枯草芽孢桿菌BS08復(fù)合抗熱保護(hù)劑的工藝配方優(yōu)化

張?chǎng)?，王芳?，龐錦程，時(shí)祥柱，陳炳鈿，倪莉

1(福州大學(xué) 食品科學(xué)技術(shù)研究所，福建省食品生物技術(shù)創(chuàng)新工程技術(shù)研究中心，福建 福州，350108) 2(福建省新閩科生物科技開(kāi)發(fā)有限公司，福建 福州，350108)

芽孢桿菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，是一類(lèi)好氣性細(xì)菌。該菌無(wú)毒性，能分泌蛋白酶等多種酶類(lèi)和抗生素，并因其芽孢分化的特性，對(duì)高溫、干燥、化學(xué)物質(zhì)有強(qiáng)大的抵抗性，十分便于生產(chǎn)、加工及保存，因此，被廣泛應(yīng)用于生物農(nóng)業(yè)等多個(gè)領(lǐng)域[1-2]。

目前，芽孢桿菌微生態(tài)制劑的干燥工藝主要包括噴霧干燥和真空冷凍干燥[3]。由于真空冷凍干燥技術(shù)是利用升華原理完成物料的干燥，因此物料在干燥過(guò)程中會(huì)保持較低的溫度，對(duì)于一些溫度敏感型物質(zhì)的干燥具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，能獲得具有較高活性的產(chǎn)物，但生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，產(chǎn)量較小，不適合規(guī)?；纳a(chǎn)過(guò)程。噴霧干燥是工業(yè)生產(chǎn)中最常用的一種干燥技術(shù)，能實(shí)現(xiàn)物料干燥的連續(xù)操作，獲得的產(chǎn)品呈粉末狀，粒徑均勻，操作靈活[4]。使用噴霧干燥技術(shù)將益生菌微膠囊化，不僅可使菌體與外界的不良環(huán)境分開(kāi)，掩蔽氣味，形成近似于球狀的固體微顆粒，便于添加使用，也有利于儲(chǔ)存和運(yùn)輸[5]。但噴霧干燥中采用的高溫與快速脫水過(guò)程會(huì)對(duì)益生菌造成多重脅迫，如熱脅迫、脫水脅迫、氧化脅迫等，易使菌粉損失幾個(gè)數(shù)量級(jí)的活菌數(shù)[6-8]。工業(yè)化生產(chǎn)芽孢桿菌微生態(tài)制劑還受到許多制約：(1)制劑工藝不夠完善，枯草芽孢桿菌在噴霧成粉末后，大量失活；(2)產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，在儲(chǔ)存過(guò)程中極易失活，貨架期較短[2-4]。因此，優(yōu)化生產(chǎn)工藝，制備高活菌數(shù)、耐保藏的微生態(tài)制劑，將對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)起到一定的助力。

為減少?lài)婌F過(guò)程中的細(xì)胞損傷，通常使用高保護(hù)性的載體材料加強(qiáng)對(duì)菌體的保護(hù)。KHEM等[9]采用正十六烷萃取的方法，表征了噴霧干燥后益生菌表面疏水性的變化，他們提出，同樣具有疏水基團(tuán)的天然乳清蛋白，能較好地包埋益生菌，保護(hù)菌體活性。通常單一保護(hù)劑不足以幫助菌體抵抗外界惡劣的環(huán)境，復(fù)配保護(hù)劑中各類(lèi)壁材在噴霧干燥中能夠發(fā)揮各自作用，在干燥和保存期間維持較高的細(xì)胞存活率，達(dá)到最佳保護(hù)效果[10]。比如，有些大分子保護(hù)劑通過(guò)將菌體包裹起來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用，并且能增強(qiáng)低分子保護(hù)劑的作用，協(xié)同發(fā)揮作用。肖懷秋等[11]研究發(fā)現(xiàn)，糖類(lèi)與蛋白質(zhì)聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑比單一保護(hù)劑抗熱保護(hù)效果更好，可減輕噴霧干燥對(duì)菌體亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及生物大分子損傷。AGUDELO等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖或海藻糖能提高鼠李糖乳桿菌菌體存活率，而復(fù)合型保護(hù)劑能將菌體存活率提高780倍。

本試驗(yàn)以1株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS08為研究對(duì)象，研究以不同包埋順序配置而成的復(fù)合抗熱保護(hù)劑對(duì)枯草芽孢桿菌噴霧干燥菌體存活影響，通過(guò)菌粉表面形態(tài)的觀察以及一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)驗(yàn)證微生態(tài)制劑的穩(wěn)定性效果，并采用響應(yīng)面法優(yōu)化復(fù)合保護(hù)劑配方，制備高活菌數(shù)、耐保藏的微生態(tài)制劑，為枯草芽孢桿菌的噴霧干燥提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌種及培養(yǎng)基

本研究所用枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)BS08,由福州大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)研究所保藏；菌種活化采用牛肉膏蛋白胨固體斜面培養(yǎng)基，種子培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏5、蛋白胨10、NaCl 5，pH 7.4，固體培養(yǎng)基加入15～20 g瓊脂；發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母浸膏14、無(wú)水葡萄糖14、MgSO41，pH 7.2～7.4。所有培養(yǎng)基配制完成后均于121 ℃滅菌20 min，經(jīng)檢驗(yàn)無(wú)菌后備用。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)材料

海藻糖為食品級(jí)，山東盛源生物科技有限公司；脫脂乳為食品級(jí)，伊利集團(tuán)；蔗糖為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；明膠、阿拉伯膠、黃原膠為分析純，西隴化工股份有限公司。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備

SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；MC-SY1913型電磁爐，中國(guó)美的集團(tuán)；THL-16L型低速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器制造廠(chǎng)；DHG-905AA型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)有限公司；SP-1500型噴霧干燥機(jī)，上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；HH-2型恒溫水浴鍋，金壇市新航儀器廠(chǎng)；QYSW-10B型超純水機(jī)，重慶前沿水處理設(shè)備有限公司；Helios G4 CX型掃描電子顯微鏡，美國(guó) FEI公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌懸液制備及噴霧干燥

枯草芽孢桿菌BS08于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基活化，用接種環(huán)刮取1環(huán)接種至種子液培養(yǎng)基中進(jìn)行種子培養(yǎng)，37 ℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng) 24 h；按5%(體積分?jǐn)?shù))接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min 恒溫培養(yǎng)48 h；將發(fā)酵菌液于5 000 r/min離心20 min，棄上清液，沉淀用等質(zhì)量無(wú)菌生理鹽水重新懸浮，上述操作重復(fù)2次，通過(guò)旋渦振蕩制成菌懸液。將壁材溶解在去離子水中，配制成一定濃度的壁材溶液。經(jīng)過(guò)均質(zhì)機(jī)均質(zhì)15 min，90 ℃水浴加熱5 min，使壁材溶液充分溶解均勻，冷卻至室溫后，將菌懸液和壁材等體積混合均勻，噴霧干燥制備益生菌菌粉。設(shè)定噴霧干燥工藝參數(shù)：進(jìn)料速度500 mL/h，入口溫度150 ℃，出口溫度84 ℃，霧化壓力 0.1 MPa。

1.2.2 微膠囊壁材的選擇

從蛋白質(zhì)類(lèi)壁材、碳水化合物類(lèi)壁材以及親水膠體類(lèi)壁材3類(lèi)壁材中選取脫脂乳、明膠、海藻糖、蔗糖、阿拉伯膠和黃原膠6種壁材作為保護(hù)劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、15%、20%、25%的溶液，與菌懸液混合進(jìn)行噴霧干燥，以未添加抗熱保護(hù)劑作對(duì)照，考察不同保護(hù)劑對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響，以確定3種較優(yōu)壁材。

1.2.3 微膠囊壁材包埋順序的確定

將選擇的3種壁材按不同包埋順序復(fù)配成抗熱保護(hù)劑，與菌液混合進(jìn)行噴霧干燥，測(cè)定噴霧干燥后的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，確定最優(yōu)的復(fù)配方法。

1.2.4 微膠囊穩(wěn)定性評(píng)估

將壁材噴霧干燥后的菌粉在30、37、50、60 ℃ 4個(gè)溫度下進(jìn)行加速貯藏實(shí)驗(yàn)，通過(guò)平板菌落計(jì)數(shù)考察噴霧干燥菌粉的穩(wěn)定性。

1.2.5 掃描電鏡觀察菌粉形貌

采用Helios G4 CX掃描電子顯微鏡，將噴霧干燥菌粉樣品取少許粉末樣品撒于電鏡的樣品蓋上，噴金，于10 kV加速電壓條件下進(jìn)行成像觀察。

1.2.6 噴霧干燥工藝條件的響應(yīng)面優(yōu)化

根據(jù)單因素比較試驗(yàn)結(jié)果，確定研究變量及水平，用Design Expert 12軟件對(duì)變量進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以噴霧干燥后菌粉活菌數(shù)含量為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面分析。對(duì)不同處理方法產(chǎn)生的結(jié)果進(jìn)行分析，并建立二次響應(yīng)面回歸模型，根據(jù)擬合的回歸方程得出最佳工藝參數(shù)，由此確定最優(yōu)響應(yīng)因子水平。最后，基于最佳水平，進(jìn)行驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)，與預(yù)測(cè)值比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑噴霧干燥壁材的選擇

不同保護(hù)劑對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響結(jié)果如圖1所示，蛋白質(zhì)類(lèi)抗熱保護(hù)劑脫脂乳以及明膠噴霧后活菌數(shù)明顯高于對(duì)照組，壁材質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)噴霧干燥后活菌數(shù)均達(dá)到最高，分別為2.65×1012、6.83×1013CFU/g。因此，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的明膠進(jìn)行后續(xù)的復(fù)配及響應(yīng)面優(yōu)化。蛋白質(zhì)類(lèi)保護(hù)劑具有起到促進(jìn)乳狀液形成的作用,能夠?qū)⒕w包裹起來(lái)，在菌體表面形成“隔熱屏障”從而實(shí)現(xiàn)抗熱保護(hù)[12]。

圖1 不同濃度的壁材對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響Fig.1 Effects of different concentrations of wall materials on the viable counts of bacterial powder

由于單一的糖類(lèi)保護(hù)劑難以使發(fā)酵菌液聚集成粉狀，因此以質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%明膠和不同濃度的碳水化合物類(lèi)壁材進(jìn)行復(fù)配，糖類(lèi)保護(hù)劑海藻糖及蔗糖在噴霧干燥后的活菌數(shù)明顯高于對(duì)照組。在不同保護(hù)劑添加量的對(duì)比試驗(yàn)中，10%海藻糖、20%海藻糖和15%蔗糖條件下菌體活菌數(shù)較高，分別為7.27×1013、7.10×1013和3.30×1013CFU/g。通過(guò)檢測(cè)芽孢量對(duì)比其芽孢存活率，20%海藻糖，芽孢存活率達(dá)到了98%以上；而10%海藻糖，芽孢存活率僅為67%。因此，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的海藻糖作為壁材時(shí)，噴霧干燥后的活菌數(shù)可以達(dá)到較優(yōu)值。碳水化合物類(lèi)壁材具有黏度低、固液濃度高、溶解性能好等特點(diǎn)。其對(duì)菌體能實(shí)現(xiàn)抗熱保護(hù)的原因是因?yàn)樘穷?lèi)物質(zhì)能夠通過(guò)結(jié)構(gòu)中的羥基與細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜或蛋白質(zhì)極性基團(tuán)形成眾多氫鍵或在蛋白質(zhì)表面形成水化層，可以在細(xì)胞失水的時(shí)候進(jìn)行水置換，從而保護(hù)細(xì)胞膜及蛋白質(zhì)生物大分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性[13]。如海藻糖與益生菌脂質(zhì)膜上的極性基團(tuán)具有良好的親和性，從而降低干燥時(shí)的相轉(zhuǎn)移溫度，對(duì)益生菌有更好的保護(hù)作用，因而能夠提高益生菌的存活率[14-15]。

膠體類(lèi)抗熱保護(hù)劑黃原膠和阿拉伯膠噴霧后活菌數(shù)隨著使用濃度的變化有著較大差異，15%黃原膠和20%阿拉伯膠噴霧后的活菌數(shù)分別為4.42×1013和6.48×1013CFU/g。然而以黃原膠為壁材時(shí)，集粉率較低，且噴霧后的菌粉黏性較大，不容易分散。因此選擇20%阿拉伯膠進(jìn)行后續(xù)的復(fù)配及響應(yīng)面優(yōu)化。親水膠體類(lèi)壁材具有優(yōu)越的成膜性，在寬pH值范圍的體系中仍具有好的乳液穩(wěn)定性，并且用量少[16]。

2.2 噴霧干燥微膠囊壁材包埋順序的確定

蛋白質(zhì)類(lèi)、糖類(lèi)和親水膠體類(lèi)壁材的抗熱保護(hù)機(jī)制不同，各有優(yōu)越特性，三者聯(lián)用能起到更好的抗熱保護(hù)效果。根據(jù)單因素試驗(yàn)，得出各類(lèi)壁材的最佳使用濃度：明膠25%、阿拉伯膠20%、海藻糖20%。因此選擇明膠、阿拉伯膠、海藻糖聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑，為充分發(fā)揮其保護(hù)效果，進(jìn)一步研究不同的包埋順序配制成的復(fù)合保護(hù)劑對(duì)噴霧干燥后菌粉的保護(hù)效果，根據(jù)由內(nèi)層到外層包埋順序的不同分為4組：A組(先明膠后阿拉伯膠)、B組(先阿拉伯膠后明膠)、C組(明膠+阿拉伯膠+海藻糖)和D組(阿拉伯膠+明膠+海藻糖)，以噴霧干燥后菌粉的活菌數(shù)和穩(wěn)定性為指標(biāo)，以確定最優(yōu)的壁材包埋順序，并通過(guò)掃描電鏡觀察菌粉外觀形貌。

2.2.1 活菌數(shù)測(cè)定

3種壁材按不同包埋順序配制成抗熱保護(hù)劑，與菌液混合進(jìn)行噴霧干燥，測(cè)定噴霧干燥后的活菌數(shù)和芽孢數(shù)，結(jié)果如圖2所示。4組中，C組活菌數(shù)最高，為1.42×1014CFU/g，其次為B、D組，均為1.37×1014CFU/g。3種壁材都具有價(jià)格低廉的優(yōu)點(diǎn)。明膠是一種優(yōu)良的保護(hù)性膠體，也是一種良好的乳化劑和穩(wěn)定劑。通常明膠質(zhì)量濃度越大，陳化溫度越低、pH越接近等電點(diǎn)，明膠越容易形成膠凝網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)且網(wǎng)絡(luò)越致密[17]，試驗(yàn)所用明膠等電點(diǎn)在pH 4.5～5.3。阿拉伯膠能夠在每1個(gè)油滴周?chē)纬杀Ｗo(hù)膜，使乳化液增加穩(wěn)定性，是非常良好的天然水包油型乳化穩(wěn)定劑。阿拉伯膠的自然pH呈弱酸性，在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%時(shí)，pH在4～5，因此與明膠溶液混溶，能夠起到協(xié)同作用，效果更佳。海藻糖化學(xué)結(jié)構(gòu)中的羥基可以極性基團(tuán)形成氫鍵，代替極性基團(tuán)周?chē)鷣G失的水分子，形成水化層，維持生物大分子天然結(jié)構(gòu)與細(xì)胞(器)膜的完整性[18]，但單獨(dú)使用時(shí)無(wú)法有效地包埋菌體，通常與蛋白、膠體等復(fù)配使用，以提高微膠囊膜的致密性[14]。

圖2 不同順序包埋壁材對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of wall materials embedded in different order on the viable counts of bacterial powder

2.2.2 噴霧干燥后菌粉穩(wěn)定性評(píng)估

微生物的失活速率與菌種特性以及所處營(yíng)養(yǎng)條件與溫度有關(guān)，其失活過(guò)程符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)[19-20]，如公式(1)所示。

dN/dt=-kN

(1)

移項(xiàng)積分得：

ln(Nt/N0)=-kt

lgNt=lgN0-kt/2.303

式中：N0，初始活菌數(shù)，CFU/g；Nt，一定時(shí)刻殘存活菌數(shù)，CFU/g；k，失活常數(shù)；t，失活時(shí)間，h。

同時(shí)，加速實(shí)驗(yàn)中的經(jīng)典恒溫法的理論依據(jù)是Arrhenius的指數(shù)定律，其對(duì)數(shù)形式見(jiàn)公式(2)。

lgk=-E/2.303RT+lgA

(2)

式中：A，比例常數(shù)；E，微生物失活所需活化能，4.186 J/mol；T，溫度，K。

在30、37、50、60 ℃ 4個(gè)溫度下將以4種不同包埋順序噴霧干燥所得的菌粉進(jìn)行加速貯藏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。

表2 不同存放溫度下菌粉的穩(wěn)定性Table 2 Stability of bacterial powder at different storage temperatures

將表2數(shù)據(jù)以 lgN-t作圖，并作線(xiàn)性回歸，求出的k值與溫度T作lgk-T圖，得到4個(gè)回歸方程如表3。最終，通過(guò)一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析，可以對(duì)4組菌粉的穩(wěn)定性進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表3 加速貯藏實(shí)驗(yàn)回歸方程Table 3 Regression equation of accelerated storage experiment

由表4可知，當(dāng)3種壁材溶液復(fù)配時(shí)，膠囊中的枯草芽孢桿菌得到了有效的保護(hù)，其中以C組(明膠-阿拉伯膠-海藻糖)菌粉穩(wěn)定性最佳。加速試驗(yàn)表明，若4 ℃存放1年后的活菌數(shù)為1.57×1014CFU/g，數(shù)量級(jí)不變；在25 ℃條件存放1年后活菌數(shù)也僅下降2個(gè)數(shù)量級(jí)。

表4 菌粉儲(chǔ)藏1年活菌數(shù) 單位：CFU/g

2.2.3 掃描電鏡觀察

噴霧干燥后的菌粉在掃描電鏡下觀察到的形貌如圖3所示，從表觀上解釋了不同包埋順序的抗保護(hù)劑的保護(hù)效果。不同的抗熱保護(hù)劑不同，得到的顆粒的形貌也不盡相同。當(dāng)將阿拉伯膠與明膠兩種壁材溶液進(jìn)行復(fù)配時(shí)，得到的菌粉顆粒變形嚴(yán)重，出現(xiàn)凹陷或皺縮的形貌特征，這是由于高溫導(dǎo)致溶質(zhì)在汽化的液滴表面迅速析出，并形成殼層，殼層內(nèi)溶液溫度不斷上升至高溫，使內(nèi)部氣化分子在殼層最薄弱處克服阻力而沖出殼層，外殼產(chǎn)生孔洞皺縮。當(dāng)將阿拉伯膠、明膠與海藻糖3種壁材溶液進(jìn)行復(fù)配時(shí)，如圖3-c和圖3-d所示，菌粉顆粒外觀呈現(xiàn)平滑完整的球形顆粒，僅少量菌粉顆粒因?yàn)楦邷爻霈F(xiàn)孔洞導(dǎo)致內(nèi)容物流出的現(xiàn)象，大部分保持良好完整的形貌特征。可見(jiàn)，海藻糖的加入提高了微膠囊膜的致密性，從而更有效地保護(hù)膠囊中的物質(zhì)不被高溫高壓所破壞。海藻糖是多種生物面臨脫水脅迫時(shí)由機(jī)體分泌的保護(hù)性雙糖[21]，它的保護(hù)機(jī)制主要源于兩點(diǎn)：(1)它可以在生物組織脫水時(shí)替代水分子，保持生物大分子的結(jié)構(gòu)不因脫水而劇變[22]；(2)它在干燥狀態(tài)下具有很高的玻璃態(tài)轉(zhuǎn)化溫度，因此形成的干顆粒通常處于無(wú)定形態(tài)，對(duì)其他處于結(jié)晶態(tài)的糖類(lèi)相比，無(wú)定形態(tài)的高黏度可減少有害的化學(xué)反應(yīng)[21]。但亦有研究指出，當(dāng)海藻糖被用作單一的保護(hù)載體時(shí)，它的保護(hù)作用非常有限[18,23]。因此，通常將海藻糖與其他類(lèi)型的保護(hù)劑聯(lián)用，起到協(xié)同保護(hù)的效果。

a-明膠+阿拉伯膠；b-阿拉伯膠+明膠； c-明膠+阿拉伯膠+海藻糖；d-阿拉伯膠+明膠+海藻糖圖3 不同順序包埋壁材所得菌粉的掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscope (SEM) of bacteria powder by embedding wall materials in different order

2.3 枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑噴霧干燥復(fù)合壁材響應(yīng)面優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 12軟件對(duì)3個(gè)因素分別在3個(gè)水平上進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)，以噴霧干燥菌粉的活菌數(shù)(CFU/g)為響應(yīng)值，對(duì)枯草芽孢桿菌微生態(tài)制劑制備工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，如表5所示。根據(jù)響應(yīng)曲面結(jié)果的方差分析(表6)可知，A2、B2、C2對(duì)菌粉活菌數(shù)的影響極顯著，B、C影響顯著，說(shuō)明壁材中的明膠濃度、阿拉伯膠濃度、海藻糖濃度是噴霧干燥過(guò)程中的重要控制因素。模型F=15.19，P=0.000 8<0.05，表明模型方程顯著；失擬項(xiàng)P=0.631 5>0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明數(shù)據(jù)中無(wú)異常點(diǎn)，無(wú)需引入更高次數(shù)的項(xiàng)，模型適當(dāng)。因素B的P值最小，說(shuō)明阿拉伯膠濃度對(duì)活菌率的影響最顯著，3個(gè)因素對(duì)活菌率影響的次序?yàn)锽>C>A，即阿拉伯膠濃度>海藻糖濃度>明膠濃度。

本模型相關(guān)系數(shù)R2=0.951 3，說(shuō)明因變量與自變量之間的線(xiàn)性關(guān)系顯著，校正相關(guān)系數(shù)R2Adj=0.888 6，說(shuō)明該模型能解釋約88.8%(>80%)響應(yīng)值的變化，進(jìn)一步表明方程的擬合度較好。根據(jù)軟件得出回歸模型的各因素三維響應(yīng)面圖以及等高線(xiàn)圖如圖4可知曲面圖發(fā)生彎曲，因此根據(jù)顯著性檢驗(yàn)與響應(yīng)面圖可以看出，3個(gè)因素對(duì)Y都是非線(xiàn)性的。

表5 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Design and experiment results of Box-Behnken

表6 響應(yīng)曲面結(jié)果的方差分析Table 6 Variance analysis results of response surface

經(jīng)二次回歸擬合后得回歸方程：

活菌數(shù)=-9.944 55×1015+3.973 88×1014A+2.451 53×1014B+2.684 90×1014C+8.550 00×1011AB+1.440 00×1012AC-4.120 00×1011BC-8.663 50×1012A2-6.075 50×1012B2-7.120 50×1012C2

由回歸方程得到預(yù)測(cè)噴霧干燥菌粉最大值為5.985 12×1014CFU/g。得到各因素最佳的質(zhì)量分?jǐn)?shù)配比為明膠(A)26%，阿拉伯膠(B)24%，海藻糖(C)為24%。這與添加單個(gè)保護(hù)劑相比，活菌數(shù)提高了1個(gè)數(shù)量級(jí)；與無(wú)添加任何保護(hù)劑的菌粉活菌數(shù)相比，提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。

a-明膠和阿拉伯膠；b-明膠和海藻糖；c-阿拉伯膠和海藻糖圖4 海藻糖、明膠和阿拉伯膠添加量的交互作用對(duì)活菌數(shù)的影響的響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface plots of interaction between trehalose, gelatin and arabic gum addition on on the viable counts

2.3.2 驗(yàn)證性試驗(yàn)

經(jīng)過(guò)響應(yīng)面分析法優(yōu)化后的工藝條件為：明膠(A)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 26%，阿拉伯膠(B)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%，海藻糖(C)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為24%。預(yù)測(cè)噴霧干燥菌粉最大值為5.98×1014CFU/g?；谧罴压に嚄l件，進(jìn)行3組驗(yàn)證性試驗(yàn)。得到實(shí)際值平均數(shù)為5.80×1014CFU/g，與預(yù)測(cè)值相吻合。

3 結(jié)論

研究結(jié)果表明，蛋白質(zhì)類(lèi)保護(hù)劑、碳水化合物類(lèi)保護(hù)劑和親水膠體類(lèi)保護(hù)劑聯(lián)用作為復(fù)合抗熱保護(hù)劑比單一保護(hù)劑抗熱保護(hù)效果更好，能較好地提高菌體的熱耐受性。同時(shí)，以明膠-阿拉伯膠-海藻糖為包埋順序配制的保護(hù)劑對(duì)枯草芽孢桿菌的保護(hù)效果最好，且通過(guò)穩(wěn)定性評(píng)估，產(chǎn)品在4 ℃環(huán)境中貯藏1年，預(yù)計(jì)活菌數(shù)可保持在1014CFU/g以上，數(shù)量級(jí)不變。采用中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面優(yōu)化技術(shù)對(duì)復(fù)合抗熱保護(hù)劑配方進(jìn)行了優(yōu)化，獲得了優(yōu)化的抗熱保護(hù)劑組分，即明膠添加量26%、阿拉伯膠24%和海藻糖添加量24%。在此最優(yōu)條件下，活菌數(shù)為5.80×1014CFU/g，與無(wú)添加任何保護(hù)劑相比，提高了3個(gè)數(shù)量級(jí)。