凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951新型抗菌肽的挖掘、表達(dá)及活性測(cè)定

張婧，吳影,2，古紹彬,2*，馬金亮，田萍萍，趙麗娜，李欣，張杰

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng)，471023)2(河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽(yáng)，471023)

食源性致病菌引起的食品安全問(wèn)題嚴(yán)重威脅人們的生命健康。長(zhǎng)期以來(lái)濫用抗生素已使多種細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，因此，開(kāi)發(fā)新型抗菌劑迫在眉睫。抗菌肽是由核糖體合成的，可抑制微生物生長(zhǎng)或殺死微生物的一類(lèi)小分子多肽或蛋白，通常具有良好的穩(wěn)定性和廣譜抑菌活性[1]。抗菌肽的主要抑菌方式是增強(qiáng)膜的通透性，破壞膜質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)，并引起膜穿孔，導(dǎo)致細(xì)菌裂解死亡[2-3]。因此，抗菌肽不易使細(xì)菌產(chǎn)生廣泛的耐藥性，被認(rèn)為是最具潛力的抗菌劑之一。環(huán)肽是抗菌肽中較特殊的一類(lèi)，肽在核糖體合成后，前導(dǎo)肽會(huì)被酶切，碳鏈主鏈頭尾氨基酸殘基脫水縮合形成一個(gè)閉合的環(huán)[4]。與線性肽相比，環(huán)肽表現(xiàn)出更強(qiáng)的熱穩(wěn)定性和抑菌活性[5]。目前報(bào)道的產(chǎn)環(huán)肽菌株有糞腸球菌S-48(Enterocin AS-48)[6]、結(jié)核鏈球菌(Uberolysin)[7]、拜氏梭菌ATCC 25752(Circularin A)[8]以及枯草芽孢桿菌(Subtilosin A)[9]等，尚未見(jiàn)有產(chǎn)自凝結(jié)芽孢桿菌的環(huán)肽報(bào)道。

隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，利用泛基因組和次級(jí)代謝產(chǎn)物挖掘軟件，更多的抗菌肽被挖掘和應(yīng)用。錢(qián)文江等[10]對(duì)從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得的33個(gè)凝結(jié)芽孢桿菌的基因組進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物合成基因簇分析，發(fā)現(xiàn)與已知基因簇有同源性的43個(gè)基因簇中有11個(gè)基因簇與Amylocyclicin高度同源，因此，凝結(jié)芽孢桿菌極可能具有Amylocyclicin代謝合成途徑。Amylocyclicin最初發(fā)現(xiàn)于解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42，是一類(lèi)對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌表現(xiàn)出較高抑菌活性的新型環(huán)狀細(xì)菌素[11]。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951對(duì)志賀氏菌等食源性致病菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性，主要抑菌物質(zhì)是有機(jī)酸和抗菌肽，并對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物中的有機(jī)酸的抑菌特性進(jìn)行了研究[12]，而抗菌肽尚待深入研究。基于此，開(kāi)展凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951的全基因組測(cè)序，與次級(jí)代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，挖掘抗菌肽合成基因簇，并將其中一個(gè)抗菌肽基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)譜和抑菌活性驗(yàn)證，以期為凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抗菌肽的進(jìn)一步研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

凝結(jié)芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951，單核細(xì)胞增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes) ATCC 19115，實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌株，均在LB(Luria-Bertani)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)(pH 8.0)。

DNA提取試劑盒、BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞、pGEX-4T-1表達(dá)載體、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG)、3′, 3′, 5′, 5′, -四甲基聯(lián)苯胺(tetramethylbenzidine，TMB)顯色試劑盒、蛋白免疫印跡(Western blot)一抗和二抗，生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Pacbio RS Ⅱ測(cè)序儀，Pacific Biosciences公司；JY88-II超聲波細(xì)胞破碎儀，天津津立儀器設(shè)備科技發(fā)展有限公司；QE-OrbitrapTM高場(chǎng)靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜儀、Nanodrop 2000超微量紫外分光光度計(jì)，Thermo Fisher公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 總DNA提取

凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951在37 ℃振蕩培養(yǎng)16 h至生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，8 000 r/min離心10 min收集菌體，按DNA提取試劑盒步驟提取細(xì)菌基因組DNA。

采用Qubit 4.0和Nanodrop 2000對(duì)基因組DNA進(jìn)行定量和純度檢測(cè)。將高質(zhì)量的DNA(OD260/280為1.8～2.0；OD260/230為2.0～2.2，DNA總量≥15 μg，質(zhì)量濃度≥50 ng/μL)用于物種鑒定和后續(xù)建庫(kù)測(cè)序。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建與基因注釋

采用第三代測(cè)序平臺(tái)PacBio RS Ⅱ?qū)δY(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951進(jìn)行完成圖測(cè)序(北京奧維森基因科技有限公司)。使用SMRT Link v5.0.1工具(PacBio公司)進(jìn)行reads組裝，GeneMarks(http://topaz.gatech.edu/)進(jìn)行細(xì)菌的編碼基因預(yù)測(cè)，將編碼基因在蛋白相鄰類(lèi)的聚簇?cái)?shù)據(jù)庫(kù)(Cluster of Orthologous Groups of Proteins，COG)、京都基因與基因組百科全書(shū)數(shù)據(jù)庫(kù)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)、基因本體論數(shù)據(jù)庫(kù)(Gene Ontology，GO)進(jìn)行功能注釋。

1.3.3 抗菌肽基因簇挖掘

用antiSMASH 5.0[13]軟件(http://antismash.secondarymetabolites.org/)對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物和RiPPPs進(jìn)行挖掘。將全基因組序列的FAST格式上傳后，選擇“strict”檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，勾選“Known Cluster Blast”、“Active Site Finder”“Sub Cluster Blast”和“RREF indeer”后提交，對(duì)獲得的核心肽氨基酸序列與NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Protein BLAST比對(duì)，采用MEGA 5.0軟件運(yùn)用Neighbor-Joining方法建立基于氨基酸序列和相關(guān)環(huán)肽的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.4 抗菌肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

用Expasy(http://web.expasy.org/protparam/)對(duì)抗菌肽的分子質(zhì)量、等電點(diǎn)、電荷數(shù)和不穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)[14]；用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對(duì)跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)對(duì)信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測(cè)，用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[15]；用SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/)對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模擬[16]。

1.3.5 Region 3抗菌肽質(zhì)粒構(gòu)建及表達(dá)

質(zhì)粒構(gòu)建與驗(yàn)證：以Region 3成熟肽氨基酸序列為模板，由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的產(chǎn)物。通過(guò)連接酶將PCR產(chǎn)物和克隆載體進(jìn)行連接，對(duì)克隆載體進(jìn)行酶切，將目的基因酶連至載體，連接液轉(zhuǎn)入TOP 10感受態(tài)中，并對(duì)篩選出的陽(yáng)性克隆菌株進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21(DE3)于42 ℃熱激后涂布在含50 μg/mL氨芐青霉素的平板上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜；挑取單克隆菌落到含50 μg/mL氨芐青霉素的液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD值為0.6時(shí)，分別添加0.5和1.0 mmol/L IPTG于16 ℃條件下振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。

表達(dá)檢測(cè)：離心收集菌體并重懸于PBS(0.01 mol/L，pH 7.4)，用超聲波細(xì)胞破碎儀裂解細(xì)胞(300 W，工作5 s，間歇5 s)至懸浮液透亮。離心后收集上清液和細(xì)胞碎片，細(xì)胞碎片用8 mol/L尿素溶解，再用2 mol/L尿素復(fù)性。分別對(duì)上清液和細(xì)胞碎片制樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳(12%分離膠，5%濃縮膠)檢測(cè)蛋白分子質(zhì)量，并進(jìn)行蛋白免疫印跡檢測(cè)[一抗為兔抗谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)標(biāo)簽，二抗為羊抗兔]，采用TMB顯色后觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.3.6 重組蛋白的質(zhì)譜驗(yàn)證

將SDS-PAGE凝膠電泳的目標(biāo)條帶切膠，按照質(zhì)譜檢測(cè)要求處理后送卡梅德生物科技(天津)有限公司鑒定。質(zhì)譜參數(shù)：質(zhì)譜一級(jí)譜掃描范圍350～ 1600m/z；二級(jí)質(zhì)譜模式CID(Elite)。數(shù)據(jù)使用Proteome Discoverer 2.0(Thermo Fisher公司)進(jìn)行處理。

1.3.7 抗菌活性驗(yàn)證

按照1.3.5重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測(cè)方法，每600 mL重組大腸桿菌發(fā)酵液菌體超聲波處理后細(xì)胞碎片重懸至6 mL為制備樣品。以終濃度為106CFU/mL(涂板計(jì)數(shù))的單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為指示菌，取200 μL涂板，采用牛津杯法[17]檢測(cè)融合蛋白的抑菌活性，每個(gè)杯中添加200 μL樣品，37 ℃培養(yǎng)24 h后，采用十字交叉法測(cè)量透明圈直徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA提取的質(zhì)量檢測(cè)

對(duì)提取的凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951的總DNA進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。Nanodrop檢測(cè)其OD260/280為1.98，OD260/230為2.17；Qubit檢測(cè)其質(zhì)量濃度為208 ng/μL，體積290 μL，總量60.32 μg，其質(zhì)量和濃度達(dá)到建庫(kù)要求，進(jìn)行建庫(kù)。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951全基因組分析

通過(guò)第三代測(cè)序平臺(tái)PacBio RS II對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951進(jìn)行完成圖測(cè)序。該染色體基因組為環(huán)狀，染色體的總數(shù)為1，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒存在，基因組大小為3 608 370 bp，其GC含量為46.18%。

針對(duì)測(cè)序樣品的組裝基因組序列，結(jié)合編碼基因的預(yù)測(cè)結(jié)果，使用Circos軟件對(duì)樣品基因組進(jìn)行展示。如圖1所示，環(huán)形圖譜最外圈是基因組序列位置坐標(biāo)，由外到里分別是編碼基因和基因功能注釋結(jié)果(COG、KEGG、GO)。其中COG注釋的基因共有2 434個(gè)，占總注釋基因的57.19 %，分為信息存儲(chǔ)與處理、細(xì)胞過(guò)程和信號(hào)、新陳代謝3大類(lèi)，復(fù)制、重組和修復(fù)、能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸運(yùn)輸和代謝等24個(gè)分類(lèi)。KEGG注釋的基因有3 358個(gè)，占總注釋基因的78.90%，分別從細(xì)胞過(guò)程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、人類(lèi)疾病、新陳代謝、有機(jī)系統(tǒng)6大部分，細(xì)胞生長(zhǎng)與死亡、跨膜運(yùn)輸、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、復(fù)制和修復(fù)等27個(gè)分類(lèi)進(jìn)行基因注釋。GO注釋的基因有2 399個(gè)，分別從生物學(xué)途徑、細(xì)胞學(xué)組件和分子功能3大類(lèi)，生物調(diào)節(jié)、酶調(diào)節(jié)活動(dòng)等47個(gè)小分類(lèi)進(jìn)行基因注釋。

圖1 凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951基因組環(huán)形圖譜及分類(lèi)注釋Fig.1 Ring map and taxonomic annotation of the genome of Bacillus coagulans CGMCC 9951

2.3 antiSMASH對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951抗菌肽的挖掘

利用antiSMASH軟件對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951全基因組次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，共得到6個(gè)結(jié)果，見(jiàn)表1。其中Region 3和Region 6為核糖體合成和翻譯修飾后的肽產(chǎn)物(RiPP)簇，即潛在的目的產(chǎn)物抗菌肽。Region 1是T3PKS合成酶(Ⅲ聚酮化合物)，Region 2是硫肽類(lèi)抗生素，Region 4是β-內(nèi)酯含蛋白酶抑制劑，Region 5是萜烯類(lèi)化合物。

表1 antiSMASH對(duì)次級(jí)代謝產(chǎn)物的預(yù)測(cè)Table 1 Prediction of secondary metabolites by antiSMASH

Region 3和Region 6的合成基因簇及核心肽氨基酸序列見(jiàn)圖2。

圖2 Region 3和Region 6的合成基因簇及 核心肽氨基酸序列Fig.2 Synthesis of Region 3 and Region 6 gene clusters and amino acid sequences of core peptides

將2個(gè)氨基酸序列在NCBI的Protein BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行同源性比對(duì)，基于氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果(圖3)，發(fā)現(xiàn)Region 3與Amylocyclicin的相似度較高，而Region 6在數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)比對(duì)結(jié)果。Amylocyclicin是由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42的核糖體產(chǎn)生的新型環(huán)狀細(xì)菌素，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有較高的抑菌活性，其在N端Leu和C端Try之間脫水縮合形成環(huán)化，成熟環(huán)肽的分子質(zhì)量為6 381 Da(未環(huán)化肽的分子質(zhì)量為6 399 Da，相差1個(gè)H2O分子)[11]。最終，選擇Region 3進(jìn)行表達(dá)，開(kāi)展后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 Region 3基于氨基酸序列和相關(guān)環(huán)肽的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of Region 3 based on amino acid sequences and related cyclic peptides

2.4 Region 3抗菌肽的結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過(guò)Expasy分析一級(jí)結(jié)構(gòu)，Region 3成熟肽由64個(gè)氨基酸殘基組成，分子式為C291H488N72O84S1，6 371.57 Da，氨基酸分布見(jiàn)圖4-a。此外，預(yù)測(cè)到負(fù)電荷殘基總數(shù)為2，正電荷殘基總數(shù)為7，正電荷數(shù)目的增加可提高抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的結(jié)合能力，降低抑菌濃度[18]。其次，預(yù)測(cè)不穩(wěn)定系數(shù)為4.28，遠(yuǎn)小于40，歸為穩(wěn)定蛋白，良好的穩(wěn)定性有助于抗菌肽的加工和保存。

a-氨基酸分布；b-疏水性；c-信號(hào)肽分析； d-跨膜區(qū)分析圖4 Region 3抗菌肽理化性質(zhì)預(yù)測(cè)Fig.4 Prediction of physicochemical properties of Region 3 antimicrobial peptide

疏水性如圖4-b所示，多肽鏈呈兩親性，平均系數(shù)為0.841，歸為疏水蛋白。疏水性是影響抗菌活性的重要因素之一，疏水性太低會(huì)導(dǎo)致抗菌肽與細(xì)菌細(xì)胞膜的親和力過(guò)低而不易結(jié)合，太高易導(dǎo)致抗菌肽自我聚集而降低溶解度[19]。一般細(xì)胞內(nèi)部大多為親水性蛋白，膜蛋白親水性通常較差，故推測(cè)該抗菌肽可能是結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞膜上的一個(gè)小分子蛋白。信號(hào)肽分析結(jié)果見(jiàn)圖4-c，表示剪切位點(diǎn)存在可能性的C值最大值在第41位氨基酸殘基，在此區(qū)域有可能出現(xiàn)剪切位點(diǎn)，其次為第52位氨基酸殘基。信號(hào)肽存在可能性S值和綜合分析值Y值均未超過(guò)閾值0.5，表明該抗菌肽不存在信號(hào)肽區(qū)域。使用TMHMM進(jìn)行跨膜區(qū)分析結(jié)果見(jiàn)圖4-d。該肽含有一個(gè)跨膜螺旋域，肽鏈一端在膜外，一端在膜內(nèi)。綜上分析，該肽為一個(gè)帶正電荷、疏水的、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的膜上蛋白，根據(jù)預(yù)測(cè)的理化性質(zhì)進(jìn)行下一步表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建。

如圖5-a所示，Region 3抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋、β轉(zhuǎn)角、延伸鏈和無(wú)規(guī)卷曲構(gòu)成，其中有43個(gè)氨基酸參與α螺旋的形成，占67.19%；5個(gè)氨基酸參與β轉(zhuǎn)角的形成；有10個(gè)氨基酸參與延伸鏈的形成；6個(gè)氨基酸參與無(wú)規(guī)卷曲的形成。SWISS-MODEL同源建模三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)如圖5-b所示，以NKP-5-3B為模板(氨基酸序列見(jiàn)圖5-c)，兩者氨基酸序列重復(fù)率為60.9%，三級(jí)結(jié)構(gòu)高度相似，都是由4個(gè)緊密堆積的α螺旋結(jié)構(gòu)組成。研究表明，α螺旋可能是膜滲透和抗菌活性所必需的[20]，大多數(shù)抗菌肽在水溶液中是線性無(wú)結(jié)構(gòu)的，當(dāng)與目標(biāo)膜結(jié)合時(shí)，才折疊成螺旋結(jié)構(gòu)，并且只有當(dāng)α螺旋抗菌肽序列超過(guò)一定長(zhǎng)度，才足以跨越整個(gè)細(xì)菌膜，形成通道而殺死細(xì)菌[21-22]。

a-抗菌肽二級(jí)結(jié)構(gòu)；b-抗菌肽三級(jí)結(jié)構(gòu)；c-樣品和模板氨基酸序列圖5 Region 3抗菌肽結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.5 Prediction of Region 3 antimicrobial peptide structure

因此，以α螺旋為主要結(jié)構(gòu)的Region 3抗菌肽可能具有良好的抑菌活性。

2.5 Region 3抗菌肽的表達(dá)

為了方便后期制備和純化抗菌肽，采用帶有GST標(biāo)簽的載體和大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)。目的氨基酸序列為L(zhǎng)ASTLGISTAAAKKAIDIIDTASTIASIISLIGVV-TGAGAISYAVVATAKAMIKKYGKKYAAAW(載體信息見(jiàn)圖6-a)，表達(dá)的融合蛋白總長(zhǎng)度為290個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量32 658.4 Da，等電點(diǎn)為8.27。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切，電泳結(jié)果如圖6-b所示，條帶位于5 000 bp的是載體，小于500 bp的是目的基因(192 bp)，說(shuō)明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP 10感受態(tài)細(xì)胞中，檢測(cè)篩選出陽(yáng)性克隆的質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證無(wú)誤后再轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，所得菌株即為構(gòu)建好的表達(dá)菌株。

a-載體信息；b-重組質(zhì)粒酶切圖6 載體及重組質(zhì)粒酶切Fig.6 Vector and recombinant plasmid digestion

通常情況下，低溫環(huán)境會(huì)降低細(xì)菌的蛋白表達(dá)速度，減少包涵體形成。例如黃夏冰等[23]在37 ℃用不同濃度IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白均為包涵體，將溫度降低至15 ℃時(shí)，誘導(dǎo)產(chǎn)物絕大部分為可溶蛋白，且在0.5 mmol/L IPTG條件下可溶性蛋白表達(dá)量最高。因此，將重組大腸桿菌先在37 ℃培養(yǎng)至OD值為0.6后，再添加IPTG于16 ℃低溫培養(yǎng)過(guò)夜，然后將離心菌體超聲波破碎后的上清液和破碎細(xì)胞進(jìn)行SDS-PAGE，結(jié)果見(jiàn)圖7-a。添加0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)劑的細(xì)胞沉淀在32 kDa處都有表達(dá)條帶，且0.5 mmol/L的IPTG表達(dá)量更大；而加入0.5和1.0 mmol/L IPTG誘導(dǎo)的細(xì)胞上清液在32 kDa位置條帶都很淺，說(shuō)明表達(dá)蛋白主要是在細(xì)胞碎片中。此外，蛋白免疫印跡檢測(cè)圖譜顯示，在32 kDa出現(xiàn)印記條帶(見(jiàn)圖7-b箭頭所指)，證明成功表達(dá)了融合蛋白。

圖7 抗菌肽的SDS-PAGE(a)及Western blot(b)分析圖Fig.7 SDS-PAGE(a) and Western blot(b) analysis of antimicrobial peptides注：M-Protein Marker;1-未誘導(dǎo)表達(dá)總蛋白;2-16 ℃上清液, 0.5 mmol/L IPTG;3-16 ℃沉淀, 0.5 mmol/L IPTG; 4-16 ℃上清液, 1.0 mmol/L IPTG;5-16 ℃沉淀, 1.0 mmol/L IPTG

2.6 融合蛋白的質(zhì)譜驗(yàn)證分析

通過(guò)蛋白質(zhì)譜覆蓋試驗(yàn)檢測(cè)到一條肽段，氨基酸序列為ERAEISMLEGAVLDIR，是GST標(biāo)簽蛋白第88位到103位氨基酸序列，總離子流圖和目標(biāo)肽段離子流圖見(jiàn)圖8。GST標(biāo)簽蛋白可以增大目標(biāo)蛋白的溶解性，也為進(jìn)一步分離純化目的蛋白奠定基礎(chǔ)。通過(guò)質(zhì)譜分析成功檢測(cè)到了GST標(biāo)簽蛋白的多肽片段，表明重組大腸桿菌成功表達(dá)了融合蛋白。

a-總離子流圖；b-目標(biāo)肽段離子流圖圖8 總離子流圖和目標(biāo)肽段離子流圖Fig.8 Total ion flow diagram and target peptide ion flow diagram

2.7 融合蛋白活性驗(yàn)證

融合蛋白活性驗(yàn)證結(jié)果見(jiàn)圖9，添加0.5 mmol/L IPTG于16 ℃誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌的超聲波處理后細(xì)胞碎片對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌有良好的抑菌活性，抑菌圈直徑為(15.2±1.4)mm，而IPTG濃度增至1.0 mmol/L時(shí)對(duì)指示菌抑制效果稍弱，這與誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE結(jié)果相一致，而未誘導(dǎo)表達(dá)的大腸桿菌則沒(méi)有抑菌活性。因此，融合蛋白具有抑菌活性證實(shí)Region 3是編碼抗菌肽的基因，且利用原核表達(dá)體系表達(dá)的融合蛋白具有較好的抗菌活性。相似的，丁靜等[24]利用大腸桿菌表達(dá)的人源抗菌肽LL-37對(duì)多種常見(jiàn)的細(xì)菌均有較好的抑制作用。此外，王蓮哲等[25]利用畢赤酵母GS115表達(dá)的樹(shù)蛙抗菌肽Cathelicidin對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌都有良好的抑菌活性。因此，通過(guò)異源表達(dá)可以獲得大量抑菌性能優(yōu)良的抗菌肽，為進(jìn)一步的機(jī)理研究和應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

a-0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)細(xì)胞碎片；b-1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)細(xì)胞碎片；c-未誘導(dǎo)細(xì)胞碎片圖9 重組蛋白抑菌活性Fig.9 Antibacterial activity of recombinant protein

3 結(jié)論

凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951具有廣譜抑菌活性和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性[12, 26]，應(yīng)用前景良好。但目前從微生物發(fā)酵液中大量獲取抗菌肽純品較為困難，不利于研究應(yīng)用。因此，本研究通過(guò)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌CGMCC 9951的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行挖掘，并與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，選擇與Amylocyclin具有較高相似性的Region 3核心肽氨基酸序列進(jìn)行表達(dá)。通過(guò)一系列結(jié)構(gòu)分析軟件，對(duì)Region 3核心肽氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)其成熟肽分子質(zhì)量為6 371.57 Da，帶正電荷，呈疏水性穩(wěn)定蛋白。選擇大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Region 3核心肽進(jìn)行表達(dá)，采用0.5 mmol/L IPTG和16 ℃低溫過(guò)夜培養(yǎng)對(duì)目的蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)以減少包涵體的形成。SDS-PAGE、蛋白免疫印跡和質(zhì)譜驗(yàn)證結(jié)果表明成功構(gòu)建了Region 3蛋白原核表達(dá)系統(tǒng)，且表達(dá)的蛋白主要位于細(xì)胞碎片中，對(duì)單核細(xì)胞增生李斯特氏菌表現(xiàn)出良好的抑菌活性。融合蛋白的成功表達(dá)為后續(xù)的純化、性質(zhì)、抑菌機(jī)理和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。