重組酶聚合酶擴增反應(yīng)結(jié)合側(cè)流層析試紙條技術(shù)快速鑒別大西洋鱈魚制品真?zhèn)?/h1>
2022-09-16 13:40:16王慧芳喻勇新李晨虹陳文雋凌嵐馨周穎
食品與發(fā)酵工業(yè) 2022年17期
王慧芳，喻勇新,2，李晨虹，陳文雋，凌嵐馨，周穎
1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306) 3(上海海洋大學(xué) 環(huán)境DNA技術(shù)與水生態(tài)健康評估工程中心，上海，201306) 4(上海海洋大學(xué) 海洋動物系統(tǒng)分類與進化上海高校重點實驗室，上海，201306)
大西洋鱈(Gadusmorhua)是鱈形目鱈科鱈屬魚類，作為一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、肉質(zhì)致密的水產(chǎn)品廣受歡迎，銷量呈逐年遞增的趨勢。鱈形目魚類品種繁多，從感官特點上難以分辨其捕撈海域、來源和種類，而不同的魚類品種市場價格差異大，造成以次充好或標(biāo)識錯誤的現(xiàn)象時有發(fā)生[1]。曾多次出現(xiàn)過用“油魚”即棘鱗蛇鯖(Ruvettuspretiosus)和異鱗蛇鯖(Lepidocybiumflavobrunneum)冒充“大西洋鱈魚”的產(chǎn)品進行販賣，導(dǎo)致消費者食用后出現(xiàn)過敏、腹瀉的情況[2]。目前，我國鱈魚成分鑒定標(biāo)準(zhǔn)或真?zhèn)螜z測方法主要有2種，均基于實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技術(shù)[2-3]。但是，該方法需要在實驗環(huán)境分區(qū)的條件下進行，對實驗器皿、人員操作、防污染措施都有較高的要求[4]，且依賴復(fù)雜精密的溫控設(shè)備，成本高，在一定程度上限制了它的應(yīng)用場景，無法達(dá)到現(xiàn)場快速檢測的目的[5]。因此，建立一種靈敏、操作簡便、特異性強，能夠快速檢測大西洋鱈魚及其相關(guān)制品的方法迫在眉睫。
本文首次研究利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)快速鑒定大西洋鱈魚及其制品的方法。RPA技術(shù)是模擬DNA復(fù)制機制，用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程，實現(xiàn)了在恒定適宜溫度(37～56 ℃)下核酸的快速(15～20 min)擴增[6]。作為一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)，RPA技術(shù)與PCR技術(shù)具有相似的功能，都有較強的靈敏性和特異性，除此之外RPA技術(shù)有反應(yīng)時間短，操作簡便，不需精密儀器等優(yōu)點[7-8]。自2006年RPA技術(shù)被發(fā)明后，已廣泛應(yīng)用于有害微生物檢測、病毒檢測以及臨床診斷等重要領(lǐng)域，也有應(yīng)用于畜禽肉類檢測上的報道[9-10]，但目前還沒有應(yīng)用RPA技術(shù)檢測水產(chǎn)品真?zhèn)蔚难芯?。本研究將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)(lateral flow dipstick,LFD)相結(jié)合實現(xiàn)檢測結(jié)果可視化，其原理是因RPA-LFD體系中存在核酸外切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ，NFO)、5′端帶有熒光FAM基團的探針以及帶有生物素標(biāo)記的反向引物[11]，使得雜交擴增出的產(chǎn)物帶有雙標(biāo)記。將稀釋后的產(chǎn)物滴加在LFD試紙條上，雙標(biāo)產(chǎn)物會與試紙條抗FAM抗體結(jié)合，形成三元復(fù)合物，當(dāng)其流經(jīng)檢測線時，會與檢測線上的生物素抗體結(jié)合顯色，可以根據(jù)檢測線的顯色情況判斷檢測樣品的真?zhèn)蝃12]。而未雜交的產(chǎn)物與LFD試紙條上的抗FAM抗體結(jié)合，形成不含有生物素的兩元復(fù)合物，與質(zhì)控線上的抗FAM抗體的抗體結(jié)合顯色[13]。
本研究基于RPA-LFD技術(shù)建立了針對大西洋鱈魚現(xiàn)場快速檢測的方法，具有特異性高、靈敏度強、操作簡便、結(jié)果可視等優(yōu)點，為大西洋鱈魚的現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
大西洋鱈、狹鱈(Theragrachalcogramma)、南極犬牙魚(Dissostichuseleginoides)、異鱗蛇鯖、馬舌鰈(Reinhardtiushippoglossoides)等冷凍產(chǎn)品，京東超市及上海市農(nóng)貿(mào)市場。Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(Sangon)，上海生工生物工程有限公司；DNA恒速快速擴增試劑盒及HybriDetect試紙條、DNA恒溫快速擴增WLN8230KIT試劑盒、超快速核酸WLR8203釋放劑，濰坊安普未來生物科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
Vortex-2漩渦混勻儀，上海滬析實業(yè)有限公司；NanoDrop3300熒光分光光度計，賽默飛世爾科技公司；Centrifuge 5430小型臺式高速冷凍離心機，Eppendorf艾本德；Light Cycler 480實時熒光PCR儀，瑞士Hoffmann-La Roche有限公司。
1.3 樣品DNA提取
利用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(Sangon，B518 251-0050)提取DNA，取4條大西洋鱈的魚肉組織各25 mg以及狹鱈、南極犬牙魚、異鱗蛇鯖、馬舌鰈的魚肉組織各25 mg剪碎置于1.5 mL的離心管中，加入180 μL的Buffer ACL和20 μL的蛋白酶K溶液，振蕩混勻置于56 ℃水浴下5 h使細(xì)胞裂解。隨后加入200 μL Buffer CL和200 μL無水乙醇充分顛倒混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱收集管中，靜置2 min，以10 000 r/min室溫離心1 min，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW1 solution，以10 000 r/min室溫離心30 s，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW2 solution，以10 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱重新放回收集管中，以12 000 r/min室溫離心2 min,去殘留的CW2 solution。最后取出吸附柱，放入1.5 mL離心管中，加入150 μL CE Buffer靜置3 min后以12 000 r/min室溫離心2 min，收集DNA溶液并按照CL3036～CL3043對所提取的基因組DNA進行編號。用NanoDrop3300熒光分光光度計測定樣品的DNA濃度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 模板DNA的鑒定
利用MiFish引物[14-15]，序列如表1所示，對樣品DNA線粒體基因組上的12S區(qū)域進行PCR擴增，并將產(chǎn)物進行一代測序，測序結(jié)果與GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的物種序列進行BLAST比對，鑒定樣品的物種種類。鑒定結(jié)果為：CL3036～CL3039均為大西洋鱈魚，CL3040為狹鱈魚，CL3041為南極犬牙魚，CL3042為異鱗蛇鯖，CL3043為馬舌鰈。
表1 MiFish引物序列信息Table 1 Sequences information of the MiFish primers
1.5 RPA-LFD引物和探針的設(shè)計
根據(jù)我國進出口市場以及大型水產(chǎn)品交易市場的調(diào)研結(jié)果，選擇異鱗蛇鯖、小鱗犬牙南極魚、莫氏犬牙南極魚、裸蓋魚、馬舌鰈等常用來冒充大西洋鱈魚的5種水產(chǎn)品品種，從GenBank上下載5種魚類的線粒體基因組序列(表2)，利用PrimedRPA軟件進行初步比對，篩選出基因序列中同源性相對較高的保守區(qū)域，再根據(jù)RPA引物的設(shè)計原則，利用MEGA-X工具和人工篩選，設(shè)計針對大西洋鱈魚的高特異性引物及探針。其中下游引物5′端帶有生物素標(biāo)記，探針5′端用FAM基團修飾，nfo的識別位點用dSpacer(四氫呋喃，THF)修飾，3′末端用C3-Spacer標(biāo)記。設(shè)計好的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表3。
表2 大西洋鱈魚和常見冒充鱈魚的魚類Table 2 Atlantic cod and other popular species used for adulterated cod products
表3 大西洋鱈魚RPA-LFD擴增引物和探針Table 3 RPA-LFD amplifying primers and probes for Gadus morhua
1.6 RPA-LFD反應(yīng)條件的確立
以拷貝數(shù)為103拷貝/μL的CL3036為大西洋鱈魚DNA擴增模板，確定RPA-LFD的擴增體系。根據(jù)DNA恒溫快速擴增試劑盒的操作說明書，配制含有A buffer 29.4 μL、10 μmol/L的上下游引物各2 μL、10 μmol/L的探針0.6 μL和DNA模板2μL的體系，將其振蕩混勻加入B buffer 2.5 μL及滅菌去離子水11.5 μL構(gòu)建50 μL的RPA反應(yīng)體系，在38 ℃金屬浴反應(yīng)12 min。將反應(yīng)產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍，用帶有抗FAM和Biotin標(biāo)記的LFD試紙條對稀釋后的產(chǎn)物進行檢測。LFD試紙條上的質(zhì)控線和檢測線均有條帶即為陽性擴增，僅質(zhì)控線有條帶為陰性擴增，若質(zhì)控線無條帶則實驗結(jié)果無效。
1.7 大西洋鱈魚RPA-LFD引物及探針篩選
以CL3036大西洋鱈魚為陽性對照，CL3042異鱗蛇鯖為陰性對照，滅菌去離子水為空白對照，利用DNA恒溫快速擴增試劑盒篩選大西洋鱈魚RPA-LFD的最佳引物及探針。配制50 μL RPA體系，在38 ℃金屬浴反應(yīng)12 min，用LFD試紙條對稀釋后的產(chǎn)物進行檢測。根據(jù)已知擴增樣品的物種信息判斷LFD試紙條檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，篩選出可以特異性擴增大西洋鱈魚的引物及探針。
1.8 RPA-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化
針對不同的目標(biāo)物種所設(shè)計的引物和探針，RPA-LFD最佳反應(yīng)溫度和時間均有差異[16]。本實驗以大西洋鱈魚CL3036的基因組DNA作為陽性模板，以CL3042的基因組DNA為陰性模板，分別配制出5組50 μL的RPA體系，將其靜置于36、38、40、44、48 ℃的金屬浴中反應(yīng)12 min，將擴增產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍后滴加在LFD試紙條上，5 min后觀察條帶顯色情況并拍照記錄，確定最佳反應(yīng)溫度。在最優(yōu)反應(yīng)溫度下，以大西洋鱈魚CL3036的基因組DNA作為陽性模板，以CL3042的基因組DNA為陰性模板，設(shè)置梯度反應(yīng)時間：8、10、12、14、16 min。按照RPA-LFD實驗步驟，將RPA體系恒溫孵育相應(yīng)時間，根據(jù)LFD試紙條顯色情況，確定最佳反應(yīng)時間[17]。
1.9 RPA-LFD特異性的測定
在最佳反應(yīng)條件下，以CL3036～CL3043的基因組DNA為模板，滅菌去離子水為空白對照，進行RPA-LFD擴增檢測，驗證大西洋鱈RPA-LFD檢測方法的特異性。
1.10 現(xiàn)場快速檢測市售“鱈魚”制品
利用DNA恒溫快速擴增試劑盒對20份市售帶有“鱈”字的水產(chǎn)品進行RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測，鑒別其是否為大西洋鱈。在檢測現(xiàn)場取魚肉組織30 mg左右，將其剪碎研磨至勻漿狀，取20 μL的組織樣與40 μL的超快速核酸釋放劑振蕩混勻，用恒溫可調(diào)溫式保溫墊作為現(xiàn)場實驗簡易熱量來源裝置，將其溫度調(diào)節(jié)到一檔：35～40 ℃，將組織樣與快速核酸釋放劑混合液靜置于保溫杯墊上5 min，使樣品DNA快速釋放。取混合液中的上清液2 μL作為DNA模板，配成50 μL的RPA體系。隨后將保溫墊溫度調(diào)節(jié)到二檔40～45 ℃，將50 μL的RPA體系靜置于保溫杯墊上反應(yīng)12 min，反應(yīng)產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍后滴加在LFD試紙條進行檢測?，F(xiàn)場快速檢測結(jié)果與PCR擴增后的一代測序結(jié)果進行比對，驗證RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2 結(jié)果與分析
2.1 RPA-LFD最佳引物和探針的確定
根據(jù)RPA引物和探針的設(shè)計原則，針對大西洋鱈魚ND2保守區(qū)設(shè)計了2對引物及對應(yīng)的探針，并以CL3036標(biāo)準(zhǔn)DNA為陽性模板，CL3042標(biāo)準(zhǔn)DNA為陰性模板，dd雙蒸水為空白對照分別用2組引物及探針進行RPA-LFD擴增檢測，結(jié)果如圖1所示，第一對引物和探針測試結(jié)果為CL3036陽性、CL3042及空白對照為陰性，檢測結(jié)果符合實驗預(yù)期。利用第二對引物和探針進行擴增的CL3042陰性對照組出現(xiàn)假陽性，與實驗預(yù)期不符。由此確定上游引物F1：5′-GCTGAATAATCCTTGTAATGCAATTTAA-3′、下游引物R1：5′-(Biotin)-CTAAAGAAAGAAGAATTATTGGGGTGATT-3′及探針T1：5′-(FAM)-AACTTTCTCAACTTTTATAATTTTTAAAACTAATT(dSpacer)CTTCTACCACGGTAAA-(C3 spacer)-3′。
圖1 引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Result of primer and probe screening注：1～3分別為用引物F1、R1、探針T1對CL3036、CL3042和 PCR水進行的RPA-LFD擴增實驗結(jié)果圖；4～6分別為用引物 F2、R2、探針T2對CL3036、CL3042和PCR水進行的 RPA-LFD擴增實驗結(jié)果圖
2.2 RPA-LFD檢測反應(yīng)條件的優(yōu)化
反應(yīng)溫度優(yōu)化實驗的結(jié)果如圖2所示，反應(yīng)溫度過高使陰性樣品產(chǎn)生陽性條帶影響實驗結(jié)果，溫度過低條帶顯色不明顯，根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳溫度為44 ℃。
圖2 不同培養(yǎng)溫度下的實驗結(jié)果Fig.2 Results of different incubation temperature注：A1～A5分別為CL3036在不同的溫度下的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，A1-36 ℃；A2-38 ℃；A3-40 ℃；A4-44 ℃；A5-48 ℃； B1～B5分別為CL3042在不同的溫度下的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，B1-36 ℃；B2-38 ℃；B3-40 ℃；B4-44 ℃；B5-48 ℃； A6、B6為空白對照組
反應(yīng)時間優(yōu)化實驗的結(jié)果如圖3所示，反應(yīng)時間低于12 min會反應(yīng)不完全導(dǎo)致顯色不明顯，超過16 min會出現(xiàn)假陽性，故實驗最佳時間確定為14 min。
圖3 不同培養(yǎng)時間下的實驗結(jié)果Fig.3 Results of different incubation time注：A1～A5分別為CL3036在不同的反應(yīng)時間下RPA-LFD 實驗結(jié)果圖，A1-8 min，A2-10 min，A3-12 min， A4-14 min，A5-16 min，A6-空白對照組；B1～B5分別 為CL3042在不同的反應(yīng)時間下進行的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，B1-8 min，B2-10 min，B3-12 min，B4-14 min， B5-16 min，B6-空白對照組
2.3 RPA-LFD特異性實驗
對CL3036～CL3039大西洋鱈魚、CL3040狹鱈魚、CL3041南極犬牙魚、CL3042異鱗蛇鯖、CL3043馬舌鰈等8種水產(chǎn)品以及滅菌去離子水作為空白對照進行RPA-LFD擴增檢測(圖4)。結(jié)果表明，CL3036～CL3039出現(xiàn)陽性反應(yīng)，其他樣品均為陰性，檢測結(jié)果與PCR擴增測序結(jié)果一致，證明本研究建立的大西洋鱈魚RPA-LFD檢測方法特異性良好。
圖4 引物探針的特異性檢測結(jié)果Fig.4 Results of specific test of primer and probe注：1～4-大西洋鱈魚；5-狹鱈魚；6-南極犬牙魚； 7-異鱗蛇鯖；8-馬舌鰈；9-滅菌去離子水
2.4 現(xiàn)場實時檢測市售“鱈魚”制品結(jié)果
對20份市售帶有“鱈”字的水產(chǎn)品進行RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測，鑒定其是否為大西洋鱈魚。檢測樣品中15份為大西洋鱈魚，剩余5份非大西洋鱈魚制品。隨后將20份樣品按序編號，利用PCR擴增進行一代測序鑒定其物種。RPA-LFD檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，見表4。
表4 野外實時檢測市售“鱈魚”類及其他魚類制品Table 4 Real-time testing on “cod” and other fish products sold in the market in the field
3 討論
近年來，曾多次出現(xiàn)過將“油魚”棘鱗蛇鯖和異鱗蛇鯖冠以“大西洋鱈魚”的名字販賣，消費者購買假鱈魚食用后，發(fā)生腹瀉的事件時有發(fā)生[18-19]。林霖等[20]利用SN/T 3589.7—2013對常見的鱈魚制品進行檢測，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)由于需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線容易出現(xiàn)假陽性，并且無法應(yīng)用于抽取的全部鱈魚制品，反應(yīng)過程也需要PCR儀等高精密儀器無法做到現(xiàn)場實時快速檢測。此外，李新光等[21]、王敏等[22]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)，對市場上隨機抽取的鱈魚制品進行檢測，結(jié)果顯示該方法可以檢測出眾多鱈魚品種，如大西洋鱈魚、格陵蘭鱈魚(Gadusogac)、狹鱈、綠青鱈(Pollachiusvirens)等。該方法具有檢測范圍廣、操作簡單、鑒定效率高等優(yōu)點，但存在混合制品獲得單一的DNA條形碼片段難度大，檢驗操作復(fù)雜，結(jié)果分析難等缺點。SAULL等[23]基于大西洋鱈魚的cytb基因設(shè)計出4對LAMP引物,在63 ℃下恒溫擴增60 min，檢測出大西洋鱈魚。該方法特異性強、靈敏度高但是檢驗所需的引物設(shè)計難度大，反應(yīng)時間較長，應(yīng)用于鱈魚制品的現(xiàn)場快速檢測存在一定難度[24]。所以目前已有的檢測方法由于需要大型精密實驗儀器，實驗操作復(fù)雜或?qū)嶒灜h(huán)境要求高，反應(yīng)時間長等原因均無法在現(xiàn)場完成對大西洋鱈魚的實時檢測。
而RPA技術(shù)作為新型核酸擴增技術(shù)，具有靈敏性強、效率高、成本低、易操作等特點。研究人員只需要根據(jù)目標(biāo)物種的核酸序列設(shè)計并合成RPA上、下游引物及探針，就可以利用RPA試劑盒進行RPA反應(yīng)。本文所提出的RPA-LFD實驗方法，是將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，做到了在短時間內(nèi)結(jié)果可視，不需要PCR儀等精密儀器，在控溫式保溫杯內(nèi)即可完成擴增反應(yīng)，具有靈敏性強、特異性高、易操作、能夠現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點[25-26]。RPA試驗的關(guān)鍵節(jié)點為設(shè)計高特異性的引物和探針，大多數(shù)常用的PCR引物、探針不適合用于RPA反應(yīng)體系。目前，獲得一對“好”引物的具體規(guī)則還未完全明確，也沒有專門的設(shè)計軟件可供使用，因此通過試驗來篩選最佳引物是不可缺少的環(huán)節(jié)。本試驗結(jié)果表明溫度和反應(yīng)時間也是重要的試驗條件，溫度過高、過低，或者反應(yīng)時間過長、過短均可能對整個實驗造成根本性的影響，因此，也需要對反應(yīng)條件和體系進行優(yōu)化，以達(dá)到最好的檢測效果。
4 結(jié)論
綜上，本研究所建立的大西洋鱈魚RPA-LFD方法可以準(zhǔn)確、高效地檢測出大西洋鱈魚的真?zhèn)?。該方法為大西洋鱈魚的現(xiàn)場快速檢測提供了科學(xué)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景，為其他水產(chǎn)品現(xiàn)場快速檢測提供了新思路。RPA-LFD技術(shù)填補了傳統(tǒng)檢測技術(shù)依賴精密實驗儀器、無法完成現(xiàn)場快速檢測的技術(shù)空缺，在現(xiàn)場快速檢測和低資源環(huán)境檢測領(lǐng)域存在巨大優(yōu)勢。但RPA技術(shù)存在引物和探針設(shè)計難度大，沒有專門的設(shè)計軟件，實驗條件需要人為優(yōu)化等局限。這需要科研人員的共同努力，不斷完善RPA研究體系，為快檢領(lǐng)域提供技術(shù)支持。未來RPA技術(shù)在突發(fā)疾病病原檢測、食品質(zhì)量安全檢測、低資源環(huán)境檢測領(lǐng)域會有新的突破，將會得到廣泛的應(yīng)用和推廣。
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王慧芳，喻勇新,2，李晨虹，陳文雋，凌嵐馨，周穎
1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，上海，201306) 3(上海海洋大學(xué) 環(huán)境DNA技術(shù)與水生態(tài)健康評估工程中心，上海，201306) 4(上海海洋大學(xué) 海洋動物系統(tǒng)分類與進化上海高校重點實驗室，上海，201306)
大西洋鱈(Gadusmorhua)是鱈形目鱈科鱈屬魚類，作為一種蛋白質(zhì)含量高、脂肪含量低、肉質(zhì)致密的水產(chǎn)品廣受歡迎，銷量呈逐年遞增的趨勢。鱈形目魚類品種繁多，從感官特點上難以分辨其捕撈海域、來源和種類，而不同的魚類品種市場價格差異大，造成以次充好或標(biāo)識錯誤的現(xiàn)象時有發(fā)生[1]。曾多次出現(xiàn)過用“油魚”即棘鱗蛇鯖(Ruvettuspretiosus)和異鱗蛇鯖(Lepidocybiumflavobrunneum)冒充“大西洋鱈魚”的產(chǎn)品進行販賣，導(dǎo)致消費者食用后出現(xiàn)過敏、腹瀉的情況[2]。目前，我國鱈魚成分鑒定標(biāo)準(zhǔn)或真?zhèn)螜z測方法主要有2種，均基于實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)技術(shù)[2-3]。但是，該方法需要在實驗環(huán)境分區(qū)的條件下進行，對實驗器皿、人員操作、防污染措施都有較高的要求[4]，且依賴復(fù)雜精密的溫控設(shè)備，成本高，在一定程度上限制了它的應(yīng)用場景，無法達(dá)到現(xiàn)場快速檢測的目的[5]。因此，建立一種靈敏、操作簡便、特異性強，能夠快速檢測大西洋鱈魚及其相關(guān)制品的方法迫在眉睫。
本文首次研究利用重組酶聚合酶擴增技術(shù)(recombinase polymerase amplification，RPA)快速鑒定大西洋鱈魚及其制品的方法。RPA技術(shù)是模擬DNA復(fù)制機制，用重組酶、單鏈結(jié)合蛋白和DNA聚合酶代替?zhèn)鹘y(tǒng)PCR的熱循環(huán)解鏈過程，實現(xiàn)了在恒定適宜溫度(37～56 ℃)下核酸的快速(15～20 min)擴增[6]。作為一種新型的恒溫核酸擴增技術(shù)，RPA技術(shù)與PCR技術(shù)具有相似的功能，都有較強的靈敏性和特異性，除此之外RPA技術(shù)有反應(yīng)時間短，操作簡便，不需精密儀器等優(yōu)點[7-8]。自2006年RPA技術(shù)被發(fā)明后，已廣泛應(yīng)用于有害微生物檢測、病毒檢測以及臨床診斷等重要領(lǐng)域，也有應(yīng)用于畜禽肉類檢測上的報道[9-10]，但目前還沒有應(yīng)用RPA技術(shù)檢測水產(chǎn)品真?zhèn)蔚难芯?。本研究將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)(lateral flow dipstick,LFD)相結(jié)合實現(xiàn)檢測結(jié)果可視化，其原理是因RPA-LFD體系中存在核酸外切酶Ⅳ(endonuclease Ⅳ，NFO)、5′端帶有熒光FAM基團的探針以及帶有生物素標(biāo)記的反向引物[11]，使得雜交擴增出的產(chǎn)物帶有雙標(biāo)記。將稀釋后的產(chǎn)物滴加在LFD試紙條上，雙標(biāo)產(chǎn)物會與試紙條抗FAM抗體結(jié)合，形成三元復(fù)合物，當(dāng)其流經(jīng)檢測線時，會與檢測線上的生物素抗體結(jié)合顯色，可以根據(jù)檢測線的顯色情況判斷檢測樣品的真?zhèn)蝃12]。而未雜交的產(chǎn)物與LFD試紙條上的抗FAM抗體結(jié)合，形成不含有生物素的兩元復(fù)合物，與質(zhì)控線上的抗FAM抗體的抗體結(jié)合顯色[13]。
本研究基于RPA-LFD技術(shù)建立了針對大西洋鱈魚現(xiàn)場快速檢測的方法，具有特異性高、靈敏度強、操作簡便、結(jié)果可視等優(yōu)點，為大西洋鱈魚的現(xiàn)場快速檢測提供了技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
大西洋鱈、狹鱈(Theragrachalcogramma)、南極犬牙魚(Dissostichuseleginoides)、異鱗蛇鯖、馬舌鰈(Reinhardtiushippoglossoides)等冷凍產(chǎn)品，京東超市及上海市農(nóng)貿(mào)市場。Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(Sangon)，上海生工生物工程有限公司；DNA恒速快速擴增試劑盒及HybriDetect試紙條、DNA恒溫快速擴增WLN8230KIT試劑盒、超快速核酸WLR8203釋放劑，濰坊安普未來生物科技有限公司。
1.2 儀器與設(shè)備
Vortex-2漩渦混勻儀，上海滬析實業(yè)有限公司；NanoDrop3300熒光分光光度計，賽默飛世爾科技公司；Centrifuge 5430小型臺式高速冷凍離心機，Eppendorf艾本德；Light Cycler 480實時熒光PCR儀，瑞士Hoffmann-La Roche有限公司。
1.3 樣品DNA提取
利用Ezup柱式動物基因組DNA抽提試劑盒(Sangon，B518 251-0050)提取DNA，取4條大西洋鱈的魚肉組織各25 mg以及狹鱈、南極犬牙魚、異鱗蛇鯖、馬舌鰈的魚肉組織各25 mg剪碎置于1.5 mL的離心管中，加入180 μL的Buffer ACL和20 μL的蛋白酶K溶液，振蕩混勻置于56 ℃水浴下5 h使細(xì)胞裂解。隨后加入200 μL Buffer CL和200 μL無水乙醇充分顛倒混勻，轉(zhuǎn)入吸附柱收集管中，靜置2 min，以10 000 r/min室溫離心1 min，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW1 solution，以10 000 r/min室溫離心30 s，倒掉收集管中的廢液。再將吸附柱放回收集管中，加入500 μL CW2 solution，以10 000 r/min離心30 s，倒掉收集管中的廢液。將吸附柱重新放回收集管中，以12 000 r/min室溫離心2 min,去殘留的CW2 solution。最后取出吸附柱，放入1.5 mL離心管中，加入150 μL CE Buffer靜置3 min后以12 000 r/min室溫離心2 min，收集DNA溶液并按照CL3036～CL3043對所提取的基因組DNA進行編號。用NanoDrop3300熒光分光光度計測定樣品的DNA濃度，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.4 模板DNA的鑒定
利用MiFish引物[14-15]，序列如表1所示，對樣品DNA線粒體基因組上的12S區(qū)域進行PCR擴增，并將產(chǎn)物進行一代測序，測序結(jié)果與GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)上的物種序列進行BLAST比對，鑒定樣品的物種種類。鑒定結(jié)果為：CL3036～CL3039均為大西洋鱈魚，CL3040為狹鱈魚，CL3041為南極犬牙魚，CL3042為異鱗蛇鯖，CL3043為馬舌鰈。
表1 MiFish引物序列信息Table 1 Sequences information of the MiFish primers
1.5 RPA-LFD引物和探針的設(shè)計
根據(jù)我國進出口市場以及大型水產(chǎn)品交易市場的調(diào)研結(jié)果，選擇異鱗蛇鯖、小鱗犬牙南極魚、莫氏犬牙南極魚、裸蓋魚、馬舌鰈等常用來冒充大西洋鱈魚的5種水產(chǎn)品品種，從GenBank上下載5種魚類的線粒體基因組序列(表2)，利用PrimedRPA軟件進行初步比對，篩選出基因序列中同源性相對較高的保守區(qū)域，再根據(jù)RPA引物的設(shè)計原則，利用MEGA-X工具和人工篩選，設(shè)計針對大西洋鱈魚的高特異性引物及探針。其中下游引物5′端帶有生物素標(biāo)記，探針5′端用FAM基團修飾，nfo的識別位點用dSpacer(四氫呋喃，THF)修飾，3′末端用C3-Spacer標(biāo)記。設(shè)計好的引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成，探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，序列見表3。
表2 大西洋鱈魚和常見冒充鱈魚的魚類Table 2 Atlantic cod and other popular species used for adulterated cod products
表3 大西洋鱈魚RPA-LFD擴增引物和探針Table 3 RPA-LFD amplifying primers and probes for Gadus morhua
1.6 RPA-LFD反應(yīng)條件的確立
以拷貝數(shù)為103拷貝/μL的CL3036為大西洋鱈魚DNA擴增模板，確定RPA-LFD的擴增體系。根據(jù)DNA恒溫快速擴增試劑盒的操作說明書，配制含有A buffer 29.4 μL、10 μmol/L的上下游引物各2 μL、10 μmol/L的探針0.6 μL和DNA模板2μL的體系，將其振蕩混勻加入B buffer 2.5 μL及滅菌去離子水11.5 μL構(gòu)建50 μL的RPA反應(yīng)體系，在38 ℃金屬浴反應(yīng)12 min。將反應(yīng)產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍，用帶有抗FAM和Biotin標(biāo)記的LFD試紙條對稀釋后的產(chǎn)物進行檢測。LFD試紙條上的質(zhì)控線和檢測線均有條帶即為陽性擴增，僅質(zhì)控線有條帶為陰性擴增，若質(zhì)控線無條帶則實驗結(jié)果無效。
1.7 大西洋鱈魚RPA-LFD引物及探針篩選
以CL3036大西洋鱈魚為陽性對照，CL3042異鱗蛇鯖為陰性對照，滅菌去離子水為空白對照，利用DNA恒溫快速擴增試劑盒篩選大西洋鱈魚RPA-LFD的最佳引物及探針。配制50 μL RPA體系，在38 ℃金屬浴反應(yīng)12 min，用LFD試紙條對稀釋后的產(chǎn)物進行檢測。根據(jù)已知擴增樣品的物種信息判斷LFD試紙條檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，篩選出可以特異性擴增大西洋鱈魚的引物及探針。
1.8 RPA-LFD反應(yīng)條件的優(yōu)化
針對不同的目標(biāo)物種所設(shè)計的引物和探針，RPA-LFD最佳反應(yīng)溫度和時間均有差異[16]。本實驗以大西洋鱈魚CL3036的基因組DNA作為陽性模板，以CL3042的基因組DNA為陰性模板，分別配制出5組50 μL的RPA體系，將其靜置于36、38、40、44、48 ℃的金屬浴中反應(yīng)12 min，將擴增產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍后滴加在LFD試紙條上，5 min后觀察條帶顯色情況并拍照記錄，確定最佳反應(yīng)溫度。在最優(yōu)反應(yīng)溫度下，以大西洋鱈魚CL3036的基因組DNA作為陽性模板，以CL3042的基因組DNA為陰性模板，設(shè)置梯度反應(yīng)時間：8、10、12、14、16 min。按照RPA-LFD實驗步驟，將RPA體系恒溫孵育相應(yīng)時間，根據(jù)LFD試紙條顯色情況，確定最佳反應(yīng)時間[17]。
1.9 RPA-LFD特異性的測定
在最佳反應(yīng)條件下，以CL3036～CL3043的基因組DNA為模板，滅菌去離子水為空白對照，進行RPA-LFD擴增檢測，驗證大西洋鱈RPA-LFD檢測方法的特異性。
1.10 現(xiàn)場快速檢測市售“鱈魚”制品
利用DNA恒溫快速擴增試劑盒對20份市售帶有“鱈”字的水產(chǎn)品進行RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測，鑒別其是否為大西洋鱈。在檢測現(xiàn)場取魚肉組織30 mg左右，將其剪碎研磨至勻漿狀，取20 μL的組織樣與40 μL的超快速核酸釋放劑振蕩混勻，用恒溫可調(diào)溫式保溫墊作為現(xiàn)場實驗簡易熱量來源裝置，將其溫度調(diào)節(jié)到一檔：35～40 ℃，將組織樣與快速核酸釋放劑混合液靜置于保溫杯墊上5 min，使樣品DNA快速釋放。取混合液中的上清液2 μL作為DNA模板，配成50 μL的RPA體系。隨后將保溫墊溫度調(diào)節(jié)到二檔40～45 ℃，將50 μL的RPA體系靜置于保溫杯墊上反應(yīng)12 min，反應(yīng)產(chǎn)物用無菌去離子水稀釋50倍后滴加在LFD試紙條進行檢測?，F(xiàn)場快速檢測結(jié)果與PCR擴增后的一代測序結(jié)果進行比對，驗證RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。
2 結(jié)果與分析
2.1 RPA-LFD最佳引物和探針的確定
根據(jù)RPA引物和探針的設(shè)計原則，針對大西洋鱈魚ND2保守區(qū)設(shè)計了2對引物及對應(yīng)的探針，并以CL3036標(biāo)準(zhǔn)DNA為陽性模板，CL3042標(biāo)準(zhǔn)DNA為陰性模板，dd雙蒸水為空白對照分別用2組引物及探針進行RPA-LFD擴增檢測，結(jié)果如圖1所示，第一對引物和探針測試結(jié)果為CL3036陽性、CL3042及空白對照為陰性，檢測結(jié)果符合實驗預(yù)期。利用第二對引物和探針進行擴增的CL3042陰性對照組出現(xiàn)假陽性，與實驗預(yù)期不符。由此確定上游引物F1：5′-GCTGAATAATCCTTGTAATGCAATTTAA-3′、下游引物R1：5′-(Biotin)-CTAAAGAAAGAAGAATTATTGGGGTGATT-3′及探針T1：5′-(FAM)-AACTTTCTCAACTTTTATAATTTTTAAAACTAATT(dSpacer)CTTCTACCACGGTAAA-(C3 spacer)-3′。
圖1 引物探針篩選結(jié)果Fig.1 Result of primer and probe screening注：1～3分別為用引物F1、R1、探針T1對CL3036、CL3042和 PCR水進行的RPA-LFD擴增實驗結(jié)果圖；4～6分別為用引物 F2、R2、探針T2對CL3036、CL3042和PCR水進行的 RPA-LFD擴增實驗結(jié)果圖
2.2 RPA-LFD檢測反應(yīng)條件的優(yōu)化
反應(yīng)溫度優(yōu)化實驗的結(jié)果如圖2所示，反應(yīng)溫度過高使陰性樣品產(chǎn)生陽性條帶影響實驗結(jié)果，溫度過低條帶顯色不明顯，根據(jù)實驗結(jié)果確定最佳溫度為44 ℃。
圖2 不同培養(yǎng)溫度下的實驗結(jié)果Fig.2 Results of different incubation temperature注：A1～A5分別為CL3036在不同的溫度下的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，A1-36 ℃；A2-38 ℃；A3-40 ℃；A4-44 ℃；A5-48 ℃； B1～B5分別為CL3042在不同的溫度下的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，B1-36 ℃；B2-38 ℃；B3-40 ℃；B4-44 ℃；B5-48 ℃； A6、B6為空白對照組
反應(yīng)時間優(yōu)化實驗的結(jié)果如圖3所示，反應(yīng)時間低于12 min會反應(yīng)不完全導(dǎo)致顯色不明顯，超過16 min會出現(xiàn)假陽性，故實驗最佳時間確定為14 min。
圖3 不同培養(yǎng)時間下的實驗結(jié)果Fig.3 Results of different incubation time注：A1～A5分別為CL3036在不同的反應(yīng)時間下RPA-LFD 實驗結(jié)果圖，A1-8 min，A2-10 min，A3-12 min， A4-14 min，A5-16 min，A6-空白對照組；B1～B5分別 為CL3042在不同的反應(yīng)時間下進行的RPA-LFD實驗結(jié) 果圖，B1-8 min，B2-10 min，B3-12 min，B4-14 min， B5-16 min，B6-空白對照組
2.3 RPA-LFD特異性實驗
對CL3036～CL3039大西洋鱈魚、CL3040狹鱈魚、CL3041南極犬牙魚、CL3042異鱗蛇鯖、CL3043馬舌鰈等8種水產(chǎn)品以及滅菌去離子水作為空白對照進行RPA-LFD擴增檢測(圖4)。結(jié)果表明，CL3036～CL3039出現(xiàn)陽性反應(yīng)，其他樣品均為陰性，檢測結(jié)果與PCR擴增測序結(jié)果一致，證明本研究建立的大西洋鱈魚RPA-LFD檢測方法特異性良好。
圖4 引物探針的特異性檢測結(jié)果Fig.4 Results of specific test of primer and probe注：1～4-大西洋鱈魚；5-狹鱈魚；6-南極犬牙魚； 7-異鱗蛇鯖；8-馬舌鰈；9-滅菌去離子水
2.4 現(xiàn)場實時檢測市售“鱈魚”制品結(jié)果
對20份市售帶有“鱈”字的水產(chǎn)品進行RPA-LFD現(xiàn)場快速檢測，鑒定其是否為大西洋鱈魚。檢測樣品中15份為大西洋鱈魚，剩余5份非大西洋鱈魚制品。隨后將20份樣品按序編號，利用PCR擴增進行一代測序鑒定其物種。RPA-LFD檢測結(jié)果與測序結(jié)果一致，見表4。
表4 野外實時檢測市售“鱈魚”類及其他魚類制品Table 4 Real-time testing on “cod” and other fish products sold in the market in the field
3 討論
近年來，曾多次出現(xiàn)過將“油魚”棘鱗蛇鯖和異鱗蛇鯖冠以“大西洋鱈魚”的名字販賣，消費者購買假鱈魚食用后，發(fā)生腹瀉的事件時有發(fā)生[18-19]。林霖等[20]利用SN/T 3589.7—2013對常見的鱈魚制品進行檢測，發(fā)現(xiàn)該技術(shù)由于需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線容易出現(xiàn)假陽性，并且無法應(yīng)用于抽取的全部鱈魚制品，反應(yīng)過程也需要PCR儀等高精密儀器無法做到現(xiàn)場實時快速檢測。此外，李新光等[21]、王敏等[22]應(yīng)用DNA條形碼技術(shù)，對市場上隨機抽取的鱈魚制品進行檢測，結(jié)果顯示該方法可以檢測出眾多鱈魚品種，如大西洋鱈魚、格陵蘭鱈魚(Gadusogac)、狹鱈、綠青鱈(Pollachiusvirens)等。該方法具有檢測范圍廣、操作簡單、鑒定效率高等優(yōu)點，但存在混合制品獲得單一的DNA條形碼片段難度大，檢驗操作復(fù)雜，結(jié)果分析難等缺點。SAULL等[23]基于大西洋鱈魚的cytb基因設(shè)計出4對LAMP引物,在63 ℃下恒溫擴增60 min，檢測出大西洋鱈魚。該方法特異性強、靈敏度高但是檢驗所需的引物設(shè)計難度大，反應(yīng)時間較長，應(yīng)用于鱈魚制品的現(xiàn)場快速檢測存在一定難度[24]。所以目前已有的檢測方法由于需要大型精密實驗儀器，實驗操作復(fù)雜或?qū)嶒灜h(huán)境要求高，反應(yīng)時間長等原因均無法在現(xiàn)場完成對大西洋鱈魚的實時檢測。
而RPA技術(shù)作為新型核酸擴增技術(shù)，具有靈敏性強、效率高、成本低、易操作等特點。研究人員只需要根據(jù)目標(biāo)物種的核酸序列設(shè)計并合成RPA上、下游引物及探針，就可以利用RPA試劑盒進行RPA反應(yīng)。本文所提出的RPA-LFD實驗方法，是將RPA技術(shù)與側(cè)流層析試紙條技術(shù)相結(jié)合，做到了在短時間內(nèi)結(jié)果可視，不需要PCR儀等精密儀器，在控溫式保溫杯內(nèi)即可完成擴增反應(yīng)，具有靈敏性強、特異性高、易操作、能夠現(xiàn)場快速檢測等優(yōu)點[25-26]。RPA試驗的關(guān)鍵節(jié)點為設(shè)計高特異性的引物和探針，大多數(shù)常用的PCR引物、探針不適合用于RPA反應(yīng)體系。目前，獲得一對“好”引物的具體規(guī)則還未完全明確，也沒有專門的設(shè)計軟件可供使用，因此通過試驗來篩選最佳引物是不可缺少的環(huán)節(jié)。本試驗結(jié)果表明溫度和反應(yīng)時間也是重要的試驗條件，溫度過高、過低，或者反應(yīng)時間過長、過短均可能對整個實驗造成根本性的影響，因此，也需要對反應(yīng)條件和體系進行優(yōu)化，以達(dá)到最好的檢測效果。
4 結(jié)論
綜上，本研究所建立的大西洋鱈魚RPA-LFD方法可以準(zhǔn)確、高效地檢測出大西洋鱈魚的真?zhèn)?。該方法為大西洋鱈魚的現(xiàn)場快速檢測提供了科學(xué)依據(jù)，具有良好的應(yīng)用前景，為其他水產(chǎn)品現(xiàn)場快速檢測提供了新思路。RPA-LFD技術(shù)填補了傳統(tǒng)檢測技術(shù)依賴精密實驗儀器、無法完成現(xiàn)場快速檢測的技術(shù)空缺，在現(xiàn)場快速檢測和低資源環(huán)境檢測領(lǐng)域存在巨大優(yōu)勢。但RPA技術(shù)存在引物和探針設(shè)計難度大，沒有專門的設(shè)計軟件，實驗條件需要人為優(yōu)化等局限。這需要科研人員的共同努力，不斷完善RPA研究體系，為快檢領(lǐng)域提供技術(shù)支持。未來RPA技術(shù)在突發(fā)疾病病原檢測、食品質(zhì)量安全檢測、低資源環(huán)境檢測領(lǐng)域會有新的突破，將會得到廣泛的應(yīng)用和推廣。
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