎癥、感染和免疫等密切相關(guān)，見表2。

表2 GO分析富集的與PVL相關(guān)的靶基因數(shù)

2.1.3 與PVL相關(guān)的靶基因的Pathway生物通路圖 4個病毒miRNA經(jīng)Pathway生物學(xué)信息通路分析，預(yù)測到其生物學(xué)信息通路與炎癥、免疫密切相關(guān)，包括：絲裂原活化蛋白激酶（mitosolysis activates protein kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Toll樣受體生物學(xué)通路、缺氧誘導(dǎo)因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）生物學(xué)通路及T細(xì)胞相關(guān)生物學(xué)通路。其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等與炎癥、免疫相關(guān)通路密切相關(guān)，位于MAPK和Toll樣受體信號通路上游的關(guān)鍵位置（圖1～2）。

圖1 MAPK相關(guān)生物通路圖

2.2 實(shí)時熒光定量PCR檢測驗(yàn)證病毒miRNA差異表達(dá)

應(yīng) 用qRT-PCR檢 測sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p4個病毒miRNA（圖3）。以miR-425為內(nèi)參，其中sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA的相對表達(dá)量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），與miRNA基因芯片結(jié)果一致（表3）。

表3 4個病毒miRNA相對表達(dá)量統(tǒng)計學(xué)分析表（x ± s）

圖2 Toll樣受體相關(guān)生物通路圖

圖3 病毒miRNA的擴(kuò)增曲線及溶解曲線圖

3 討論

世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全世界每年約有1500萬早產(chǎn)兒（每10名活產(chǎn)嬰兒中就有1名）出生時間不到37周。早產(chǎn)是五歲以下嬰兒死亡的主要原因，每年出生的極低出生體重嬰幼兒約占400萬活產(chǎn)嬰兒的1.5%。盡管早產(chǎn)兒護(hù)理方面的持續(xù)發(fā)展顯著改善了極低出生體重兒（<1.5 kg）的生存率，但隨著生存率的提高，神經(jīng)功能障礙、永久性運(yùn)動障礙（即PVL）見于約10%的早產(chǎn)兒幸存者[5-7]。

miRNA是小的內(nèi)源性非編碼RNA，用于在轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)基因表達(dá)。miRNA在轉(zhuǎn)錄過程中，與相應(yīng)mRNA結(jié)合，從而在蛋白質(zhì)水平進(jìn)行調(diào)控，影響翻譯的效率，進(jìn)而參與調(diào)節(jié)機(jī)體細(xì)胞的眾多生理過程。進(jìn)一步研究表明，miRNA可與RNA病毒的基因組進(jìn)行結(jié)合，從而影響病毒進(jìn)入宿主后，病毒的復(fù)制及所引起相應(yīng)的病理改變[8]。miRNA在腦損傷方面的研究正在擴(kuò)大，因?yàn)閙iRNA是基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是生物標(biāo)志物開發(fā)有希望的候選者[9]。Cullen等[10-11]研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在病毒入侵機(jī)體后，對機(jī)體組織進(jìn)行選擇以及引發(fā)相關(guān)病癥或?qū)M織進(jìn)行損害均有重要意義。其中包括 EBV、HSV、CMV在內(nèi)的多種病毒能夠編碼產(chǎn)生miRNA，進(jìn)而上調(diào)或下調(diào)機(jī)體體內(nèi)某些靶基因的水平，影響與病毒感染相關(guān)的免疫、炎癥因子、信號分子等，從而影響機(jī)體的炎性免疫反應(yīng)。

本研究對既往應(yīng)用miRNA基因芯片檢測PVL早產(chǎn)兒和健康早產(chǎn)兒外周血清中miRNA的表達(dá)，篩選出顯著差異表達(dá)的病毒miRNA進(jìn)行生物學(xué)分析。采用GO分析對預(yù)測到的靶基因富集、分類結(jié)果顯示，4個病毒miRNA（sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10、ebv-miR-BART8-3p）的靶基因與炎癥、感染、免疫等密切相關(guān)。應(yīng)用Pathway生物學(xué)信息通路分析，預(yù)測密切相關(guān)的生物學(xué)通路，其中包括Toll樣受體生物學(xué)信號通路、MAPK信號通路、T細(xì)胞受體信號通路及HIF-1信號通路等炎癥、免疫相關(guān)通路，其中靶基因MyD88、TRAF6、IL1R、TLR6、IFN-αβR、TGFB、ERK、p38等與炎癥、免疫相關(guān)通路密切相關(guān)，處于Toll樣受體信號以及MAPK信號通路的關(guān)鍵位置。進(jìn)一步擴(kuò)大樣本采用qRT-PCR技術(shù)檢測上述4個病毒miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA的相對表達(dá)量與對照組差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與miRNA基因芯片結(jié)果一 致。提 示sv40-miR-S1-5p、hsv1-miR-H6-5p、hsv2-miR-H10在PVL的發(fā)病中起重要作用。

hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10是 單 純皰疹病毒1型（HSV1）和2型（HSV2）分別編碼的miRNA，人類是HSV的自然宿主，可累及口腔、皮膚、黏膜、眼黏膜及中樞神經(jīng)系統(tǒng)[12]。Gibson檢測的443例腦癱患兒和883例健康對照兒童中HSV1、HSV2、EBV、CMV等嗜神經(jīng)病毒核酸的表達(dá)含量，發(fā)現(xiàn)腦癱患兒在圍生期高度暴露于上述皰疹病毒和腸道病毒中[3]。特定病毒的感染可能會影響人自身編碼的miRNA，上調(diào)或下調(diào)相關(guān)miRNA的表達(dá)水平，對病毒的感染進(jìn)程起促進(jìn)或抑制的作用。sv40-miR-S1-5p是猿猴空泡病毒40（simian vacuolating virus 40，SV40）編碼的miRNA[13]，有研究表明，SV40 對腦組織有親嗜性，可在人胎腦細(xì)胞內(nèi)繁殖[14]。

Guo K等[15]發(fā)現(xiàn)在脂多糖誘導(dǎo)的PVL新生鼠模型中，miRNA在其發(fā)病機(jī)制中有重要調(diào)節(jié)作用。該研究使用miRNA微陣列分析檢測獲得104個與PVL相 關(guān) 的miRNA，用qRT-PCR對miRNA微 陣列驗(yàn)證其表達(dá)差異，研究表明，PVL模型的miRNA表達(dá)譜與對照組相比有顯著變化。如miR-451表達(dá)升高，而rno-miR-200b表達(dá)顯著降低，進(jìn)一步行生物學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其與炎癥反應(yīng)通路密切相關(guān)，表明部分miRNAs在腦組織中存在差異表達(dá)，可能參與了發(fā)生PVL的分子機(jī)制，但其調(diào)節(jié)的基本機(jī)制尚未完全明了。

已有研究表明[16]，圍生期胎兒臍帶血和羊水組織中的炎癥相關(guān)細(xì)胞因子的水平上升和早產(chǎn)、腦癱的發(fā)生有較高關(guān)聯(lián)性。若臍帶血中IL-6>11 pg/ml的早產(chǎn)兒，PVL和腦室內(nèi)出血的發(fā)生率為78%，而臍帶血中IL-L的水平< 11 pg/ml，腦損傷的發(fā)生率為30%。在PVL腦室周圍病灶中，大量炎癥細(xì)胞因子的活性顯著增高[17-18]，提示炎癥及感染相關(guān)因素在PVL的發(fā)病中占有重要位置。

本研究在PVL早產(chǎn)兒外周血中應(yīng)用miRNA基因芯片檢測出顯著表達(dá)差異的4個病毒miRNA，生物學(xué)分析可知，其與炎癥相關(guān)的靶基因及生物學(xué)通路密切相關(guān)，并經(jīng)qRT-PCR進(jìn)一步驗(yàn)證，sv40-miR-S1-5p、 hsv1-miR-H6-5p和hsv2-miR-H10共3個病毒miRNA存在顯著差異表達(dá)，與基因芯片結(jié)果一致，充分提示了這3個病毒miRNA可能在PVL的發(fā)病中產(chǎn)生影響。這些病毒感染可以發(fā)生在整個妊娠期，病毒感染后可呈潛伏感染狀態(tài)，可使母體反復(fù)感染，并有在整個妊娠期感染胎兒的能力，甚至在產(chǎn)時、產(chǎn)后感染新生兒。病毒進(jìn)入機(jī)體后，相應(yīng)病毒編碼miRNA表達(dá)變化，靶向作用于其靶基因，或調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)miRNA的表達(dá)水平變化，激活MAPK、Toll樣受體生物學(xué)信號通路，引起級聯(lián)反應(yīng)，使宮內(nèi)胎兒的炎癥因子出現(xiàn)大幅度上調(diào)，對胎兒腦組織產(chǎn)生直接或間接的損害，可導(dǎo)致PVL的發(fā)生。

外周血檢查特異地miRNA表達(dá)，有可能成為PVL早期診斷的指標(biāo)，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本，多中心協(xié)作，尋找PVL診斷的可靠指標(biāo)。